Vésicules ethosomales biocompatibles chargées en acide 5-aminolévulinique/or nanoparticules : stratégie transdermique synergique photodynamique/photothermique pour le traitement des cicatrices hypertrophiques

Résumé

Nous rapportons une vésicule ethosomale biocompatible (A/A-ES) co-chargée en acide 5-aminolévulinique (ALA) et nanoparticules d'or (AuNP) préparée par ultrasons sans réactifs toxiques. A/A-ES présente une bande d'absorption plasmonique prononcée à 600-650 nm, permettant une activation simultanée photodynamique (PDT) et photothermique (PTT) avec un laser 632 nm. Des études transdermiques in vitro confirment que A/A-ES délivre efficacement ALA et AuNP dans le tissu de cicatrice hypertrophique (CH), atteignant 48 % de rétention d'ALA après 2 h. Des essais cellulaires avec des fibroblastes de cicatrice hypertrophique (FCH) démontrent que A/A-ES augmente nettement la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et la génération de chaleur, menant à une apoptose et nécrose accrues comparé à la PDT ou PTT seule. Ces résultats mettent en avant A/A-ES comme plateforme topique prometteuse pour la PDT/PTT synergique des CH.

Contexte

Les cicatrices hypertrophiques (CH) résultent d'un dépôt excessif de collagène dermique et se caractérisent par une peau épaissie, fibreuse, pouvant altérer la fonction et l'esthétique. Les traitements conventionnels — injections intralésionnelles, vêtements de compression, thérapie laser — souffrent souvent d'efficacité limitée, d'inconfort ou d'effets indésirables comme l'hypopigmentation et l'atrophie tissulaire. La thérapie photodynamique (PDT) utilisant l'acide 5-aminolévulinique (ALA) offre une cytotoxicité sélective via génération de ROS, mais son utilité clinique est entravée par une mauvaise pénétration cutanée et un faible rendement ROS. La thérapie photothermique (PTT), particulièrement avec des nanoparticules d'or (AuNP) qui convertissent la lumière en chaleur par résonance de plasmon de surface localisée (LSPR), peut amplifier la production ROS et ablater sélectivement le tissu cicatriciel, mais de hautes puissances laser risquent d'endommager la peau environnante.

Combiner PDT et PTT dans une seule plateforme promet des bénéfices synergiques : la génération ROS médiate par ALA peut être amplifiée par la chaleur des AuNP, tandis que l'effet photothermique peut augmenter la température locale, boostant davantage les rendements ROS. Les vésicules ethosomales (ES) fournissent un vecteur lipidique déformable qui améliore la délivrance transdermique de médicaments hydrophiles et lipophiles. Des travaux antérieurs ont démontré que les ES chargées en ALA (ALA-ES) surpassaient significativement les solutions aqueuses pour délivrer l'ALA au tissu CH. Cependant, l'intégration d'AuNP dans les ES tout en maintenant la biocompatibilité et une délivrance efficace reste un défi. Ici, nous présentons une synthèse facile par ultrasons d'A/A-ES encapsulant simultanément ALA et AuNP sans solvants toxiques, atteignant un piégeage élevé d'ALA (≈20 %) et une forte absorption 600-650 nm.

Résultats et discussions

Caractérisation de A/A-ES

L'ultrasonication a servi à deux fins : (1) elle a généré des AuNP in situ via réduction radicalaire d'AuCl₄⁻, évitant des agents réducteurs toxiques ; (2) elle a induit une réorganisation de la bicouche lipidique, produisant de petites vésicules de taille uniforme avec un noyau interne ample pour le chargement de médicaments. La spectroscopie UV-Vis a confirmé un pic d'absorption fort à 600-650 nm (Fig. 1a), attribuable au couplage plasmonique entre AuNP adjacents. La diffusion dynamique de la lumière a révélé une distribution de taille étroite centrée à 166 ± 83 nm (Fig. 1b), tandis que les images MEB/MET montraient des vésicules sphériques intactes (~200 nm) avec des AuNP clairement visibles embarqués dans la bicouche (Fig. 1c,d). L'efficacité d'encapsulation (EE) de l'ALA a atteint 20 %, surpassant les valeurs rapportées pour les formulations ES conventionnelles (<10 %). Ces caractéristiques suggèrent qu'A/A-ES est bien adapté pour traverser la matrice de collagène dense des CH.

Étude de pénétration transdermique in vitro de A/A-ES

En utilisant des cellules de diffusion Franz, nous avons quantifié la rétention d'ALA et d'AuNP dans du tissu CH fraîchement excisé. Les deux agents ont culminé à 2 h, atteignant 48 % de la dose d'ALA appliquée dans le tissu (Fig. 2a). Le déclin concomitant par la suite reflète une perméation transdermique complète. L'imagerie MET (Fig. 2b-d) a confirmé des vésicules intactes dans le derme, suivies de la libération d'AuNP qui s'agrègent in situ — favorable pour la génération de chaleur sous irradiation laser. Ces données établissent A/A-ES comme vecteur efficace pour la co-délivrance d'ALA et d'AuNP dans le tissu CH.

PDT/PTT in vitro sur FCH

Essai de biocompatibilité

Les essais de viabilité cellulaire n'ont révélé aucune cytotoxicité significative pour A/A-ES à des concentrations ≤2,0 mM, avec survie >90 % après 12 h (Fig. 3). Des doses plus élevées n'ont causé que des réductions modestes, confirmant le profil de sécurité de la formulation et guidant la concentration thérapeutique à 2,0 mM (≈14 % v/v) pour les expériences subséquentes.

PDT/PTT pour FCH

La microscopie confocale a montré une accumulation robuste de protoporphyrine IX (PpIX) dans les FCH traités avec ALA-ES et A/A-ES ; Au-ES a produit une PpIX négligeable (Fig. 4). Sous irradiation laser 632 nm, la fluorescence PpIX a diminué tandis que les signaux ROS s'intensifiaient, surtout dans les cellules traitées A/A-ES — preuve d'une génération ROS amplifiée via LSPR des AuNP. Des changements morphologiques, comme le blebbing membranaire, étaient prononcés dans les cellules traitées A/A-ES, indiquant la mort cellulaire. La thermographie infrarouge a confirmé que ALA-ES, Au-ES et A/A-ES élevaient la température locale à 41,3 °C (Au-ES/A/A-ES) et 36,5 °C (ALA-ES) sous irradiation, avec refroidissement rapide par la suite (Fig. 5). Ces résultats soulignent les actions photodynamiques et photothermiques duales d'A/A-ES.

Essai d'apoptose et nécrose

La cytométrie de flux de cellules marquées Annexin V/PI a révélé que A/A-ES irradié au laser induisait la fraction nécrotique la plus élevée (61,8 %) comparé à ALA-ES (47,7 %) et Au-ES (24,3 %) (Fig. 6). L'apoptose précoce et tardive étaient aussi élevées dans A/A-ES, reflétant l'effet synergique de l'amplification ROS et du stress photothermique. Ces résultats démontrent quantitativement la supériorité de l'approche PDT/PTT combinée sur les modalités uniques.

Visualisation de A/A-ES dans FCH

La microscopie électronique en transmission a révélé une agrégation extensive d'AuNP dans le cytoplasme des FCH traités A/A-ES, cohérente avec une fusion vésiculaire efficace et libération du chargement. Les images post-irradiation montraient des blebs membranaires caractéristiques, mitochondries gonflées et membranes externes rompues — marques de mort cellulaire (Fig. 7). Ces changements ultrastructuraux confirment qu'A/A-ES délivre efficacement ALA et AuNP aux FCH, menant à une destruction cellulaire photodynamique et photothermique synergique.

Conclusions

Nous avons développé une vésicule ethosomale biocompatible, synthétisée par ultrasons, co-chargée en 5-ALA/AuNP (A/A-ES) qui démontre une forte absorption 600-650 nm, un piégeage élevé d'ALA (~20 %) et une délivrance transdermique efficace au tissu CH. Les études in vitro confirment qu'A/A-ES amplifie la production ROS et le chauffage photothermique, produisant une apoptose et nécrose supérieures des FCH comparé à la PDT ou PTT seule. Ces résultats soutiennent A/A-ES comme plateforme topique prometteuse pour la thérapie photodynamique/photothermique synergique des cicatrices hypertrophiques, justifiant une future évaluation in vivo.

Expériences et méthodes

Préparation de A/A-ES

La phosphatidylcholine (180 mg) a été dissoute dans 1,8 mL éthanol, 0,6 mL HAuCl₄ 10 mM, et 3,6 mL tampon citrate ALA 0,01 M (pH 4,0, 12 mg ALA). Le mélange a été agité à 700 tr/min pendant 10 min, puis soniqué à 200 W pendant 30 min jusqu'à l'apparition d'une couleur vin rouge. La centrifugation (8000 tr/min, 20 min) a éliminé les réactifs non réagi, et le culot a été redispersé dans 3 mL solution hydroalcoolique ALA 2 mg/mL. Une méthode de chargement par gradient de pH transmembranaire a été appliquée pour piéger l'ALA dans le noyau vésiculaire, produisant le A/A-ES final. Pour comparaison, ALA-ES et Au-ES ont été préparés avec des concentrations identiques d'ALA ou d'AuNP mais manquant l'autre composant.

Caractérisation de A/A-ES

La coloration négative avec 1,5 % en poids acide phosphotungstique suivie de MET (JEOL, 120 kV) a évalué la morphologie. MEB (JEOL, 10 kV) a évalué les caractéristiques de surface. La distribution de taille a été mesurée par DLS (Nicomp 380ZLS). La teneur en ALA a été quantifiée via dérivation fluorescamine, et l'EE calculée par ultrafiltration. Les spectres UV-Vis ont été enregistrés sur un spectrophotomètre Varian Cary 50.

Étude de pénétration in vitro par cellules de diffusion Franz

Le tissu CH (≤24 h post-excision) a été monté sur une cellule Franz avec le stratum corneum face au compartiment donneur. Un millilitre d'A/A-ES a été appliqué, et le récepteur maintenu à 37 °C. Après intervalles définis, le tissu a été lavé, homogénéisé, et l'ALA extrait par dialyse pendant 24 h. La rétention d'AuNP a été quantifiée par ICP-MS. Après 2 h d'exposition, les tissus ont été traités pour coupe ultrafine et imagerie MET.

PDT/PTT in vitro pour FCH

Culture cellulaire

Les FCH ont été isolés de biopsies CH de patients par digestion collagénase I et cultivés en DMEM supplémenté 10 % FBS à 37 °C, 5 % CO₂. Les cellules étaient utilisées aux passages 2-3.

Essai de biocompatibilité

FCH (2 × 10³ cellules/puits) ont été exposés à des dilutions sérielles d'ALA-ES, Au-ES ou A/A-ES en milieu sans FBS pendant 12 h. La viabilité cellulaire a été évaluée avec CCK-8.

Procédure PDT/PTT

FCH (4 × 10⁴ cellules/puits) ont été incubés avec 14 % v/v A/A-ES ou témoins pendant 6 h, puis lavés et irradiés avec un laser He-Ne 632 nm, 40 mW/cm² pendant 20 min. Post-irradiation, les cellules ont été cultivées en DMEM avec 10 % FBS pendant 24 h avant les essais en aval.

Essai de génération PpIX intracellulaire et ROS

PpIX et ROS ont été visualisés par CLSM (Leica TCS SP5). La coloration DCFH-DA a quantifié les ROS, tandis que la fluorescence PpIX a été capturée à excitation 405 nm/émission 635 nm.

Essai d'apoptose et nécrose

Le double marquage Annexin V-FITC/PI suivi de cytométrie de flux BD FACSCalibur a déterminé les taux d'apoptose et nécrose. Les données ont été analysées avec FlowJo 7.6.

Analyse statistique

Les données sont présentées comme moyenne ± ET. Le test t de Student a déterminé la significativité (P < 0,05).

Abréviations

A/A-ES :

Vésicule ethosomale chargée en acide 5-aminolévulinique/nanoparticules d'or

ALA :

Acide 5-aminolévulinique

ALA-ES :

ES chargées en ALA

ALA-PDT :

PDT basée sur ALA

Au-ES :

ES chargées en AuNP

AuNP :

Nanoparticules d'or

CLSM :

Microscopie confocale à balayage laser

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM :

Milieu modifié Eagle de Dulbecco

EE :

Efficacité d'encapsulation

ES :

Vésicules ethosomales

FBS :

Sérum bovin fœtal

CH :

Cicatrice hypertrophique

FCH :

Fibroblastes de cicatrice hypertrophique

ICP-MS :

Spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif

LSPR :

Résonance de plasmon de surface localisée

PDT :

Thérapie photodynamique

PDT/PTT :

Thérapie photodynamique/photothermique

PpIX :

Protoporphyrine IX

PTT :

Thérapie photothermique

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

MEB :

Microscopie électronique à balayage

MET :

Microscope électronique en transmission