Effet antitumoral accru de la dacarbazine et l'acide rétinoïque tout-trans co-encapsulés dans des nanoparticules lipidiques pour le mélanome malin

Résumé

Le mélanome malin est un cancer de la peau hautement agressif responsable de 80 % de la mortalité, avec une survie médiane globale de seulement 6-9 mois pour les patients atteints de mélanome métastatique. Le traitement combiné par administration simultanée de deux médicaments dans un seul nanovecteur s'est révélé élégant et efficace contre le cancer. Ici, nous employons une thérapie combinée basée sur la dacarbazine (DBZ), médicament approuvé FDA pour le mélanome, et l'acide rétinoïque tout-trans (ATRA), agent anticancéreux prometteur, chargés sur des nanoformulations lipidiques (RD-LNF) comme nouvelle stratégie thérapeutique. Nous avons encapsulé avec succès les deux médicaments dans les nanoformulations lipidiques et démontré une libération contrôlée de la charge au fil du temps. Nous avons montré que la délivrance simultanée de DBZ et ATRA réduisait efficacement la prolifération cellulaire de manière dose-dépendante. Les nanoparticules combinées réduisaient significativement la capacité de formation de colonies des cellules de mélanome B16F10. L'analyse cytométrique montrait que RD-LNF induisait une plus grande proportion de cellules apoptotiques avec inhibition significative de la progression du cycle cellulaire et de la migration cellulaire. Ces résultats suggèrent le potentiel prometteur de RD-LNF dans le traitement du mélanome malin avec haute efficacité.

Introduction

Le mélanome malin est l'une des tumeurs agressives survenant principalement dans la peau humaine. Le mélanome représente 4 % de tous les cancers dermatologiques mais est responsable de 80 % de la mortalité par cancer de la peau, devenant une préoccupation croissante dans les pays sous-développés et en développement. Le mélanome a une forte tendance à métastaser vers diverses parties du corps : cerveau, cœur, poumons, en faisant l'une des formes les plus agressives de malignité. Si diagnostiqué aux stades précoces, l'excision chirurgicale est une option thérapeutique potentielle, mais ne garantit pas une guérison complète. De plus, la phase de croissance radiale devient résistante à la majorité des autres options : chimiothérapie et radiothérapie. Plus spécifiquement, les récepteurs peptidiques sont surexprimés à la surface du mélanome, en faisant une cible attrayante. Le sous-type 2 du récepteur à la somatostatine (SSTR2) est fortement exprimé dans les cellules de mélanome.

La dacarbazine (DBZ) ou diméthyl-triazène-imidazole carboxamide (DTIC), agent alkylant de l'ADN, est le premier et unique choix de chimiothérapie approuvé par la FDA. La DBZ est un fort agent alkylant tuant les cellules cancéreuses en ajoutant des groupes alkyl à l'ADN ou matériel nucléaire. Malgré son action puissante, la DBZ souffre de faible solubilité aqueuse et courte demi-vie (41 min) dans la circulation sanguine, diminuant son effet thérapeutique. De plus, un taux de réponse décevant entre 10 et 25 % a été observé avec moins de 5 % de guérison complète, indiquant la limitation de la monothérapie. Il y a donc un besoin urgent de développer une stratégie alternative pour améliorer l'efficacité du traitement par DBZ.

La co-délivrance de plusieurs agents thérapeutiques en administration unique s'est avérée plus efficace que les agents individuels. La co-délivrance dans un seul système vecteur confère activité synergique, propriétés pharmacocinétiques similaires et efficacité anticancéreuse plus élevée. L'acide rétinoïque tout-trans (ATRA) est un agent anticancéreux prometteur utilisé dans plusieurs cancers. L'ATRA exprime son efficacité en se liant aux récepteurs de l'acide rétinoïque dans le noyau des cellules cancéreuses, inhibant croissance, prolifération, différenciation, et mort cellulaire. Contrairement aux autres agents chimiothérapeutiques, l'ATRA n'entraîne pas d'effets indésirables comme cardiotoxicité ou hypoplasie moelleuse. L'ATRA a été rapporté pour améliorer l'efficacité anticancéreuse en combinaison avec un agent chimiothérapeutique approprié. Cependant, l'ATRA lipophile souffre aussi de faible solubilité aqueuse et clairance systémique rapide, nécessitant un système de délivrance stable.

Les systèmes de délivrance nanoparticulaires améliorent l'efficacité thérapeutique des thérapeutiques encapsulées en les libérant dans les tissus tumoraux cibles et évitant les effets hors-cible dans la circulation systémique via l'effet de perméabilité et rétention accrue (EPR). Les nanoparticules lipidiques solides (SLN) sont considérées comme alternatives à de nombreux vecteurs existants (liposomes, micelles) grâce à leurs caractéristiques : stabilité accrue, libération contrôlée, haute efficacité de chargement, facilité de préparation/mise à l'échelle. Un aspect important des SLN comme vecteur est le profil de sécurité des lipides : statut GRAS, bien tolérés, lipides physiologiques. L'incorporation stable des médicaments dans le noyau lipidique améliore la solubilité aqueuse, le profil pharmacocinétique et la stabilité physiologique en circulation systémique.

Dans cette étude, nous abordons une stratégie prometteuse de co-délivrance de DBZ et ATRA utilisant des nanoformulations lipidiques pour le traitement combiné des malignités mélanomateuses. La DBZ devrait se charger dans le noyau lipidique tandis que l'ATRA devrait faire partie de la structure nanoparticulaire. Nous avons étudié les propriétés physicochimiques, l'absorption cellulaire et la cytotoxicité in vitro des nanoparticules combinées. L'effet anticancéreux a été évalué par test d'apoptose, analyse du cycle cellulaire, formation de colonies et analyse de migration cellulaire.

Matériaux et méthodes

Préparation des nanoformulations lipidiques chargées DBZ/ATRA

Les nanoparticules lipidiques chargées en médicaments ont été préparées par méthode de sonication. Brièvement, 10 mg DBZ et 10 mg ATRA dissous dans 2 mL solution chloroforme contenant 50 mg phosphatidylcholine d'œuf (PC) et 2 mg DSME-méthyl(polyéthylène glycol)-2000 (mPEG₂₀₀₀). Solvant organique séché par exposition argon 20 min. Mélange séché médicament + lipide ajouté à 80 mg trimyristine (Tm) et incubé 65 °C 1 h. À ce mélange huileux, 5 mL solution poloxamer 4 % ajouté et immédiatement soniqué par sonde 80 W 6 min. Émulsion résultante refroidie à glace 30 min. Nanoparticules soumises à unité filtrante centrifuge Amicon Ultra 0,5 (coupe 3 kDa, Merck) à 12 000×g 20 min. Quantité DBZ et ATRA libre dans filtrat évaluée par HPLC, efficacité et capacité de chargement calculées. Système HPLC Waters : pompe binaire 1525, détecteur UV 2487, détecteur fluorescence 2475, chauffe-colonne 1500, colonne Symmetry C18. Pour ATRA : phase mobile acétonitrile/acide trifluoroacétique 90/10 v/v, débit 1 mL/min, détection 348 nm. Pour DBZ : acétonitrile/phosphate disodique 0,05 M 30/70 v/v avec 0,5 % TEA, pH 3,7, débit 1 mL/min.

Analyse taille et morphologie des particules

Distribution taille évaluée par Malvern Zetasizer Nano ZS90 laser He-Ne (633 nm). Échantillons dilués eau distillée, expériences 24 °C en triplicat. Morphologie évaluée par MET (JEOL JEM200CX 120 kV). Particules diluées colorées acide phosphotungstique 2 %, séchées, observées MET.

Libération in vitro des médicaments des nanoformulations

Libération médicaments encapsulés évaluée par dialyse. 2 mL nanoparticules chargées (équivalent 1 mg ATRA et 1 mg DBZ) scellées dans membrane dialyse (Spectra/Por, COPM 3,5 kDa). Tube dialyse placé dans 25 mL tampon libération, rotation 100 tr/min à 37 °C. À intervalles prédéterminés jusqu'à 72 h, 1 mL échantillons prélevés et remplacés par tampon frais quantité égale. Quantité DBZ et ATRA évaluée par HPLC comme décrit.

Culture cellulaire et analyse absorption cellulaire

Cellules mélanome murin B16F10 achetées China Infrastructure of Cell Line Resources (Pékin). Culture en RPMI-1640 10 % FBS 1 % mélange antibiotiques. Milieux changés tous les 2 jours, culture après 90 % confluence. Pour analyse absorption, cellules B16F10 ensemencées plaque 6 puits 24 h incubation. Nanoparticules chargées Coumarine-6 traceur fluorescent. Vieux milieu remplacé par milieu frais contenant nanoparticules Coumarine-6, incubation 1-3 h ordre inverse. Cellules lavées, décollées, centrifugées 1200 tr/min 5 min, culot resuspendu 1 mL PBS froid. Échantillons évalués cytomètre AccuriTM C6 (BD Co.).

Test cytotoxicité in vitro

Effet cytotoxique ATRA libre, DBZ, D-LNF, RD-LNF sur B16F10 évalué par MTT. Cellules (1 × 10⁴) ensemencées par puits plaque 96 puits, incubation 24 h. Cellules traitées différentes concentrations ATRA libre, DBZ test effet anticancéreur. Suivi par traitement concentration fixe ATRA libre, DBZ, D-LNF, RD-LNF 25 μg/mL et 50 μg/mL. Incubation 24 h, milieux retirés, lavés 2× PBS. 100 μL MTT 5 mg/mL ajoutés, incubation 4 h. Milieu retiré, 100 μL isopropanol ajoutés, incubation 15 min agitation. Cristaux formazan dissous étudiés 570 nm lecteur microplaques. Cellules non traitées témoin, calculs basés viabilité contrôles.

Test apoptose - Cytomètre

Effet apoptose ATRA libre, DBZ, D-LNF, RD-LNF sur B16F10 évalué par coloration PE annexine V et kit apoptose 7AAD. Cellules ensemencées plaque 12 puits densité 2 × 10⁵ cellules/puits, incubation 24 h. Cellules traitées 25 μg/mL équivalents formulations, cellules non traitées témoin. Après 24 h exposition, coloration selon protocole fabricant. Cytomètre AccuriTM C6 pour expression PE et 7AAD, minimum 10 000 événements acquis. PE+ 7AAD- : apoptose précoce ; PE+ 7AAD+ : apoptose tardive.

Analyse cycle cellulaire - Cytomètre

Cellules ensemencées plaque 12 puits densité 2 × 10⁵ cellules/puits, incubation 24 h. Traitement 25 μg/mL équivalents formulations, cellules non traitées témoin. Après 24 h, cellules lavées, récoltées trypsination, fixées éthanol 70 % 2 h à 4 °C. Traitement ribonucléase élimination contamination ARN. Coloration iodure propidium (PI) 30 min à 37 °C. Fluorescence cellules PI-colorées déterminée cytomètre AccuriTM C6. Phases cycle : subG1, G1, S, G2/M.

Test formation colonies

Cellules ensemencées plaques 12 puits densité 2 × 10⁵ cellules/puits, incubation 24 h. Traitement 25 μg/mL équivalents formulations. Cellules trypsinisées, lavées, comptées compteur cellules. Ensemencées plaque 6 puits densité 1500 cellules/puits. Incubation 37 °C 12 jours jusqu'à colonies visibles. Lavées PBS, fixées méthanol/acide acétique/eau (1:1:8) 10 min, colorées violet cristal 0,1 % 45 min. Observées microscope optique.

Test migration cellulaire

Chambre Transwell 12 puits pores 8 μm. 5 × 10⁴ cellules/puits chambre supérieure. Milieu supérieur sans FBS, chambre inférieure 10 % FBS. Après 24 h, cellules migrées surface membrane inférieure fixées, colorées violet cristal 0,5 %. Nombre cellules compté 5 champs aléatoires microscope optique, moyenne enregistrée, analysée.

Analyse statistique

Données moyenne ± écart-type, triplicat sauf mention contraire. Deux groupes : test t non apparié ; plus deux groupes : ANOVA unilatéral test Turkey comparaison multiple. Logiciel GraphPad Prism, différence p < 0,05 significative.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation des nanoformulations lipidiques chargées DBZ/ATRA

Le traitement du mélanome reste un défi majeur, options standard chimiothérapie/radiothérapie/résection chirurgicale efficaces seulement tumeurs solides bulk avec pronostic pauvre. FDA a approuvé paclitaxel ou combinaisons, mais échec améliorer survie globale et guérison. DBZ premier choix chimiothérapie FDA ; cependant DBZ souffre mauvaises propriétés physicochimiques, taux réponse décevant 10-25 %. Pour relever ces défis, nous avons développé nouvelle stratégie thérapeutique combinaison ATRA et DBZ en nanoformulations lipidiques (Fig. 1). Nous hypothétisons que la combinaison de deux composants thérapeutiques améliorera l'efficacité antitumorale dans mélanomes. Notons qu'ATRA, bien qu'exhibant propriétés anticancéreuses, n'entraîne pas d'effets indésirables dans l'environnement systémique. Comme DBZ est hydrophobe, nous avons conçu nanoformulations lipidiques incorporant stablement médicaments hydrophobes dans noyau lipidique, ATRA chargé comme composant structurel des nanoparticules. Les nanoparticules lipidiques portant composants thérapeutiques aideront à délivrer dans tumeurs profondes. Efficacité chargement DBZ et ATRA : 91,2 ± 1,25 % et 95,8 ± 1,14 %. Capacité chargement DBZ et ATRA dans RD-LNF : 7,07 ± 0,65 % p/p et 7,48 ± 1,05 % p/p. Taille D-LNF : 121,5 ± 1,65 nm, PDI 0,134, potentiel zêta -23,5 ± 0,85 mV. Taille RD-LNF : 138,2 ± 1,28 nm, PDI 0,159, potentiel zêta -25,4 ± 0,58 mV. Augmentation taille due chargement structurel ATRA ; taille finale < 150 nm permettant accumulation préférentielle tumeurs mélanome par effet EPR. PEG hydrophile empêche agrégation, réduit capture système réticulo-endothélial (RES), améliore performance systémique. Charge surface ~ -25 mV confère excellente stabilité stockage. Morphologie MET (Fig. 2) : D-LNF et RD-LNF parfaitement sphériques, distribuées uniformément grille cuivre. Différence taille cohérente DLS. Absence débris, petites particules, agrégation indique succès formulation.

Analyse stabilité et libération in vitro des médicaments depuis D-LNF et RD-LNF

RD-LNF excellente stabilité pH 7,4 (PBS) et sérum (10 % FBS) (Fig. 3a). Taille particulaire sans augmentation significative dans les deux conditions pendant toute l'étude, indiquant stabilité nanoparticules. Capacité libération médicaments manière opportune détermine efficacité systèmes nanoparticules chargées. Cinétique libération DBZ et ATRA depuis D-LNF et RD-LNF dans PBS (pH 7,4) effectuée. Fig. 3b : pas de libération éclat ou par phases observée depuis les deux systèmes, indiquant chargement stable dans noyau nanoparticules, pas surface. Pas différence significative libération DBZ depuis D-LNF et RD-LNF, présence ATRA ne ralentit pas ou n'altère pas motif libération. Léger retard libération DBZ depuis RD-LNF attribué augmentation longueur chemin due ATRA dans structure lipidique. Intéressant : ATRA libéré significativement plus lentement que DBZ dans RD-LNF. Différences significatives apparaissent après 24 h jusqu'à 72 h, attribué nature extrêmement hydrophobe ATRA et composant structurel. Globalement, absence libération éclat et libération contrôlée composants thérapeutiques bénéficieront traitement mélanome.

Absorption cellulaire in vitro

Absorption cellulaire accrue détermine efficacité thérapeutique dans cellules cancéreuses. Absorption cellulaire RD-LNF dans cellules B16F10 effectuée, Coumarine-6 traceur fluorescent. Fig. 4 : internalisation remarquable observée après 1 h incubation, absorption augmentant constamment jusqu'à 3 h. Absorption remarquable cohérente avec absorption cellulaire plus élevée systèmes vecteurs lipidiques. Mécanisme diffusion passive et endocytose spéculé responsable absorption accrue. Nanoparticules après endocytose atteignent lysosome où médicaments encapsulés libérés, expriment actions pharmacologiques respectives.

Test cytotoxicité in vitro

Test MTT sur B16F10 après traitement formulations respectives évaluer effet anticancéreur agents individuels (Fig. 5a). D'abord, cytotoxicité DBZ libre et ATRA libre évaluée. DBZ effet cytotoxique dose-dépendant cellules mélanome ; ATRA effet cytotoxique significativement plus élevé cellules B16F10. À 100 μg/mL, DBZ ~ 45 % viabilité vs ~ 22 % ATRA, indiquant excellente efficacité thérapeutique ATRA. Pour prouver co-délivrance DBZ+ATRA pourrait inhiber progression cancer, RD-LNF traitées cellules mélanome. D-LNF (médicament unique) groupe référence souligner efficacité synergique ATRA (Fig. 5b). À 25 μg/mL concentration fixe, ATRA viabilité légèrement inférieure DBZ ; D-LNF n'améliore pas effet anticancéreur DBZ, reste peu efficace. Comme attendu, RD-LNF viabilité significativement plus faible, effet anticancéreur plus élevé vs D-LNF, indiquant effet synergique apparent composants doubles vers mort cellules mélanome. RD-LNF effet anticancéreur significativement plus élevé vs tous autres groupes. Libération lente soutenue DBZ avec libération lente ATRA du système nanovecteur pourrait contribuer effet synergique. Dans cette étude, DBZ principal médicament chimiothérapeutique, ATRA employé comme composant structurel nanoparticules lipidiques, donc pas groupe séparé R-LNF. Effet anticancéreur ATRA nu et DBZ nu étudié. De nombreux rapports prouvent effet anticancéreux ATRA ; ATRA utilisé comme composant structurel améliorant efficacité anticancéreuse thérapeutiques encapsulées manière synergique.

Test formation colonies

Test formation colonies évaluer potentiel tumorigénèse cellules mélanome. Fig. 6 : ATRA libre et DBZ libre rôle limité inhibition formation colonies ; D-LNF inefficace contrôle formation colonies. Comme attendu, combinaison DBZ+ATRA résultait potentialisation significative inhibition formation colonies vs médicaments libres individuels ou nanoparticules médicament unique. Test formation colonies réitère efficacité anticancéreuse supérieure RD-LNF vs médicaments libres.

Test apoptose in vitro et analyse cycle cellulaire

Induction apoptose B16F10 après traitement D-LNF et RD-LNF étudiée cytomètre après coloration Annexine V-FITC/PI (Fig. 7a). ATRA et DBZ causaient seulement 10-12 % apoptose, plupart cellules intactes. Légère augmentation cellules apoptose précoce après D-LNF suggère effet vecteur délivrance. Important : RD-LNF induisait plus grande proportion cellules apoptose avec plus grande proportion apoptose tardive et précoce, indiquant efficacité anticancéreuse supérieure nanoparticules combinatoires. RD-LNF : apoptose tardive +21,5 %, apoptose précoce +18,3 %, cellules viables 95 % → 52 %, suggérant combinaison DBZ+ATRA contribue apoptose cellules cancéreuses et inhibe inhibition prolifération B16F10. Effet apoptose formulations confirmé analyse cycle cellulaire. Fig. 7b : DBZ et ATRA légère augmentation population sub-G0 ; D-LNF population sub-G0 relativement plus élevée vs médicaments libres. Notablement, augmentation remarquable population sub-G0 pour RD-LNF indiquant apoptose marquée cellules cancéreuses. Known : DBZ augmente p21, caspase-3, PARP clivé, promouvant apoptose via stabilisation p53. Induction p53 inhibe progression cycle cellulaire. Combinaison DBZ+ATRA attendue potentialiser mécanisme apoptose et stopper progression cycle cellules cancéreuses, exhiber efficacité anticancéreuse.

Effet nanoparticules combinatoires sur migration cellulaire

Migration analysée membrane Transwell, cellules migrantes observées coloration violet cristal (Fig. 8). Après 24 h, cellules témoin migration quasi complète. ATRA inhibe migration relativement mieux que DBZ. D-LNF effet inhibiteur notable ; cependant effet migration le plus remarquable observé RD-LNF cellules B16F10. Diminution multiple migration vs cellules témoin non traitées. Résultats démontrent clairement RD-LNF diminue potentiellement prolifération aberrante cellules malignes et supprime migration efficacement.

Conclusion

En conclusion, nous avons formulé avec succès nanoformulations lipidiques chargées dacarbazine et acide rétinoïque tout-trans. Nos résultats démontrent clairement que RD-LNF inhibe prolifération cellules mélanome, induit apoptose remarquable, inhibe progression cycle cellulaire et migrations. Travaux futurs : efficacité anticancéreuse modèles animaux cliniquement pertinents et thérapie ciblée vers mélanome. Étude préliminaire cellules mélanome, études larges modèles animaux cliniquement pertinents prochaine partie recherche.

Disponibilité des données et matériaux

Non applicable

Abréviations

DBZ :

Dacarbazine

ATRA :

Acide rétinoïque tout-trans

D-LNF :

Nanoformulations lipidiques chargées DBZ

RD-LNF :

Nanoformulations lipidiques chargées ATRA/DBZ

SLN :

Nanoparticules lipidiques solides