Nanobâtonnets d'or enrobés de silice et fonctionnalisés par anticorps pour le diagnostic rapide et le traitement photothermique de Cryptococcus neoformans

Résumé

Contexte

Cryptococcus neoformans est une levure encapsulée. Il n'existe encore que peu de solutions rapides et efficaces pour le diagnostic ou le traitement de l'infection par C. neoformans à un stade précoce en clinique. Les nanobâtonnets d'or conjugués à des anticorps et modifiés par la silice (GNR-SiO₂-Ab) peuvent se conjuguer sélectivement à C. neoformans. Cela pourrait offrir une possibilité de traitement de la cryptococcose de manière sûre et efficace.

Méthodes

Les nanobâtonnets d'or (GNR) ont été synthétisés selon le protocole assisté par matrice à germination. L'anti-C. neoformans anticorps a été ancré de manière covalente à la surface des GNR avec un agent de couplage silane. L'imagerie par tomodensitométrie (CT) in vitro a été réalisée pour explorer l'effet diagnostique des GNR-SiO₂-Ab. La viabilité cellulaire a été évaluée pour confirmer l'effet de thérapie photothermique des GNR-SiO₂-Ab combinés avec un laser proche infrarouge (NIR).

Résultats

Les GNR-SiO₂-Ab ont une application potentielle comme agent de contraste positif pour l'imagerie CT/rayons X. Un anticorps peut induire une agrégation bien plus grande des GNR en se liant à la surface des cellules de C. neoformans, résultant en des valeurs d'atténuation bien plus élevées que jamais. Après irradiation, les cellules de C. neoformans ont subi des dommages photothermiques et la structure normale des cellules a été détruite. La viabilité cellulaire a diminué significativement par rapport aux cellules non traitées.

Conclusions

Notre travail a confirmé que les nanobâtonnets d'or conjugués à des anticorps et modifiés par la silice pouvaient améliorer l'atténuation des rayons X des cellules de C. neoformans dans les images CT. Et les GNR immunisés, médiatisés par des anticorps, pouvaient augmenter les effets de la thérapie photothermique induite par NIR dans les cellules de C. neoformans.

Contexte

Cryptococcus neoformans est une levure encapsulée, décrite pour la première fois par Busse en 1894. L'infection par la levure encapsulée Cryptococcus neoformans peut entraîner une colonisation inoffensive des voies respiratoires, mais peut aussi mener à une méningite ou une maladie disséminée, en particulier chez les personnes avec une immunité médiée par les cellules défectueuse. La cryptococcose représente une infection fongique majeure mettant en jeu le pronostic vital chez les patients avec une infection VIH sévère et peut également compliquer la transplantation d'organes, les maladies réticulo-endothéliales, le traitement par corticostéroïdes ou la sarcoïdose. La méningite cryptococcique associée au VIH est responsable de plus de 600 000 décès par an dans le monde. La méningite cryptococcique et la maladie disséminée étaient invariablement fatales. En 1995, Speed et Dunt ont rapporté un taux de mortalité de 14 % parmi les patients atteints de maladie cryptococcique traités par amphotéricine B plus flucytosine. Le bilan chez les patients avec cryptococcose suspectée dépendait de la culture fongique. Cependant, il n'existe encore que peu de solutions rapides et efficaces pour le diagnostic ou le traitement de l'infection par C. neoformans à un stade précoce. De plus, la plupart des patients atteints d'infections cryptococciques ne reçoivent pas de traitements rapides, entraînant un taux de mortalité élevé.

Parmi toutes les techniques d'imagerie, la tomodensitométrie (CT) aux rayons X est l'un des outils diagnostiques les plus utiles dans les hôpitaux en termes de disponibilité, d'efficacité et de coût. La CT est capable d'identifier des motifs anatomiques et de fournir des informations anatomiques complémentaires incluant la localisation, la taille et la propagation de la tumeur sur le contraste endogène. Une manifestation courante de la cryptococcose pulmonaire est la présence de nodules ou masses pulmonaires solitaires ou multiples, de cavitation ou d'anomalies parenchymateuses. Ces manifestations sont clairement détectées par l'imagerie tomodensitométrique (CT). En utilisant l'imagerie radiographique, les caractéristiques suivantes de la méningite cryptococcique sont typiquement présentées : espaces de Virchow-Robin dilatés, rehaussement méningé, fissure choroïdienne proéminente et kystes parahippocampiques. Cependant, la cryptococcose précoce ne peut pas être détectée par l'imagerie radiologique. Cela signifie que nous ne pouvons pas effectuer un traitement rapide à un stade précoce. Récemment, les avancées dans le contrôle de la forme/morphologie de surface des nanomatériaux d'or ont démontré la grande capacité d'ingénier leur résonance de plasmon de surface localisée. Ici, nous avons étudié un type de nanomatériau d'or à l'échelle nanométrique appelé nanobâtonnets d'or (GNR), qui peuvent se conjonctiver sélectivement avec les champignons. En imagerie CT clinique, les composés iodés sont les agents de contraste les plus couramment utilisés. Cependant, le numéro atomique et la densité électronique de l'or sont bien plus élevés que ceux de l'iode. L'or peut induire une forte atténuation des rayons X, ce qui en fait un candidat idéal pour les agents de contraste CT. En conjuguant les GNR avec des anticorps spécifiques, les scientifiques peuvent potentiellement cibler et capturer des images de tissus et pathogènes spécifiques.

L'amphotéricine B est un agent thérapeutique majeur pour le traitement de la maladie cryptococcique, déployé depuis la fin des années 1960. Cependant, l'efficacité clinique de l'amphotéricine B est limitée et elle présente une néphrotoxicité significative. L'efficacité des médicaments actuels est compromise par la toxicité, la résistance aux médicaments ou une gamme d'activité inadéquate. Donc, de nouvelles méthodes thérapeutiques sélectives pour la maladie cryptococcique doivent être conçues. Récemment, les traitements photothermiques sont largement utilisés pour cibler et détruire les cellules cancéreuses, les virus et les bactéries. Comparé aux régimes thérapeutiques classiques, le mécanisme de tels agents thérapeutiques est complètement différent. La lumière laser proche infrarouge (NIR) est une méthode de traitement photothermique idéale, qui peut être absorbée spécifiquement par les tissus ou matériaux. La lumière peut pénétrer efficacement à travers les tissus en accompagnant un dommage minimal aux tissus normaux. Les GNR absorbent la lumière dans la région NIR (650–900 nm), et l'énergie lumineuse absorbée peut être convertie en énergie thermique. Sur la base de ce principe, c'est une méthode idéale de combiner la lumière laser NIR avec les GNR pour le traitement. Comparés aux photosensibilisateurs classiques, les GNR ont plusieurs caractéristiques avantageuses : section d'absorption élevée, haute solubilité, excellente biocompatibilité, faible toxicité, grande stabilité à la lumière, et conjugaison facile avec des molécules cibles. Plusieurs rapports ont décrit comment les GNR peuvent être utilisés pour des traitements photothermiques. Carpin a mené une expérience sur des cellules de cancer du sein surexprimant le gène HER2 et incubées avec des nanoshells or-silice conjugués à l'anti-HER2. Par la suite, les complexes ont été irradiés par un rayonnement NIR à 808 nm. Comparé au groupe témoin, les cellules ont été détruites. Wang a rapporté que des GNR conjugués à des anticorps pouvaient sélectionner et détruire les bactéries pathogènes Salmonella lorsqu'elles étaient exposées au rayonnement NIR. Il y a eu une réduction hautement significative de la viabilité des cellules Salmonella.

Ici, nous avons utilisé des nanobâtonnets d'or conjugués à des anticorps et modifiés par la silice pour se lier spécifiquement aux cellules de C. neoformans. De plus, les cellules se liant aux complexes peuvent être facilement distinguées dans les images CT. Ces nanoparticules d'or étaient associées aux cellules de C. neoformans via une conjugaison immunitaire, et la lyse photothermique a causé une réduction significative de la viabilité cellulaire. Notre étude a confirmé une option toute nouvelle pour le diagnostic et la thérapie photothermique de C. neoformans in vitro et fournit une possibilité pour le traitement de la cryptococcose de manière sûre et efficace.

Méthodes

Matériaux

L'anti-C. neoformans anticorps a été acheté chez Meridian Life Science (Memphis, TN, USA). L'acide chloroaurique (HAuCl₄·3H₂O) a été obtenu de Sigma (St. Louis, MO, USA). Le nitrate d'argent (AgNO₃), l'orthosilicate de tétraéthyle (TEOS), l'aminopropyltriméthoxysilane (APTS), le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), l'hydrure de sodium borohydrure (NaBH₄), le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC), le poly(sodium-4-styrènesulfonate) (PSS) et l'acide ascorbique ont été obtenus de J & K Chemical Limited (Chine). Tous les produits chimiques ci-dessus ont été utilisés sans purification supplémentaire. L'eau déionisée (grade Millipore Milli-Q) avec une résistivité de 18,2 MΩ cm a été utilisée dans toutes les préparations.

Synthèse des nanobâtonnets d'or conjugués à des anticorps et modifiés par la silice

Dans une expérience typique, les GNR ont été synthétisés selon le protocole assisté par matrice à germination. La voie de synthèse pour la fabrication des nanobâtonnets d'or conjugués à des anticorps et modifiés par la silice (GNR-SiO₂-Ab) est illustrée à la Fig. 1. Vingt-cinq millilitres de la solution de GNR ont été centrifugés à 12000 tr/min pendant 15 min. Le surnageant, contenant principalement des molécules de CTAB, a été retiré, et le précipité a été resuspendu dans 20 mL d'éthanol anhydre ajusté à pH 10 avec 20 µL d'ammoniaque à 28 %. Après sonication du système, 5 mL de TEOS (10 mM) ont été ajoutés et l'ensemble du système a été vigoureusement agité pendant 24 h. Les GNR enrobés de silice ont été collectés par centrifugation à 4000 tr/min pendant 30 min et lavés trois fois à l'eau et deux fois à l'éthanol. Les échantillons purifiés de GNR-SiO₂ ont été redispersés dans 10 mL d'éthanol pour expériences ultérieures. Par la suite, 10 mL d'APTS ont été ajoutés pour former une solution mixte et laisser réagir sous reflux à 60 °C pendant 1 h. Le résultant a été lavé à l'eau déionisée cinq fois et séché à 60 °C pendant 3 h dans un four sous vide pour obtenir les GNR-SiO₂-NH₂. Le résultant a été en outre enrobé d'un polymère (PSS) par une technique couche par couche fournissant des groupes amines accessibles au solvant. Ces nanobâtonnets terminés par amine ont été laissés réagir avec l'acide carboxylique d'anticorps purifiés pendant 12–16 h en présence d'EDC, un carbodiimide hydrosoluble qui favorise la formation de liaison amide entre l'acide carboxylique et l'amine primaire. Après incubation, les complexes nanobâtonnet-anticorps ont été purifiés par centrifugation et resuspendus dans du PBS.

Procédure de synthèse des GNR-SiO₂-Ab.

Caractérisation des GNR-SiO₂-Ab

La taille et la morphologie des GNR et GNR-SiO₂-Ab ont été caractérisées en utilisant la microscopie électronique à transmission (MET ; Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA), opérant à une tension d'accélération de 120 kV. Les spectres UV-vis ont été mesurés à 20 °C avec un spectrophotomètre UV-visible (Shimadzu UV-2450, Shimadzu, Japon) équipé d'une cuve en quartz de 10 mm, où la longueur de parcours optique était de 1 cm. La gamme de longueurs d'onde 200–1000 nm a été scannée, car elle inclut les pics d'absorption des GNR, de l'anti-C. neoformans anticorps, et des GNR-SiO₂-Ab. Les GNR-SiO₂-Ab ont été incubés à 4 °C pendant 2 et 4 semaines. La gamme 200–1000 nm a été scannée à ces deux moments.

Mesure des unités Hounsfield des GNR-SiO₂-Ab

La solution aqueuse de GNR-SiO₂-Ab à différentes concentrations dans la gamme 0,04–4 mg/mL a été directement détectée à l'aide d'un scanner CT Philips Brilliance 64 (Philips Healthcare, Best, Pays-Bas). Les valeurs d'atténuation ont été obtenues à partir du logiciel d'imagerie CT.

Fixation de C. neoformans aux GNR-SiO₂-Ab

C. neoformans souche type A H99 a été obtenu du Laboratoire Clé de Mycologie Médicale Moléculaire de Shanghai (Hôpital Changzheng de Shanghai, Deuxième Université Médicale Militaire, Shanghai, Chine). Les champignons ont été laissés incuber avec les GNR et les complexes anticorps-nanobâtonnets pendant 1 h avant la préparation pour l'analyse MET. Les images ont été collectées sur un instrument MET (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA) opérant à une tension d'accélération de 120 kV.

Imagerie CT in vitro des complexes champignon-anticorps-nanobâtonnet

Les matériaux et champignons ont été divisés en trois groupes, incluant le groupe champignon (N), le groupe GPR-SiO₂-Ab (G), et le groupe GPR-SiO₂-Ab-attaché C. neoformans (G+N). La concentration de la solution aqueuse de GNR-SiO₂-Ab ci-dessus était de 4 mg/mL. Pour l'imagerie CT in vitro, les solutions des trois groupes ont été préparées dans des tubes Ep stériles de 1,5 mL. Tous les scans CT ont été effectués en utilisant le système CT susmentionné.

Effets de la thérapie photothermique in vitro

Les cellules de C. neoformans incubées avec et sans GNR-SiO₂-Ab ont été exposées à un laser NIR (LWIRL 808, Laserwave Ltd., Chine) pendant 5 min, avec une longueur d'onde de 808 nm et une intensité de 30 mW (4 W/cm²). Les images ont été collectées sur un instrument MET (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA) opérant à une tension d'accélération de 120 kV. Après irradiation, les cellules ont été incubées pendant 2 h à 37 °C dans l'obscurité. Les cellules de C. neoformans incubées avec et sans GNR-SiO₂-Ab ont été conçues comme groupes témoins. La viabilité cellulaire a été déterminée en effectuant un test de viabilité cellulaire luminescent CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, WI, USA) conformément aux instructions du fabricant. Ce test de viabilité cellulaire particulier était une méthode homogène, qui pouvait déterminer le nombre de cellules viables. La réaction catalysée par la luciférase entre la luciférine et l'ATP a été utilisée pour la synthèse de cellules métaboliquement actives. Toutes les expériences ont été répétées six fois, et leurs valeurs moyennes ont été déterminées.

Analyse statistique

Toutes les analyses ont été effectuées en utilisant SPSS version 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Les données sont exprimées en moyenne ± ET. Une valeur de P inférieure à 0,05 a été prise pour indiquer une signification statistique. Toutes les figures présentées dans cet article ont été obtenues à partir de plus de trois expériences indépendantes avec des résultats similaires.

Résultats

Synthèse et caractérisation des GNR-SiO₂-Ab

Une méthode pour les GNR enrobés de silice avec TEOS comme source de silice et APTS comme agent de couplage a été rapportée précédemment. La forme ou la taille des GPR n'ont pas changé lorsqu'ils ont été conjugués avec l'anti-C. neoformans. La Figure 2 montre l'image MET des GNR-SiO₂-Ab. Ces nanoparticules mesurent 18,48 ± 2,39 nm en largeur et 57,56 ± 4,57 nm en longueur.

a, b Image MET des GNR-SiO₂-Ab. Les nanobâtonnets présentaient une apparence en forme de bâtonnet. La forme ou la taille des GPR n'ont pas changé lorsqu'ils ont été conjugués avec l'anti-C. neoformans.

Propriété spectroscopique et stabilité des GNR-SiO₂-Ab

Concernant la propriété photo-physique des GNR-SiO₂-Ab, la Fig. 3 montre les spectres d'absorption des GNR-SiO₂, GNR-SiO₂-Ab, et de l'anti-C. neoformans anticorps. Le spectre des GNR-SiO₂ montre que les GNR-SiO₂ ont deux bandes d'absorption, une faible longueur d'onde de résonance de plasmon de surface transverse (TSPRW) autour de 520 nm et une forte longueur d'onde de résonance de plasmon de surface longitudinale (LSPRW) autour de 808 nm. Après conjugaison avec les anticorps, les TSPRW et LSPRW des GNR-SiO₂-Ab sont à 540 et 835 nm, respectivement. En comparant le spectre de l'anticorps et des GNR-SiO₂-Ab, les deux ont le même pic spécial autour de 280 nm. Ce résultat prouve que l'anti-C. neoformans anticorps a été conjugué avec succès aux GNR-SiO₂. Après incubation à 4 °C pendant 2 semaines, les TSPRW et LSPRW des GNR-SiO₂-Ab sont 540 et 835 nm, respectivement. Et les mêmes données ont été observées à 4 semaines. Les TSPRW et LSPRW des GNR-SiO₂-Ab n'ont pas changé après incubation pendant 4 semaines. Cela a confirmé la stabilité des GNR-SiO₂-Ab.

Spectres d'absorption de : GNR+SiO₂+Ab (A), GNR+SiO₂ (B), et anti-C. neoformans anticorps (C). Les GNR-SiO₂ ont deux bandes d'absorption, une faible longueur d'onde de résonance de plasmon de surface transverse (TSPRW) autour de 520 nm et une forte longueur d'onde de résonance de plasmon de surface longitudinale (LSPRW) autour de 808 nm. Après conjugaison avec les anticorps, les TSPRW et LSPRW des GNR-SiO₂-Ab sont 540 et 835 nm, respectivement.

Mesure des unités Hounsfield des GNR-SiO₂-Ab

Les unités Hounsfield (UH) des GNR-SiO₂-Ab évaluées par un CT clinique. La Figure 4 affiche les images CT dans la gamme 0,04–4 mg/mL de GNR-SiO₂-Ab. À mesure que la concentration de GNR-SiO₂-Ab augmentait, l'intensité du signal CT augmentait continuellement. Comme montré à la Fig. 3, les UH en fonction de la concentration de GNR-SiO₂-Ab affichent une relation linéaire bien corrélée (R² = 0,9903), décrite par l'équation typique suivante : y = 12,52x + 11,971. Ces résultats suggèrent que les GNR-SiO₂-Ab ont une application potentielle comme agent de contraste positif pour l'imagerie CT/rayons X.

Unités Hounsfield des GNR-SiO₂-Ab. a Images CT in vitro des GNR-SiO₂-Ab en suspension dans PBS. La concentration (mg/mL) dans chaque échantillon est fournie au-dessus de l'image respective. b Graphique d'atténuation CT des GNR-SiO₂-Ab à diverses concentrations dans la gamme 0,04 à 4 mg/mL.

Fixation des cellules de C. neoformans aux GNR-SiO₂-Ab

Les images MET montrent la caractéristique morphologique des cellules de C. neoformans et des complexes champignon-anticorps-nanobâtonnet. Ces cellules ont un diamètre variant de 2 à 20 µm. La Figure 5a montre l'image MET des cellules de C. neoformans, qui est entourée d'une capsule polysaccharide. Ces cellules avaient un diamètre de 4–6 µm sans liaison d'aucune structure. Comme montré à la Fig. 5b, les cellules de C. neoformans sont recouvertes par beaucoup de GNR-SiO₂-Ab agrégés, après incubation avec les complexes anticorps-nanobâtonnet. Nous avons incubé les cellules fongiques avec GNR-SiO₂ afin d'explorer si les GNR-SiO₂ étaient attachés à C. neoformans. Nos résultats ont indiqué que les GNR-SiO₂ étaient dispersés comme montré à la Fig. 5c. Notre étude montre que les cellules de C. neoformans peuvent se conjuguer avec les GNR-SiO₂-Ab sélectivement.

Images MET illustrant l'interaction entre GNR-SiO₂-Ab et les cellules de C. neoformans. a Image MET des cellules de C. neoformans. b Image MET des complexes champignon-anticorps-nanobâtonnet. c Image MET des cellules de C. neoformans incubées avec GNR-SiO₂.

Imagerie CT in vitro des complexes champignon-anticorps-nanobâtonnet

Nous avons effectué une analyse quantitative de l'intensité du signal CT via le programme d'affichage standard du fabricant (Philips portal, Philips Healthcare, Best, Pays-Bas). La Figure 6 représente les valeurs d'atténuation des rayons X des trois groupes. Les valeurs du groupe G+N étaient significativement plus élevées que celles des groupes G et N. De plus, les valeurs d'atténuation des rayons X du groupe G étaient significativement plus élevées que celles du groupe N. Ce résultat concorde avec les conclusions de la littérature précédente.

a, b Imagerie CT in vitro des différents groupes. Les valeurs du groupe G+N étaient significativement plus élevées que celles des groupes G et N. De plus, les valeurs d'atténuation des rayons X du groupe G étaient significativement plus élevées que celles du groupe N.

Effets in vitro de la thérapie photothermique

Nous avons évalué la viabilité cellulaire en effectuant un test de viabilité cellulaire sur un instrument luminescent CellTiter-Glo®. Les cellules sans irradiation avaient une viabilité plus grande que les cellules irradiées NIR (P < 0,05). De plus, la viabilité des champignons était plus élevée que celle des cellules conjuguées avec GNR-SiO₂-Ab après irradiation NIR (P < 0,05). En outre, les cellules avaient une viabilité plus élevée que les complexes champignon-anticorps-nanobâtonnet (P < 0,05). La Figure 7 illustre clairement la variation de la viabilité des cellules de C. neoformans avec différents traitements. Après irradiation, les cellules de C. neoformans ont subi des dommages photothermiques et la structure normale des cellules a été détruite. Comme montré à la Fig. 8, les cellules présentaient des apparences atrophiques, irrégulières et effondrées. La capsule polysaccharide caractéristique a été endommagée.

Viabilité des cellules traitées différemment. Les cellules sans irradiation avaient une viabilité plus grande que les cellules irradiées NIR (P < 0,05). De plus, la viabilité des champignons était plus élevée que celle des cellules conjuguées avec GNR-SiO₂-Ab après irradiation NIR (P < 0,05). En outre, les cellules avaient une viabilité plus élevée que les complexes champignon-anticorps-nanobâtonnet (P < 0,05).

a, b Images MET démontrant les dommages photothermiques des cellules de C. neoformans qui étaient conjuguées avec GNR-SiO₂-Ab. Les cellules présentaient des apparences atrophiques, irrégulières et effondrées. La capsule polysaccharide caractéristique a été endommagée.

Discussion

La silice présente de nombreux avantages par rapport aux polymères. Les procédés de préparation impliqués sont assez faciles, et l'épaisseur d'une coquille de silice peut être ajustée à la taille et porosité désirées. De plus, la silice est extrêmement stable et biocompatible, ne subit pas de gonflement ou de changements de porosité avec un changement de pH, et n'est pas vulnérable aux attaques microbiennes. En outre, la silice permet une modification de surface aisée avec une variété de groupes fonctionnels en utilisant la chimie des silanes et des réactifs organosiliciés commercialement disponibles pour le biociblage. Les GNR enrobés de silice conservent les propriétés optiques supérieures des GNR et peuvent améliorer leur stabilité thermique sous irradiation à haute énergie. Dans notre étude, après avoir été enrobés de silice et conjugués avec l'anti-C. neoformans anticorps, les GNR ont tous deux exhibé un décalage vers le rouge du pic de résonance de plasmon de surface, en raison de l'augmentation de l'indice de réfraction du milieu environnant. Les résultats ont également indiqué que la taille de l'échantillon devenait de plus en plus grande après modification et conjugaison. Ces données indiquaient que nous avions conjugué avec succès les nanoparticules d'or avec un anticorps anti-C. neoformans. Cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que les GNR-SiO₂ possèdent un pouvoir spécial pour conjuguer les cellules après liaison avec les anticorps, et nous effectuerons une étude plus approfondie à l'avenir. Dans cette étude, nous avons réussi à attacher les GNR-SiO₂-Ab à la capsule cellulaire par une simple réaction antigène-anticorps. De plus, nous avons réussi à garantir que nos complexes ciblaient les antigènes sur la capsule cellulaire.

Les GNR ont gagné une attention généralisée au cours de la dernière décennie. Hainfeld et al. ont d'abord rapporté que les GNR peuvent être utilisés comme agent de contraste aux rayons X. Les GNR confèrent plusieurs avantages sur les molécules iodées, un agent de contraste conditionnel. En raison d'un numéro atomique et d'une densité électronique élevés, les GNR exhibent un coefficient d'atténuation des rayons X relativement élevé. Le numéro atomique et la densité électronique de l'or (79 et 19,32 g/cm³, respectivement) sont plus élevés que ceux de l'iode (53 et 4,9 g/cm³). L'iode comme agent de contraste aux rayons X a de nombreux effets secondaires graves, tels que la néphrotoxicité et les réactions allergiques sévères. Cependant, les GNR persistent dans le corps beaucoup plus longtemps que les agents de contraste iodés, ce qui signifie qu'il y a assez de temps pour observer les images. De plus, les GNR peuvent cibler les cellules cancéreuses, les virus et les bactéries, via la fonctionnalisation de surface avec une variété de molécules, telles que des peptides ou des anticorps. Reuveni et al. ont montré que plusieurs types différents de molécules peuvent être attachés à la surface des GNR. Dans cette étude, l'intensité du signal CT augmentait continuellement, avec l'augmentation de la concentration de GNR-SiO₂-Ab, résultant en des images plus brillantes. Les GNR-SiO₂-Ab exhibaient un potentiel positif significatif comme agents de contraste pour l'imagerie CT/rayons X, tout comme les GNR. L'absorption des rayons X des nanobâtonnets d'or restait inchangée, même avec la modification de surface. Ces données indiquent que les propriétés d'atténuation des rayons X des GNR-SiO₂-Ab n'ont pas changé significativement en raison de la modification de surface. Cela concorde avec les résultats rapportés dans la littérature précédente. La fonctionnalisation de surface est un outil puissant qui permet le ciblage passif ou actif des GNR vers un site d'intérêt spécifique. Dans notre étude, nous avons réussi à attacher les GNR-SiO₂-Ab aux capsules de C. neoformans. De plus, nous avons déterminé si ces particules conjuguées à des anticorps pouvaient être utilisées comme nanocapteurs lors de l'imagerie CT ciblée de cellules de C. neoformans in vitro. Nous avons observé que les images CT de cellules de C. neoformans dispersées dans PBS apparaissaient assez similaires aux images dérivées de cellules de C. neoformans dispersées dans l'eau. Cependant, il est difficile de distinguer les images de champignons des tissus mous. Un anticorps peut induire une agrégation bien plus grande des GNR en se liant à la surface des cellules de C. neoformans, résultant en des valeurs d'atténuation bien plus élevées que jamais. Ainsi, nous pouvons réussir à obtenir une atténuation des rayons X distincte des champignons. Basé sur nos résultats, la détection de C. neoformans par imagerie CT pourrait être réalisée et apporter de nouvelles opportunités en diagnostic.

Les GNR ont été largement employés pour la thérapie photothermique des tumeurs. Notre étude indique que les GNR-SiO₂-Ab pourraient être un outil sélectif pour détruire les cellules de C. neoformans. Nos résultats ont confirmé que la membrane cellulaire des cellules de C. neoformans subissait une destruction irréparable et grave après irradiation par NIR. De plus, la viabilité des cellules a diminué significativement par rapport aux cellules non traitées. Ces résultats indiquaient que le rayonnement NIR seul cause la mort des cellules de C. neoformans. Cependant, la viabilité des cellules incubées avec GNR-SiO₂-Ab avait également été déprimée. Dans les cellules incubées avec GNR-SiO₂-Ab et soumises à l'irradiation NIR, la viabilité des cellules a diminué significativement par rapport aux autres groupes. Nous nous assurons que les GNR-SiO₂-Ab conjugués avec les champignons sélectivement et amélioraient les effets du rayonnement NIR. Les GNR-SiO₂-Ab ont la capacité d'effets de thérapie photothermique sélectifs sur les cellules de C. neoformans. Le mécanisme de l'effet n'a pas été rapporté auparavant. Nous spéculons que la perturbation de la membrane cellulaire a été probablement induite par la mort cellulaire induite par irradiation. Norman et al. ont rapporté que la viabilité de Pseudomonas aeruginosa était réduite significativement lorsque cette espèce était exposée à l'irradiation et liée avec des nanobâtonnets d'or, qui étaient covalentement conjugués avec des anticorps spécifiques. Ces cellules montraient également des zones de membrane cellulaire gravement perturbée avec des dommages irréparables, causés par l'exposition à l'irradiation NIR. Lorsque les nanoparticules étaient exposées au rayonnement NIR, la membrane cellulaire était endommagée en raison de plusieurs facteurs, incluant l'explosion de nanoparticules, les ondes de choc, la formation de bulles, et la désintégration thermique.

Dans cette étude, la mort ou l'activité réduite des cellules de C. neoformans s'est produite lorsque la membrane cellulaire a été désintégrée et détruite par l'énergie thermique. Cependant, d'autres études devraient être menées pour confirmer cette hypothèse. Les cellules de C. neoformans sont endommagées par les facteurs suivants : augmentations localisées de température, explosion de nanoparticules, ondes de choc, formation de bulles, et désintégration thermique causée par le rayonnement NIR. En particulier, les cellules de C. neoformans étaient substantiellement endommagées lorsqu'elles étaient exposées au seul rayonnement NIR. Il y a deux raisons possibles pour expliquer comment les GNR-SiO₂-Ab ciblés stimulent le rayonnement NIR en provoquant la destruction photothermique des cellules de C. neoformans. Une possibilité est que dans la capsule des cellules de C. neoformans, les GNR-SiO₂-Ab ciblés induisent une augmentation localisée de température. La seconde possibilité est qu'en raison d'une réaction antigène-anticorps entre les GNR-SiO₂-Ab et la capsule des cellules de C. neoformans, il y a des changements structuraux dans la paroi cellulaire et la capsule. En raison de tels changements, les cellules seraient plus sensibles au traitement photothermique. Des études précédentes ont confirmé la faible toxicité des nanobâtonnets d'or, et d'autres études seront nécessaires pour investiguer l'effet de la thérapie photothermique in vivo. Le plus regrettable de notre étude est que nous n'avons pas discuté la capacité de charge des GNR-SiO₂-Ab. Une étude future se concentrera sur la relation entre la capacité de charge des GNR-SiO₂-Ab et l'effet photothermique.

Conclusions

Nous avons fabriqué avec succès des GNR-SiO₂-Ab, qui étaient ciblés vers les cellules de C. neoformans. Ces nanobâtonnets d'or conjugués à des anticorps spécifiques ont amélioré l'atténuation des rayons X des cellules de C. neoformans dans les images CT. Nos résultats indiquaient que les GNR immunisés, médiatisés par des anticorps, augmentaient les effets de la thérapie photothermique induite par NIR dans les cellules de C. neoformans. De plus, les GNR-SiO₂-Ab permettaient une manipulation facile et des procédures minimalement invasives dans le diagnostic et le traitement des infections à C. neoformans, se concentrant sur l'application clinique potentielle de cette approche.