Oxyde de graphène fonctionnalisé à la taurine pour l'administration de 5-fluorouracile : fabrication, caractérisation et efficacité anticancéreuse

Résumé

Récemment, les systèmes nanovecteurs pour médicaments anticancéreux, notamment les systèmes de libération basés sur l'oxyde de graphène (GO), sont devenus une aubaine pour les patients atteints de cancer. Dans cette étude, nous choisissons la taurine (Tau) pour fonctionnaliser la surface du GO afin d'améliorer sa biocompatibilité. Premièrement, du GO à l'échelle nanométrique a été synthétisé par la méthode de Hummer modifiée et la méthode de décollement ultrasonique. Le vecteur d'oxyde de graphène modifié à la taurine (Tau-GO) a été synthétisé par méthode chimique pour obtenir un Tau-GO avec une bonne dispersibilité et stabilité dans l'eau, avec un potentiel zêta de -38,8 mV et une taille de particule de 242 nm. Selon les critères d'évaluation de l'efficacité d'encapsulation, la formulation optimale a été déterminée pour combiner Tau-GO et 5-FU par liaison non covalente. Le 5-FU-Tau-GO était plus stable en environnement neutre qu'acide, avec un certain effet de réponse au pH et de libération soutenue. In vivo, nous avons comparé les administrations orale et intraveineuse de 5-FU et 5-FU-Tau-GO, respectivement, par tests pharmacocinétiques et paramètres associés, montrant que l'administration orale ou intraveineuse de 5-FU-Tau-GO prolonge le temps d'action du 5-FU dans l'organisme et améliore sa biodisponibilité. De plus, l'inhibition des cellules HepG2 mesurée par le test MTT a montré que la valeur IC₅₀ du 5-FU était de 196 ± 8,73 μg/mL, et celle du 5-FU-Tau-GO de 65,2 ± 0,7 μg/mL, indiquant que le 5-FU-Tau-GO est plus puissant contre les cellules HepG2 et a un effet inhibiteur plus fort sur les cellules cancéreuses. L'effet sur la morphologie cellulaire mesuré par coloration AO/EB a également montré que le 5-FU-Tau-GO non seulement perturbait les cellules, mais induisait également significativement l'apoptose par rapport au 5-FU. Nous avons également vérifié par conception assistée par ordinateur que le Tau-GO se lie mieux au 5-FU que le GO non modifié, et que le système 5-FU-Tau-GO formé est plus stable, favorisant le transfert et la libération du 5-FU in vivo.

Introduction

La chimiothérapie reste une méthode courante pour le traitement de divers cancers. Un obstacle majeur de la plupart des agents chimiothérapeutiques est leur incapacité à pénétrer les tissus tumoraux à des concentrations efficaces, ou leurs effets secondaires indésirables sur les tissus normaux. Par conséquent, les scientifiques ont concentré leurs efforts sur le développement d'un système de libération de médicament puissant capable d'atteindre un taux de libération contrôlé dans les tissus tumoraux pour assurer une administration et une thérapie efficaces.

De nombreux nanomatériaux, incluant liposomes, polymères, nanoparticules, dendrimères, micelles et oxyde de graphène, ont été développés pour l'administration de divers médicaments. Parmi ces nanomatériaux, l'oxyde de graphène (GO) est un nouveau nanomatériau carboné exfolié chimiquement à partir de graphite oxydé et présentant plusieurs propriétés physico-chimiques fascinantes : groupes fonctionnels abondants, grande surface spécifique, grande capacité de chargement de médicament et excellente capacité de dispersion dans l'eau. De plus, la plupart des résultats expérimentaux in vitro ont montré qu'une faible concentration de GO pouvait servir de substrat pour la croissance cellulaire et activer les cellules immunitaires. Par conséquent, le GO a été largement utilisé dans le diagnostic des maladies, l'imagerie et le suivi des cellules cancéreuses, la thérapie photothermique anticancéreuse, l'ingénierie tissulaire, la libération ciblée de médicaments, et surtout comme vecteur de médicaments antitumoraux. Cependant, plusieurs groupes de recherche ont rapporté qu'une concentration élevée de GO a des effets cytotoxiques évidents dans des études précliniques et cliniques. Le mécanisme par lequel le GO produit des effets toxiques in vivo passe par le stress oxydatif et la surproduction d'espèces réactives de l'oxygène intracellulaires, induisant l'apoptose cellulaire et causant inflammation sévère, œdème pulmonaire et formation de granulomes. Il est donc d'une importance critique de résoudre le problème de toxicité du GO.

Selon les rapports, la fonctionnalisation par liaisons covalentes ou non covalentes peut réduire la forte interaction hydrophobe entre le GO et les cellules. Cela a été démontré par plusieurs études montrant que la fonctionnalisation du GO améliore sa biocompatibilité et élimine presque sa toxicité in vivo et in vitro. Yang et al. ont étudié, pour la première fois, la biodistribution à long terme du PEG-GO conjugué covalent chez la souris par une méthode de radiomarquage, montrant que le PEG-GO pouvait être excrété progressivement, probablement dans l'urine et les fèces. Zhang et al. ont comparé le GO fonctionnalisé DEX avec le GO et ont trouvé que le GO-DEX pouvait réduire remarquablement la toxicité cellulaire et être majoritairement éliminé des souris en une semaine. De plus, la liaison non covalente du GO au pluronic F127 résulte en une solubilité et stabilité bénignes en conditions physiologiques, et une faible toxicité. Bien que plusieurs polymères ou molécules aient été utilisés pour fonctionnaliser le GO, des résultats significatifs ont été obtenus. Cependant, des efforts sont encore nécessaires pour développer des méthodes simples permettant de construire un bon vecteur de médicaments à base de GO biocompatible.

La taurine (Tau) est un acide aminé semi-essentiel avec une bonne stabilité et solubilité dans l'eau. La Tau peut prévenir les maladies cardiovasculaires et cérébrovasculaires, maintenir la fonction visuelle, protéger les cellules et réguler l'immunité. De nombreuses études ont proposé que la Tau a des propriétés antitumorales par sa régulation à la hausse ou à la baisse de facteurs d'expression jouant des rôles importants dans divers cancers, incluant poumon, estomac, colorectal et sein. Ainsi, le GO fonctionnalisé à la Tau peut exercer un rôle supérieur comme vecteur de médicaments antitumoraux. Dans cet article, nous avons utilisé, pour la première fois, le GO fonctionnalisé covalent à la Tau comme nanovecteur et évalué sa cytotoxicité in vitro. De plus, le 5-fluorouracile (5-FU) a été utilisé comme médicament anticancéreux chargé non covalentement à la surface du Tau-GO pour construire un système de libération de médicament. Le 5-FU-Tau-GO pourrait non seulement réduire les effets secondaires sur les tissus normaux mais aussi améliorer la biodisponibilité du médicament. Par conséquent, le Tau-GO a été développé avec succès comme un nouveau nanomatériau à base de GO qui pourrait avoir des applications biomédicales significatives à l'avenir.

Expériences et Méthodes

Matériaux

La poudre de graphite, le tampon phosphate salin (PBS) et le diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été achetés chez Tianjin Laibo Chemical Co., Ltd. ; Le carbodiimide (EDC), l'hydroxysuccinimide (NHS), l'acide chlorhydrique (HCl) et le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂ 30%) ont été achetés chez Shandong Yuwang Industrial Co., Ltd. ; La taurine (Tau), le 5-fluorouracile (5-FU), les cellules d'hépatome humain (HepG2), la solution pénicilline-streptomycine et le sérum fœtal bovin (FBS) ont été achetés chez Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. ; L'acide sulfurique (H₂SO₄ 98%) et le permanganate de potassium (KMnO₄) ont été achetés chez Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd. ; Le nitrate de sodium (NaNO₃) et le dodécylsulfate de sodium (SDS-Na) ont été achetés chez Shanghai Jinjinle Industrial Co., Ltd. ; Le MTT a été acheté chez Sigma-Aldrich, Inc ; Le DMEM a été acheté chez HyClone, Inc ; Les rats ont été achetés au Centre d'Animaux Expérimentaux Benxi Changsheng. Tous les autres réactifs et chimiques étaient de grade analytique et commercialement disponibles.

Synthèse du GO

Le GO a été préparé à partir de poudre de graphite selon une méthode de Hummer modifiée. Premièrement, 168 mL d'acide sulfurique 98% ont été ajoutés le long de la paroi d'un ballon à trois cols placé dans un bain de glace avec thermomètre, et 5 g de graphite et 4 g de nitrate de sodium ont été ajoutés lorsque la température a atteint 5 °C. Ensuite, 22,5 g de permanganate de potassium ont été ajoutés lentement par lots pendant 1 h en maintenant la température en dessous de 5 °C. Après cela, le ballon a été transféré dans un bain d'huile et le mélange obtenu a réagi à 35 °C pendant 30 min, puis la température a été augmentée à 65 °C et la réaction agitée pendant 30 min. Ensuite, la température a été augmentée à 85 °C et le mélange a réagi pendant 1 h supplémentaire pour obtenir une pâte brun-violet. Ce mélange a été laissé reposer à température ambiante pendant 1 semaine, transféré dans un bécher avec 700 mL d'eau chaude, et le peroxyde d'hydrogène 30% a été ajouté goutte à goutte jusqu'à ce qu'il devienne jaune-brun. Le mélange a été centrifugé à 10 000 tr/min, lavé à l'eau chaude, et ce processus a été répété plusieurs fois jusqu'à ce que le pH du surnageant soit 7,0. Finalement, le produit a été séché dans un lyophilisateur sous vide et le nano GO a été obtenu.

Synthèse du Tau-GO

50 mg de GO pesés avec précision ont été dissous dans 50 mL d'eau distillée, et 150 mg d'EDC et 100 mg de NHS ont été ajoutés pour activer le GO par ultrasons dans un bain d'eau glacée pendant 20 min. Ensuite, 10 mL de solution aqueuse de Tau (0,1 g/mL) ont été ajoutés lentement (goutte à goutte) dans la solution aqueuse de GO préparée, et le pH a été ajusté à 6-7 par HCl et agité continuellement pendant 24 h à température ambiante dans l'obscurité. Le produit a été collecté par centrifugation à 5000 tr/min pendant 10 min et lavé 3 fois à l'eau distillée. Le Tau-GO a été collecté après lyophilisation.

Chargement du 5-FU

20 mL de solution de Tau-GO ont été ultrasons pendant 2 h. Une quantité pesée avec précision de 5-FU a été dissoute dans une quantité appropriée d'eau distillée, et ajoutée lentement goutte à goutte à la solution de Tau-GO préparée sous agitation à température ambiante, puis soniquée à 30 °C dans l'obscurité pendant 1,5 h. Les produits ont été centrifugés à 5000 tr/min pendant 10 min à 4 °C. Le sédiment inférieur a été lavé avec 20 mL d'eau distillée et centrifugé (5000 tr/min pendant 10 min à 4 °C), et le processus a été répété 3 fois. La couche inférieure a été lyophilisée, le surnageant placé dans un bécher, le volume pesé, la concentration de 5-FU déterminée par HPLC 1200 (Agilent, USA). Les conditions de détection étaient : colonne chromatographique C18 (4,6 × 250 nm, 5 μm) ; température de colonne 25 °C ; phase mobile : solution 0,1% KH₂PO₄ avec pH 5,5 ; débit 1,0 mL/min ; volume d'injection 20 μL ; longueur d'onde de mesure 265 nm. Le ratio d'encapsulation (EE) et l'efficacité de chargement du médicament (LE) ont été obtenus par les formules : EE(%) = (M₁ - C₁ × L₁) / M₁ × 100% ; LE(%) = (M₁ - C₁ × L₁) / (20C₀ + M₁ - C₁ × L₁) × 100%. La dose totale de 5-FU était notée M₁, la concentration et le volume de 5-FU libre notés C₁ et L₁, et la concentration du vecteur notée C₀.

Caractérisation

Pour caractériser le nanocomposite préparé, les spectres FT-IR ont été scannés de 4000 à 400 cm⁻¹ sur le spectromètre IRAffinity-1 (Shimadzu, Japon) pour confirmer les interactions. Les spectres d'absorption UV-vis ont été enregistrés sur un spectrophotomètre UV-3600 (Shimadzu, Japon). Les échantillons ont été dissous dans l'eau distillée et les tailles de particules, potentiels zêta et valeurs PDI ont été obtenus sur un instrument Nano-ZS 90 Nano (Malvern, UK). Les morphologies des échantillons ont été analysées par microscopie électronique à transmission JEM-2100 (JEOL, Japon). Les analyses thermogravimétriques (TGA) ont été réalisées sur un analyseur thermogravimétrique (NETZSCH, Allemagne) à un taux de chauffe de 10 °C/min de 0 à 800 °C sous atmosphère d'azote. La mesure XRD des échantillons a été effectuée par diffractomètre à rayons X (Bruker, Allemagne) avec rayonnement CuKα (λ = 1,5406 Å) en grand angle avec angle 2θ. Les mesures XPS ont été effectuées avec une sonde Omicron ESCA avec un rayonnement Al Kα monochromaté (Thermo, Amérique).

Libération In Vitro du Médicament

La libération in vitro du médicament a été réalisée à pH 1,2 (environnement gastrique simulé), pH 6,5 (environnement cellule cancéreuse du foie simulé) et pH 7,4 (environnement physiologique simulé) à 37 °C (température corporelle simulée). En bref, 15 mg de 5-FU-Tau-GO ont été placés dans une membrane de dialyse, immergés dans 50 mL de solutions tampon contenant 0,1% SDS-Na aux pH 1,2, 6,5 et 7,4. Tous les échantillons ont été placés dans un bain d'eau à agitation continue à 100 tr/min et 37 °C. À des points de temps prédéterminés (0 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h et 72 h), 1 mL de chaque échantillon a été prélevé et remplacé par 1 mL de solution tampon fraîche contenant 0,1% SDS-Na pour maintenir le même volume de milieu de libération. Le milieu libéré a été centrifugé et analysé par HPLC 1200.

Études de Cytotoxicité In Vitro

Test MTT

Le test MTT a été utilisé pour évaluer la cytotoxicité du 5-FU, Tau-GO et 5-FU-Tau-GO. Brièvement, les cellules d'hépatome humain HepG2 ont été cultivées en milieu DEME, supplémenté avec 10% FBS et 1% antibiotiques (solution pénicilline-streptomycine) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% CO₂. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 5 × 10³ cellules par puits contenant 100 μL de milieu DEME supplémenté avec FBS et antibiotiques. La plaque a été placée pendant 24 h dans une chambre humidifiée à 37 °C contenant 5% CO₂. Ensuite, le milieu de culture a été retiré et remplacé par 100 μL de milieu frais contenant diverses concentrations (5, 10, 20, 40, 60, 80 et 100 μg/ml) de 5-FU, Tau-GO, 5-FU-Tau-GO respectivement. Après 24 h d'incubation, les cellules ont été traitées avec 20 μL de solution MTT et incubées 4 h supplémentaires. Ensuite, le milieu a été aspiré, et les cristaux de formazan dissous dans 150 μL de DMSO. Finalement, les plaques ont été agitées à 37 °C pendant 15 min dans un oscillateur à température constante. La densité optique (DO) de chaque échantillon a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de plaques. Les expériences ont été réalisées en triplicata. Le taux d'inhibition cellulaire a été calculé à partir des résultats : Taux d'inhibition = (OD_contrôle - OD_traitement) / OD_contrôle × 100% où OD_contrôle est l'absorbance des cellules témoins non traitées, OD_traitement celle des cellules traitées.

Test de Coloration AO/EB

La double coloration AO/EB a été utilisée pour évaluer les changements morphologiques des cellules traitées avec 5-FU, Tau-GO et 5-FU-Tau-GO. Brièvement, les cellules HepG2 en phase de croissance logarithmique ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits à une densité de 10 000 cellules par puits et cultivées dans un incubateur à 37 °C sous atmosphère 5% CO₂. Après 24 h, les cellules ont été traitées avec une concentration fixe de 5-FU, Tau-GO ou 5-FU-Tau-GO, et incubées 24 h supplémentaires. Le milieu de chaque puits a été retiré et les cellules lavées deux fois au PBS. Ensuite, 1 mL PBS supplémenté avec 40 μL de colorants fluorescents (1 mg/mL AO et 1 mg/mL EB mélangés au ratio 1:1) ont été ajoutés à chaque puits et incubés 10 min sans lumière. Les cellules colorées ont été observées au microscope à fluorescence et des images prises aléatoirement.

Étude Pharmacocinétique

Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux politiques et principes du Comité de Protection et d'Éthique Animale. 24 rats mâles SD, poids 230-270 g, ont été mis à jeun 12 h et divisés aléatoirement en 4 groupes avant administration. Les groupes A et B ont reçu par injection intraveineuse les solutions de 5-FU et 5-FU-Tau-GO, et les groupes C et D ont reçu par voie orale les solutions de 5-FU et 5-FU-Tau-GO respectivement. Tous les groupes ont reçu une dose de 20 mg/kg. Après administration, des échantillons de sang (~0,5 mL) ont été prélevés dans des tubes anticoagulants à des points de temps donnés (15 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 16 h, 24 h, 48 h). Les échantillons de plasma ont été séparés par centrifugation à 7500 tr/min et 4 °C pendant 10 min. Ensuite, 200 μL plasma et 50 mg (NH₄)₂SO₄ ont été combinés dans un tube (10 μL de solution standard interne 5-BrU 40 μg/mL, séchés à l'azote dans un bain d'eau à 40 °C, vortexés 5 min et centrifugés à 10800 tr/min pendant 3 min. Ensuite, le tube a reçu 900 μL de solution acétate d'éthyle/isopropanol (85:15, v/v), vortexé 3 min et centrifugé à 10800 tr/min pendant 15 min. Le surnageant a été retiré et séché à l'azote, 100 μL de phase mobile ajoutés et le tube vortexé 1 min. Finalement, la solution résultante collectée du surnageant a été mesurée par HPLC 1200.

Simulation de Dynamique Moléculaire

La simulation de dynamique moléculaire est principalement utilisée pour analyser la force d'interaction entre le médicament et le vecteur et le comportement de diffusion du médicament. La structure chimique du 5-FU a été construite avec Chemdraw de Chem Office 2014, et les structures du Tau-GO et GO ont été conduites dans le module Polymer and Molecule Builders en utilisant le logiciel de simulation moléculaire Materials Studio (version 7.0, Accelrys Inc., USA). Tous les composés construits ont été optimisés géométriquement sous le champ de force COMPASS II, et la conformation à l'énergie la plus basse a été sélectionnée comme conformation stable. Une équilibration NVT de 10 ps a été conduite pour chaque système. La simulation a été réalisée avec 100 ps MD pour obtenir une structure équilibrée à 298 K et 101,325 kPa avec un pas de 1 fs. Finalement, le déplacement quadratique moyen (MSD) et la densité d'énergie cohésive (CED) ont été obtenus pour chaque système, et le coefficient de diffusion (D) donné par : D = 1/(2d) lim_{τ→∞} d/dτ [r(t) - r(0)]² où d est la dimension du système, r(t) et r(0) sont les vecteurs de position de la molécule de médicament aux temps t et 0, et [r(t) - r(0)]² représente le MSD.

Résultats et Discussion

Caractérisation

Le conjugué Tau-GO a été fabriqué par une liaison amide du GO et de la Tau. La synthèse réussie du nanocomposite a été validée par les spectres FT-IR (Fig. 1). La présence des fonctionnalités oxygénées sur le GO a été confirmée par les pics d'absorption à -OH (~ 3405 cm⁻¹), C=O (1723 cm⁻¹), C=C (1628 cm⁻¹) et C-OH (1391 cm⁻¹). Ces résultats prouvent la préparation réussie du GO (Fig. 1a). En plus de certains pics caractéristiques du GO, les nouveaux pics à 1638 cm⁻¹ et 3427 cm⁻¹ correspondent au groupe amide, et ceux à 1164 cm⁻¹ et 1085 cm⁻¹ correspondent à -SO. Le spectre Tau-GO indique clairement que la Tau a été fonctionnalisée sur la surface du GO (Fig. 1b). En Fig. 2b, le pic caractéristique de -SO₃ à 1164 cm⁻¹ était masqué par l'action de liaison hydrogène et n'était pas visible dans les spectres FT-IR. Par conséquent, le 5-FU a été chargé avec succès sur le Tau-GO.

Spectres FT-IR du GO (a) et Tau-GO (b)

Spectres FT-IR du Tau-GO (a) et 5-FU-Tau-GO (b)

Les spectres d'absorption UV-Vis du GO sont montrés en Fig. 3. Le pic d'absorption évident à 234 nm est attribué à la transition π-π* des liaisons C=C du graphène. De plus, l'épaule à 300 nm est attribuée à la transition n-π* des liaisons C=O de l'oxyde de graphène sur le groupe carboxyle ou carbonyle. Ces deux pics d'absorption caractéristiques prouvent la préparation réussie du GO.

Spectres UV du GO

Les tailles du GO, Tau-GO et 5-FU-Tau-GO sont montrées en Fig. 4. Les potentiels zêta sont montrés en Fig. 5. La taille des feuillets de GO était d'environ 221 nm et la valeur PDI d'environ 0,188, indiquant que le GO préparé a une distribution uniforme et une bonne stabilité. Le potentiel zêta était d'environ -33,3 mV, indiquant que la charge négative est principalement due à la présence de nombreux groupes contenant de l'oxygène en surface. Lorsque le GO a été modifié avec la Tau via liaison amide, les groupes amino ont remplacé certains groupes carboxyle et le -SO₃ avait une capacité d'ionisation plus forte en solution, le potentiel zêta a diminué pour devenir -38,8 mV. La taille et les valeurs PDI du Tau-GO étaient d'environ 242 nm et 0,190. Ensuite, le 5-FU a été chargé sur le Tau-GO par liaison non covalente. Le potentiel zêta était d'environ -26,7 mV et la valeur absolue supérieure à 20 mV. De plus, la taille et les valeurs PDI du 5-FU-Tau-GO étaient d'environ 264 nm et 0,182, indiquant que la répulsion électrostatique entre particules est grande, ce qui n'entraîne pas facilement d'agrégation ou de précipitation, et que la Tau a une bonne solubilité dans l'eau, le GO ayant aussi une bonne solubilité car sa surface est modifiée par des groupes fonctionnels contenant de l'oxygène. L'utilisation du vecteur Tau-GO pour charger le 5-FU améliore significativement la solubilité dans l'eau du 5-FU, de sorte que le 5-FU-Tau-GO peut être dispersé de façon stable en solution aqueuse.

Taille des particules du GO (a), Tau-GO (b) et 5-FU-Tau-GO (c)

Potentiels zêta du GO (a), Tau-GO (b) et 5-FU-Tau-GO (c)

Les morphologies du GO, Tau-GO et 5-FU-Tau-GO ont été caractérisées par MET (Fig. 6). Le GO est une structure plate avec des plis en surface, illustrant qu'il s'agit d'une structure bidimensionnelle plane (Fig. 6a). Comparé au GO, la taille du Tau-GO était légèrement augmentée, mais montrait toujours une structure lamellaire (Fig. 6b). L'image du 5-FU-Tau-GO montrait que les matériaux ne s'aggloméraient pas ou ne changeaient pas, la structure lamellaire initiale du GO restant intacte (Fig. 6c). Par conséquent, le Tau-GO et le 5-FU-Tau-GO avaient une bonne stabilité.

MET du GO (a), Tau-GO (b) et 5-FU-Tau-GO (c)

L'analyse thermogravimétrique a été utilisée pour quantifier les compositions des composites. Les courbes TGA du GO et Tau-GO sont montrées en Fig. 7. Le GO et le Tau-GO ont des masses résiduelles de 39,73% et 34,22% dans une atmosphère d'azote à 800 °C. En comparant les valeurs de changement de poids, la teneur en Tau dans le Tau-GO a été déterminée à environ 13%.

TGA du GO et Tau-GO

Les diagrammes XRD de la Tau, GO et Tau-GO sont montrés en Fig. 8. Le pic caractéristique du GO peut être observé à 10,7° de la valeur 2θ, confirmant la formation du GO avec oxydation complète pour un fort processus d'oxydation chimique et d'exfoliation. Après fonctionnalisation avec la Tau sur la surface du GO, le motif de diffraction du pic diminue légèrement à la valeur 2θ 8,2. Cela signifie que le GO a été fonctionnalisé avec succès par la Tau.

Diagrammes XRD de la Tau, Tau-GO et GO

Les spectres XPS C1s du GO et Tau-GO sont montrés en Fig. 9. Les spectres XPS C1s du GO indiquent un degré considérable d'oxydation, avec la présence de quatre atomes de carbone correspondant à différents groupes fonctionnels. Les spectres XPS C1s du Tau-GO présentent aussi ces mêmes atomes de carbone. De plus, l'apparition de pics de composants liés à la liaison C-N étaient attribués aux groupes amino, amides. Ces résultats indiquent aussi que le GO est fonctionnalisé avec succès par la Tau.

Motifs XPS C1s du GO et Tau-GO

Comportements de Chargement et Libération du Médicament

Le 5-FU a été adsorbé sur le nanovecteur Tau-GO par interactions non covalentes. La courbe d'étalonnage du 5-FU était y = 62,135x + 21,873 (r = 0,9999), et la gamme de 6,5 ~ 250 μg/mL. Le ratio d'encapsulation (EE) et l'efficacité de chargement (LE) ont été déterminés par les concentrations de médicament non lié pour évaluer la performance de chargement. Les résultats ont montré que l'EE augmentait avec l'augmentation de la concentration du médicament, et la valeur maximale d'EE était 83,2%. Selon la formule, le LE était de 33,7%, soit 508,52 μg de 5-FU peuvent être adsorbés sur 1 mg de Tau-GO. Par conséquent, le Tau-GO est un vecteur de médicament prometteur pouvant atteindre une grande charge. Les mécanismes possibles de la haute capacité de chargement du 5-FU sur le Tau-GO peuvent être résumés ainsi : premièrement, la Tau est utilisée pour fonctionnaliser le GO et introduire des groupes fonctionnels actifs (-SO₃). Le -SO₃ a une forte capacité d'ionisation en solution, ce qui réduit l'agglomération entre GO et facilite le chargement du 5-FU dans le Tau-GO. Deuxièmement, le potentiel zêta du 5-FU-Tau-GO diffère de 12,1 mV de celui du Tau-GO, indiquant que le 5-FU est chargé sur la surface du Tau-GO, et l'interaction électrostatique joue un rôle important dans le chargement du 5-FU. Enfin, il existe de nombreuses formes de liaisons hydrogène entre le 5-FU et le vecteur Tau-GO, incluant -COOH dans Tau-GO et -NH- dans 5-FU, -COOH dans Tau-GO et C=O dans 5-FU, -OH dans Tau-GO et -NH- dans 5-FU, -OH dans Tau-GO et -C=O dans 5-FU, -COOH et 5-FU dans Tau-GO -F dans Tau-GO, -COOH dans Tau-GO et -F dans 5-FU. Ces liaisons hydrogène rendent le 5-FU-Tau-GO stable en solution.

La libération cumulative in vitro du 5-FU depuis le 5-FU-Tau-GO, à 37 °C en solution PBS pH 1,2, 6,5 et 7,4 (simulant environnement gastrique, environnement cellule cancéreuse du foie et environnement physiologique respectivement) est montrée en Fig. 10. Il apparaît que le comportement de libération du 5-FU était affecté par la valeur de pH de l'environnement. Dans un tampon pH 7,4, la libération du médicament était lente et continue, et la quantité totale libérée était d'environ 70,84% après 72 h. En contraste, la quantité libérée à pH 7,4 était significativement plus faible qu'à pH 1,2 et pH 6,5 au même point de temps. La charge totale de médicament libérée du 5-FU-Tau-GO pouvait être atteinte à environ 90,29% et 85,75% aux pH 1,2 et 6,5 respectivement. Cela peut être attribué aux interactions π-π et liaisons hydrogène entre 5-FU et Tau-GO. Plus la valeur de pH est basse, plus le degré de protonation de la liaison hydrogène est élevé. Par conséquent, la force de la liaison hydrogène était contrôlée par la valeur de pH, ce qui a conduit à la libération du 5-FU. Ce système de libération de médicament sensible au pH joue un rôle important dans les médicaments antitumoraux et peut atteindre la libération du médicament dans la cellule tumorale.

Courbes de libération in vitro du 5-FU-Tau-GO en salin phosphate à 37 °C

Études de Cytotoxicité In Vitro

Pour évaluer la toxicité potentielle et l'efficacité thérapeutique antitumorale du nanovecteur, la viabilité cellulaire in vitro a été réalisée sur cellules HepG2 par tests MTT (Fig. 11). Le Tau-GO n'a pas montré de cytotoxicité significative à différentes concentrations. Après chargement du 5-FU, le 5-FU-Tau-GO a montré un effet d'inhibition évident, de manière dose-dépendante, donc le nanovecteur avait la capacité d'administrer des médicaments antitumoraux. La valeur IC₅₀ du 5-FU-Tau-GO était de 65,2 ± 0,7 μg/mL, plus toxique que le 5-FU libre (196 ± 8,73 μg/mL). Cela peut être dû à la capacité de la taurine à induire l'apoptose dans les cellules tumorales, renforçant ainsi indirectement l'effet inhibiteur du 5-FU sur les cellules. De plus, on peut voir de l'expérience de libération in vitro que le 5-FU chargé sur le Tau-GO pouvait être libéré progressivement dans les cellules. Par conséquent, le temps d'action efficace du 5-FU-Tau-GO sur les cellules était plus long que celui du 5-FU libre, produisant ainsi une meilleure inhibition.

Viabilité de différentes concentrations de 5-FU, Tau-GO et 5-FU-Tau-GO

L'agent fluorescent AO pouvait émettre une fluorescence verte en traversant les membranes cellulaires intactes et en colorant les noyaux, tandis que l'EB ne marquait que le noyau des cellules endommagées émettant une fluorescence rouge/orange. Les cellules avec apoptose précoce et tardive présentaient des noyaux verdâtre-jaune ou orange avec la coloration AO/EB respectivement. Par conséquent, la coloration AO/EB a été réalisée pour investiguer si la mort cellulaire était associée à l'apoptose en utilisant les caractéristiques des changements morphologiques cellulaires. Les résultats de la coloration AO/EB sont présentés en Fig. 12. Les cellules témoins étaient en forme de fuseau avec noyaux verts. Dans le groupe cellulaire cultivé avec Tau-GO seul, de petites parties des noyaux étaient invaginées avec coloration vert foncé ou rouge-orange. Des cellules apoptotiques orange ou rouges significatives avec fragments de chromatine et corps apoptotiques étaient observées dans le groupe 5-FU seul. Comparé au 5-FU, le 5-FU-Tau-GO causait plus de dommages à la morphologie des cellules HepG2, non seulement en brisant les cellules, mais aussi en causant une grande quantité d'apoptose dans les cellules cancéreuses. Comme on peut le voir sur les images, presque toutes les cellules traitées avec 5-FU-Tau-GO avaient des changements morphologiques, un grand nombre de débris cellulaires et de corps apoptotiques, indiquant que le système nano-vecteur 5-FU-Tau-GO avait un bon effet destructeur sur les cellules HepG2.

Coloration AO/EB du témoin (a), Tau-GO (b), 5-FU (c) et 5-FU-Tau-GO (d)

Études Pharmacocinétiques

Les études pharmacocinétiques du 5-FU et 5-FU-Tau-GO ont été réalisées sur rats SD. Les profils de concentration de 5-FU dans le plasma vs temps, après administration orale, sont présentés en Fig. 13a. On a trouvé que la tendance des deux courbes était similaire, mais la concentration plasmatique de 5-FU provenant du nanovecteur 5-FU-Tau-GO était plus élevée que celle du 5-FU seul, observée à chaque point de temps mesuré. La Fig. 13b montre les profils de libération in vivo du 5-FU par injection dans la veine caudale. Le 5-FU-Tau-GO pouvait atteindre une libération soutenue du médicament sur 24 h, et la concentration diminuait progressivement dans les premières heures, indiquant que le 5-FU était libéré lentement.

Courbes pharmacocinétiques in vivo standard du 5-FU et 5-FU-Tau-GO par administration orale (a). Courbe pharmacocinétique in vivo standard du 5-FU et 5-FU-Tau-GO par injection intraveineuse (b)

Le modèle à deux compartiments a été utilisé pour analyser les paramètres pharmacocinétiques de l'administration orale ou intraveineuse chez les rats. Les paramètres pharmacocinétiques sont présentés dans le Tableau 1. Comparé au 5-FU, le 5-FU-Tau-GO montrait des T₁/₂β plus élevés de 2,3 fois par administration orale, et 3,0 fois par injection intraveineuse respectivement. De plus, l'aire sous la courbe concentration-temps (AUC₀₋ₜ) des nanocomplexes 5-FU-Tau-GO était environ 2,1 fois plus élevée par administration orale, et 2,8 fois plus élevée par injection intraveineuse comparée à celle de la solution de 5-FU. Par conséquent, nous concluons que le 5-FU-Tau-GO pouvait prolonger significativement le temps de rétention du 5-FU in vivo et améliorer la biodisponibilité. En outre, le T₁/₂β des nanocomplexes 5-FU-Tau-GO administrés par voie orale (1,67 ± 1,15 h) était plus long que celui de l'injection intraveineuse (1,33 ± 0,64 h) ; cependant, l'AUC₀₋ₜ de l'administration orale (36,02 ± 1,83 mg/L*h) était plus faible que celle de l'injection intraveineuse (96,50 ± 8,70 mg/L*h). Ces résultats pourraient être dus à deux aspects : d'une part, lors de l'injection intraveineuse, le médicament entre directement dans le système sanguin pour circulation sans passer par la barrière gastro-intestinale pour redistribution ; d'autre part, comme le 5-FU cause facilement certains dommages au système gastro-intestinal, cela peut aussi affecter l'utilisation efficace du médicament dans l'organisme.

Simulations MD

L'accostage et la dynamique moléculaire du GO non modifié, Tau-GO et 5-FU ont été simulés par accostage moléculaire et simulation de dynamique moléculaire. Les résultats d'accostage moléculaire du GO, Tau-GO et 5-FU sont montrés en Fig. 14, où l'on voit que les longueurs de liaison du 5-FU avec GO et Tau-GO sont 3,66 Å et 2,602 Å respectivement. De plus, d'après les résultats de calcul, les énergies de liaison du 5-FU au GO et Tau-GO étaient 47,69 kcal/mol et 25,04 kcal/mol respectivement. Cela indiquait que la force de liaison du Tau-GO et 5-FU était plus forte que celle du GO et 5-FU. Cela est dû aux atomes polaires de la Tau, tels que S et N, formant une liaison non covalente plus forte avec le 5-FU, rendant la force entre Tau-GO et 5-FU plus forte.

Accostage moléculaire des feuillets GO avec 5-FU (a). Accostage moléculaire du Tau-GO avec 5-FU (b)

Les diagrammes de la simulation de dynamique moléculaire du GO, Tau-GO et 5-FU sont montrés en Fig. 15. Selon les résultats de calcul, les CED du 5-FU-GO et 5-FU-Tau-GO étaient 2,67×10⁸ et 2,83×10⁸ respectivement. Ces résultats montraient une interaction plus forte entre le médicament et le Tau-GO. Les graphiques entre MSD et temps ont été tracés (Fig. 16) pour obtenir le coefficient de diffusion via MSD. Les coefficients de diffusion du médicament ont été obtenus par la pente divisée par 6 : 0,094 m²/s et 0,058 m²/s. Cela montre que la force entre Tau-GO et 5-FU est plus forte, cohérent avec les résultats de l'accostage moléculaire. Par conséquent, le GO fonctionnalisé rend le vecteur entier plus abondant en atomes et groupes ; par conséquent, la liaison non covalente avec le 5-FU est plus forte, et l'ensemble du système plus stable.

Instantanés du GO et 5-FU à la fin de la MD (a). Instantanés du Tau-GO et 5-FU à la fin de la MD (b)

Profils MSD du médicament pour GO et 5-FU (a), Tau-GO et 5-FU (b)

Conclusions

En résumé, nous avons préparé avec succès un nanocomposite Tau-GO par une méthode chimique simple. La fonctionnalisation du GO par la Tau a une bonne stabilité et améliore sa biocompatibilité. La structure unique et les propriétés brillantes des nanovecteurs Tau-GO offrent de grandes opportunités pour le chargement et la libération du 5-FU. Le 5-FU-Tau-GO a une capacité antitumorale potentielle et un excellent temps de circulation du médicament. Par conséquent, nous pensons que la modification du GO par le vecteur Tau pour le chargement du 5-FU est un outil efficace et applicable pour construire un système nano-vecteur 5-FU-Tau-GO pour l'administration de médicaments anticancéreux et la thérapie antitumorale.

Disponibilité des Données et Matériaux

Les jeux de données utilisés et/ou analysés pendant l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Abréviations

GO :

Oxyde de graphène

Tau :

Taurine

5-FU :

5-Fluorouracile

5-FU-Tau-GO :

Oxyde de graphène fonctionnalisé à la taurine chargeant 5-fluorouracile

EE :

Ratio d'encapsulation

LE :

Efficacité de chargement du médicament

FT-IR :

Infrarouge à transformée de Fourier

MET :

Microscopie électronique à transmission

TGA :

Analyses thermogravimétriques

MSD :

Déplacement quadratique moyen

CED :

Densité d'énergie cohésive