Synthèse inspirée par la biominéralisation de nanoparticules carbonées dopées au cérium pour une activité de piégeage des radicaux fortement hydroxyles

Contexte

L'inflammation continue et dérégulée est considérée comme une étape commune de nombreux processus pathologiques [1]. Le stress oxydatif a été retrouvé dans de nombreuses maladies cliniques où les ROS ont une expression beaucoup plus élevée que l'élimination des enzymes antioxydantes [2,3,4], qui est finalement définie comme un déséquilibre entre les performances oxydatives et anti-oxydantes. Les ROS hautement réactifs ont tendance à produire des radicaux libres (y compris le superoxyde (O₂ ⁻ ), HO_2ˋ et hydroxyle (_ˋ OH)) qui endommagent les macromolécules de l'organisme, telles que les protéines et les acides nucléiques, tandis que la surproduction de ROS fait une différence critique dans les dommages oxydatifs soutenus, entraînant des destructions importantes des structures et des fonctions cellulaires, telles que les infiltrats inflammatoires [5,6 , 7], les dommages des membranes cellulaires et de l'ADN [8, 9], et même l'augmentation de la mort cellulaire. Ainsi, le stress oxydatif joue un rôle clé dans la pathogenèse des maladies macrovasculaires [10,11,12], du cancer et de certaines autres maladies du système nerveux [13]. Par conséquent, c'est un problème important et urgent de contrôler la concentration de radicaux libres d'oxygène réactifs dans les organismes vivants et de les maintenir dans une plage appropriée, ce qui est également fondamental pour diminuer une série d'anomalies oxydatives.

Récemment, des nanoparticules d'oxyde de cérium (CeO₂ NPs) ont attiré beaucoup d'attention en raison de leurs propriétés redox uniques qui ont été largement appliquées dans les domaines de l'énergie, de la catalyse et de la biomédecine [14,15,16]. Surtout, PDG₂ les nanoparticules ont présenté un potentiel énorme en tant qu'antioxydant idéal pour traiter les maladies liées aux ROS dans les applications biomédicales [17, 18]. L'activité antioxydante des nanoparticules de cérium découle de leur capacité à piéger les radicaux libres, tels que le superoxyde (•O ²⁻ ) et les radicaux hydroxyles (•OH), et maintient l'effet antioxydant en tant qu'enzyme pendant une période prolongée [19]. Il est de plus en plus évident que le PDG₂ les nanoparticules ont généralement une structure cristalline de type fluorite et les ions cérium possèdent la capacité de conversion réversible entre la tervalence (3+) et la quadrivalence (4+) [20]. Le switch de Ce ³⁺ à Ce ⁴⁺ les états d'oxydation pourraient éliminer O₂ ⁻ via la superoxyde dismutase (SOD)-mimétiques, et •OH via des réactions redox, tandis que le Ce ⁴⁺ à Ce ³⁺ commutateur supprimer H₂ O₂ via catalase (CAT)-mimétiques [21]. Cependant, les propriétés physiques et chimiques du CeO₂ Les NP peuvent influencer le comportement biologique, y compris sa biodistribution, sa pharmacocinétique, sa toxicité, sa dissolution et son élimination [22]. Compte tenu de l'hypothèse qu'elle est bien établie sur la chimie superficielle des CNP dopés au Ce, l'utilisation biologique des CNP dopés au Ce comme approche thérapeutique doit encore être largement explorée [23, 24].

Cette étude se concentre sur le développement de nouvelles nanoparticules à base de cérium (appelées CNP dopés au Ce) avec une excellente biocompatibilité en utilisant une voie synthétique simple et verte et explore plus avant leur faisabilité en tant qu'agent antioxydant pour des applications biomédicales. Une série de méthodes a été employée pour caractériser les propriétés physiques et chimiques des CNP dopés au Ce. Encouragés par les performances favorables, nous avons en outre vérifié la biocompatibilité des CNP dopés Ce préparés et les avons utilisés comme réactifs antioxydants pour éliminer les radicaux libres d'oxygène en utilisant H₂ O₂ modèle induit. Enfin, le mécanisme antioxydant des CNP dopés au Ce a été révélé à partir de la voie de l'apoptose cellulaire en utilisant la coloration fluorescente des morts vivants et la cytométrie en flux. Cette étude fournira un nouveau capteur de ROS efficace pour atténuer les dommages causés par le stress oxydatif dans des conditions pathologiques.

Section expérimentale

Matériaux et réactifs

L'albumine de sérum de taureau (BSA), le diacétate de fluorescéine (FDA) et l'iodure de propidium (PI) ont été achetés auprès de Sigma (New York, NY, USA). Le sérum bovin fœtal (FBS) et le milieu essentiel minimum de Dulbecco (DMEM) ont été achetés auprès d'Invitrogen China Limited (Shanghai, République populaire de Chine). Ce (NON₃ )₃ ·6H₂ O, violet de méthyle (MV) et sulfate ferreux heptahydraté (FeSO₄ ^. 7H₂ O) ont été achetés auprès d'Aladdin Reagent Corporation (Shanghai, République populaire de Chine) et le peroxyde d'hydrogène (30 %) a été obtenu auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Pékin, République populaire de Chine). Tous les produits chimiques étaient des réactifs analytiques et ont été utilisés sans autre purification. De l'eau déionisée a été utilisée dans les expériences.

Synthèse de nanoparticules d'oxyde de cérium

Les CNP dopés Ce ont été préparés en appliquant une légère modification de la méthode de bio-minéralisation à base d'album comme décrit dans le document [24]. Le processus de synthèse est illustré comme suit :1,25 g de BSA ont été dissous dans 50,0 mL d'eau désionisée et constamment agités pour former la solution transparente. Ensuite, la solution de précurseur métallique 300 mM Ce (NO₃ )₃ ·6H₂ O ont été ajoutés lentement sous agitation vigoureuse, respectivement. Simultanément, du NaOH 2,0 M a été dissous dans 50 ml d'eau désionisée, qui a été utilisée pour ajuster la valeur du pH du mélange. La solution comprenant du NaOH qui doit être ajoutée lentement mérite d'être étudiée. Des CNP dopés au Ce pourraient être formés après agitation énergique à PH 12 à 55 °C. Un temps de réaction suffisant pour la formation de CNP dopés au Ce était d'environ 8 h ; le système était composé de brun, se refroidissant naturellement à la température ambiante. La suspension supplémentaire a été filtrée avec une membrane de 0,22 µm (polyéther sulfone) pour épuiser ces agglomérations à grande échelle. La première solution a finalement été dialysée contre de l'eau pendant 3 jours dans un sac de dialyse avec un poids moléculaire de coupure de 14 kDa. La solution de dialyse recueillie a été lyophilisée en utilisant un lyophilisateur sous vide. Les poudres de CNP dopées Ce ont finalement été obtenues et conservées pour la caractérisation ultérieure.

Instruments et caractérisation des nanoparticules d'oxyde de cérium

Les morphologies des CNP dopés au Ce ont été examinées par microscopie électronique à transmission (MET) sur un microscope JEM-2100 (JEOL, Tokyo, Japon) sous une tension d'accélération de 200 kV. La distribution des tailles a été étudiée par le logiciel ImagingJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Les structures chimiques des CNP dopés au Ce ont été analysées à l'aide d'un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) (Nicolet Nexus 470, GMI et Ramsey, MN, USA). La composition élémentaire a été déterminée par analyse élémentaire effectuée via une spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS). L'analyse par diffraction des rayons X (XRD) a été réalisée sur un diffractomètre Rigaku D/MAX-2000 (Japon) fonctionnant à 40 kV et 100 mA, avec une fente de 0,5° et une vitesse de balayage de 7° min ⁻¹ , équipé d'une source de rayonnement Cu Kα (λ = 0.15418 nm). Les spectres d'absorbance UV-Vis ont été enregistrés à l'aide d'un spectrophotomètre UV-2550 UV-Vis (Shimadzu, Kyoto, Japon).

Expériences photométriques UV-vis

La performance antioxydante du CNP dopé au Ce et l'activité de piégeage des radicaux libres ont été évaluées par des expériences photométriques UV-vis. Les solutions de MV ont été préparées dans de l'eau désionisée à une concentration de 3,0 × 10 ⁻⁴ M. Et 0,15 mM FeSO₄ ^. 7H₂ O a été dissous comme alternative. La solution en suspension de CNP dopés au Ce a été réservée pour une utilisation à des concentrations de 10 μM en dispersant dans un tampon Tris-HCl 0,1 M à pH 5,0. De manière appropriée, le traitement par ultrasons peut améliorer la solubilité des CNP dopés au Ce. Les solutions de réaction pour la photométrie embrassaient 3,0 × 10 ⁻⁵ M MV, 0,15 mM FeSO₄ ^. 7H₂ O, 1,0 M H₂ O₂ , 0,1 M de tampon Tris-HCl (pH 5,0) et 0,17 mM de CNP dopés Ce pour atteindre un volume requis de 10 mL (solution de mélange de MV/FeSO₄ ^. 7H₂ O/H₂ O₂ /PDG₂ ) en finale. L'absorbance de la solution réactionnelle a pu être mesurée après incubation pendant 5 min à température ambiante.

Cytotoxicité des nanoparticules d'oxyde de cérium

La viabilité cellulaire des CNP dopés au Ce a été évaluée sur des cellules VSMC et 7721 par le test CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japon) basé sur l'anneau tétrazolium clivé et la descente du sel de tétrazolium hydrosoluble de la quantité de colorant formazan par les déshydrogénases dans les cellules vivantes. En bref, VSMC et 7721 cellules (1,5 × 10 ⁴ cellules par puits) ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits avec cinq répétitions pour chaque groupe. Après éclosion pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO₂ et la densité cellulaire avait atteint 80% de confluence, le milieu de croissance a été remplacé par du DMEM frais contenant différentes concentrations (0, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 μg/ml) de solution de CNP dopé Ce et incubé pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS et 10 μL de solution de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits. Ensuite, les plaques à 96 puits ont été incubées pendant encore 4 h à 37 °C et 5 % de CO₂ pour permettre une croissance cellulaire exponentielle. Enfin, l'absorbance de chaque puits a été détectée à une longueur d'onde d'émission de 490 nm en utilisant Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT, USA). Les cellules (dans DMEM) sans traitement ont été utilisées comme contrôle, et la viabilité cellulaire relative (moyenne   ±   erreur standard de la moyenne) a été calculée à l'aide de l'échantillon Abs/contrôle Abs ×   100 %.

Modèle d'analyse de la viabilité cellulaire du peroxyde d'hydrogène in vitro

Comme une sorte d'oxygène actif oxydant puissant, le peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂ ) est facile à traverser la membrane cellulaire et réagit avec les ions de fer intracellulaires pour former des radicaux libres hautement réactifs selon la théorie de Fenton, conduisant à une chaîne de changements. Parallèlement, les variétés de stress oxydatif cellulaire induit par H₂ O₂ sont directement impliqués dans le processus d'apoptose. Par conséquent, 30% H₂ O₂ a été choisi pour simuler l'apoptose des cellules dans cette étude, qui peut également être utilisé pour être un IC₅₀ modèle pour étudier plus avant l'effet protecteur des CNP dopés au Ce sur les dommages oxydatifs. Sur la base de la discussion ci-dessus, les cellules VSMC et 7721 ont été initialement ensemencées à une densité de 1,5 × 10 ⁴ cellules/puits dans les plaques à 96 puits. Une fois les cellules adhérentes, elles ont continué à être cultivées pendant 24 h supplémentaires. Et la préparation fraîche 30% H₂ O₂ a été ajouté à chaque puits avec des concentrations différentes (50, 100, 200, 400, 800 umol/ml) pour stimuler la croissance des cellules. Après une éclosion de 4 h et un lavage ultérieur avec du PBS, 10 μL de solution de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits pendant 4 h à 37 °C dans une solution à 5 % de CO₂ incubateur_. Le lecteur de microplaques multimode Synergy HT (Bio-Tek, Winooski, VT, USA) a été utilisé pour déterminer la valeur absorbante de chaque puits à 490 nm. Le pourcentage d'activité cellulaire était considéré comme l'indice de l'effet de sur la viabilité cellulaire, qui dépendait de la mesure du taux de survie cellulaire par rapport à celui du témoin.

Induction d'apoptose et test de viabilité cellulaire in vitro

De la même manière, des cellules VSMC et 7721 ont été ensemencées dans les plaques 96 puits et cultivées. Le lendemain, les cellules ont été prétraitées avec différentes concentrations de CNP dopés au Ce (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 et 400 μg/ml) environ 24 h et exposées à la préparation fraîche 30 % H₂ O₂ avec la concentration appropriée dans chaque puits. D'autre part, il devrait être défini un groupe vide sans 30% H₂ O₂ et CNPs dopés Ce et le groupe de contrôle était uniquement avec H₂ O₂ solutions. Chaque groupe a été mis en place six parallèles. Après un traitement de 4 h et un lavage ultérieur avec du PBS, le test CCK-8 a été utilisé pour mesurer les conditions d'apoptose des cellules dans chaque puits à une densité optique de 490 nm, comme décrit ci-dessus.

Test de coloration mort-vivant et cytométrie en flux

Pour évaluer le potentiel d'effet antioxydant des CNP dopés au Ce, 7721 cellules ont été cultivées sur des plaques à six puits avec 4,0 × 10 ⁴ cellules dans 100 ul de milieu par puits et laissées se développer pendant 24 h. Ensuite, six groupes ont été configurés pour être en contraste simultané ; il comprenait le contrôle, H₂ O₂ groupe, 50μg/mL CNPs dopés Ce + H₂ O₂ , 100μg/mL CNPs dopés Ce + H₂ O₂ , 200μg/mL CNPs dopés Ce + H₂ O₂ , et 400 μg/mL de CNP dopés Ce + H₂ O₂ . Alors que les cellules avaient augmenté à 80 % dans chaque groupe, le premier groupe a été exposé à des conditions de croissance normales sans H₂ O₂ et les CNP dopés au Ce ; le deuxième groupe vient d'être incubé avec le H₂ sélectionné O₂ sans CNP dopés au Ce pendant 4 h, c'est-à-dire sans traitement ; le troisième groupe au sixième groupe contenait différentes concentrations de CNP dopés au Ce (50, 100, 200 et 400 μg/mL) et indiquaient H₂ O₂ incubation pendant 4 h, respectivement. Après cela, un tampon de travail FDA et PI a été utilisé pour la coloration cellulaire (Calcein AM/Ethidium Homodimer, Invitrogen). La fluorescence des cellules colorées a été observée au microscope à fluorescence; les cellules vivantes étaient de couleur verte et les cellules mortes de couleur rouge.

En outre, le kit d'apoptose d'annexine V-FITC/iodure de propidium (PI) a été utilisé pour quantifier le taux d'apoptose cellulaire par double coloration par fluorescence. En bref, 7721 cellules ont été pré-cultivées dans des plaques de culture à six puits selon les étapes ci-dessus pendant 24 h, jusqu'à la croissance adhérente des 7721 cellules. Après cela, les cellules avec différentes doses de mesures de traitement ont été récoltées et lavées trois fois avec du PBS à 4 °C dans chaque groupe. Il a été remarqué que les cellules doivent être doucement digérées, collectées et centrifugées, suivies de 2000 tr/min pendant 5 minutes. Par la suite, les cellules ont été remises en suspension avec 500 μl de tampon de liaison et ajustées à une concentration de 1 x  10 ⁶ cellules/ml. Ensuite, la suspension cellulaire a été introduite dans un tube à flux coloré avec 5 μl d'Annexine V-FITC et 5 μl de 20 μg/ml de solution PI, respectivement. Avant l'incubation du mélange à température ambiante pendant 15 min, il faut ajouter 500 μl de PBS dans le tube de réaction. Enfin, les résultats expérimentaux ont été détectés en utilisant la méthode Annexin-V sur un système de cytomètre en flux Beckman Coulter Epics XL MCL (BD Accuri C6), et le pourcentage de cellules apoptotiques a été clarifié par analyse logicielle (Flowjo 7.6.2).

Analyse statistique

Toutes les données expérimentales ont été exprimées en tant que moyenne   ± erreur standard de la moyenne. Pour la comparaison des différents groupes, une technique statistique d'ANOVA avec le test post hoc de différence la moins significative (LSD) a été appliquée pour analyser les données qui ont été obtenues. Un P valeur inférieure à 0,05 (P < 0,05) a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation des nanoparticules d'oxyde de cérium

Dans cette étude, les dispersions aqueuses de CNP dopés Ce ont été obtenues en utilisant Ce (NO₃ )₃ ^. 6H₂ O et BSA comme précurseurs par une méthode synthétique inspirée de la biominéralisation. Au cours de la préparation, le BSA utilisé comme principal matériau source de carbone peut intégrer les ions métalliques aux nanoparticules métalliques en raison de leur structure spatiale unique et de la flexibilité de leur chaîne moléculaire. En d'autres termes, les nanoparticules dopées en métal préparées sont principalement composées d'une charpente carbonée et d'un élément métallique chargé, qui peuvent être différents des nanoparticules de cérium inorganiques conventionnelles [25]. L'examen morphologique a été caractérisé par microscopie électronique à transmission (MET) et les tailles de particules résultantes ont été analysées par le logiciel ImagingJ. La figure 1a a montré des images MET caractéristiques des CNP dopés au Ce résultants. Ces images reflétaient le fait que les CNP dopés au Ce possédaient une structure polygonale, une dispersion uniforme et une forme discrète sans agrégation apparente. L'analyse statistique a indiqué que les CNP dopés au Ce avaient une distribution de taille étroite avec un diamètre moyen de 14,7 ± 0,8 nm (Fig. 1b), ce qui était cohérent avec les images MET. Lorsque les CNP dopés au Ce étaient dans l'eau pendant quelques jours, on peut constater qu'il n'y a pas eu de précipitation et qu'ils conservent toujours l'indication de solutions homogènes, indiquant leur stabilité à long terme en solution aqueuse, ce qui pourrait être bénéfique pour les applications biomédicales suivantes .

un Images MET pour les CNP dopés Ce. L'encart montrait une image TEM à haute résolution. b La distribution des diamètres des CNP dopés Ce

Illustration schématique de la conception des CNP dopés Ce

La structure chimique et la composition de surface des CNP dopés Ce

Les groupes fonctionnels de surface et la composition des CNP dopés au Ce ont été étudiés à l'aide d'un modèle de spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) et d'un spectre infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR). XPS a été utilisé pour caractériser l'état d'oxydation des ions cérium à la surface des échantillons. Le spectre XPS de l'enquête (Fig. 2a) a montré trois pics prédominants à 902,0, 285,0 et 531,8 eV, qui indiquaient l'existence d'éléments cérium, carbone et oxygène des CNP dopés Ce. Les signaux de soufre (S 2p) à 164,0 eV suggèrent que la BSA a été conjuguée avec succès aux CNP dopés au Ce. La coexistence de Ce(III) et de Ce(IV) dans les catalyseurs CNPs dopés Ce pourrait être mise en évidence par le spectre de la Fig. 2b. Le spectre haute résolution de Ce3d (Fig. 2b) pourrait se diviser en Ce3d₃ et Ce3d₅ (résultant d'une séparation spin-orbite de 32 eV), présentait la présence de pics indexés et forts, situés respectivement à 882,0, 884,0 et 902,0 eV. Les signaux Ce3d étaient principalement divisés en O₂ , 3d_5/2 , et 3d_3/2 , les pics entre 875 et 895 eV appartenaient au Ce3d_3/2 niveau, qui a presque coïncidé avec le spectre de précédemment publié [26]. De plus, le spectre XPS impliquait également les 15,99 % de Ce3d. Ces observations sont en accord avec les résultats de la littérature pour CeO₂ nanoparticules [25]. Le spectre C1s illustré à la Fig. 2c a été décrit par trois pics majeurs à 285,0, 287,8 et 288,9 eV, ce qui impliquait respectivement que CeO₂ les nanoparticules ont été fonctionnalisées avec les niveaux d'énergie 1s, C=O, C−F et COOR de C. La présence du spectre O1s comme le montre la Fig. 2d était dominée par deux pics majeurs à 530,5 et 531,8 eV, qui correspondaient à la lien entre O₂ ⁻ et Ce ³⁺ .

un Spectres XPS des CNP dopés Ce. Spectre d'enquête. b Spectre Ce3d. c Spectre C1. d Spectre O1s

Une analyse FTIR a en outre été effectuée pour vérifier la formation de CNP dopés au Ce dans le processus de réaction. Comme le montre la figure 3A, pour les CNP dopés au Ce, un pic intense et large est apparu à 3 400 cm ⁻¹ , qui a été causée par la vibration d'étirement de O–H et pourrait être attribuée à la vibration de flexion de l'eau absorbée. Le pic caractéristique à 1510 cm ⁻¹ pourrait être décrit comme l'étirement antisymétrique –O–C–O, tandis que le pic à 1450 cm ⁻¹ pourrait être attribué à la vibration d'étirement symétrique de –O–C–O, qui ont toutes deux démontré la présence de groupes nitrate. De plus, une bande d'absorption en 451 cm ⁻¹ a été attribué au tronçon asymétrique Ce-O, indiquant la formation de CNP dopés Ce. Ces résultats ont montré que les groupes fonctionnels des CNP dopés Ce contenaient principalement certains −OH et –COO ⁻ groupes.

Un spectre FTIR de BSA et de CNP dopés Ce. B Modèle XRD des CNP dopés Ce. C Spectres d'absorption UV-Vis des CNP dopés au Ce. D Spectres d'absorption UV-Vis du violet de méthyle (MV) après divers traitements. un MV, b MV traité avec H₂ O₂ et CNP dopés Ce, c MV traité avec FeSO₄ et H₂ O₂ , et d MV traité avec FeSO₄ , H₂ O₂ , et des solutions de CNP dopées Ce à un temps d'incubation de 5 min

Selon l'analyse par diffraction des rayons X (XRD), la structure cristalline des CNP dopés Ce a été étudiée. Comme le montre la figure 3B, il existe quatre pics de diffraction principaux à 24,4°, 30,3°, 35,23° et 43,2°. L'un de ces pics à 24,4° peut être attribué à la structure carbonée inorganique produite, qui est similaire aux points quantiques de carbone et aux pics caractéristiques du graphite rapportés [27,28,29]. Par rapport à la structure cristalline ordonnée du graphite (002 plans, 2θ = 26,5°), le pic de diffraction des CNP dopés Ce autour de 24,4° avec un décalage plus faible devient faible, ce qui peut être attribué au carbone fortement désordonné et à l'augmentation de la sp ² (C–C) espacement des couches dans le processus de carbonisation [30]. Les pics de diffraction à des angles de 30,3°, 35,23° et 47,42° correspondent principalement aux plans (111), (200) et (220), respectivement, des nanoparticules d'oxyde de cérium conventionnelles. De plus, d'autres pics aux angles de 56,30°, 69,00°, 75,57° et 78,99° correspondaient à (311), (400), (331) et (402) de l'oxyde de cérium référencé (JCPDS 2004 36-1253). L'espacement correspondant \( \left(\mathrm{Fm}3\overline{\mathrm{m}}\right) \) a été calculé selon la loi de Bragg (la longueur d'onde de la loi Cu-Kα est de 0,154 nm). Ces résultats pourraient confirmer de manière préliminaire les CNP dopés au Ce avec la structure cristalline hybride.

Il était bien connu que Fe ²⁺ peut alternativement catalyser la dismutation du peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂ ) en un autre radical hydroxyle réactif selon la réaction de Fenton [31]. En tant que réactif chromogène, la solution de violet de méthyle présente principalement du violet. Ciblé avec –C=C–, le radical hydroxyle peut réagir avec le violet de méthyle, donnant au MV une couleur peu profonde voire incolore, et son absorbance UV-Vis maximale à 582 nm diminue [32]. Selon notre conception, les CNP dopés Ce peuvent certainement éliminer le radical hydroxyle, enfin augmenter l'absorbance de la VM à 582 nm.

Pour confirmer la capacité sous-jacente de piégeage des radicaux libres pour les CNP dopés au Ce, les spectres d'absorption UV-Vis de MV ont été utilisés pour fournir quelques informations. Il n'y avait pas d'absorbance significative de 500 à 700 nm dans la solution aqueuse de CNP dopés Ce sur la figure 3C. Cependant, nous avons pu observer l'absorbance maximale du violet de méthyle à environ 582 nm et l'absorbance a été inhibée sous H₂ O₂ traitement (Fig. 3D). Lors de l'ajout de CNP dopés au Ce dans la solution de mélange, l'absorbance a été évidemment récupérée, ce qui a prouvé que les CNP dopés au Ce avaient la capacité d'éliminer le radical hydroxyle et de protéger le MV contre les attaques dans ces conditions expérimentales. Ces résultats auront d'autres applications biomédicales dans le traitement des maladies causées par les radicaux libres.

Dosage de cytotoxicité des nanoparticules d'oxyde de cérium in vitro

Avant d'appliquer des CNP synthétisés dopés au Ce pour traiter des maladies associées au stress oxydatif, il est essentiel d'évaluer leur biocompatibilité. Dans cette étude, l'effet des CNP dopés Ce sur la viabilité cellulaire a été évalué via l'incubation de cellules VSMC et 7721 avec des CNP dopés Ce à l'aide de tests de viabilité cellulaire du test CCK-8. On peut voir que la viabilité cellulaire n'a pas montré de changements significatifs après un traitement à différentes concentrations de CNP dopés au Ce pendant un temps d'exposition de 24 heures (Fig. 4a). Même à la dose la plus élevée de 400 μg/ml, la viabilité cellulaire dans tous les groupes de traitement était d'environ 90 %, démontrant que les CNP dopés au Ce avaient une très légère cytotoxicité sur les cellules. Ces résultats ont mis en évidence la cyto-compatibilité favorable des CNP dopés au Ce et leur ont permis d'être adaptés aux applications biomédicales.

un L'effet de diverses concentrations de CNP dopés Ce sur la viabilité cellulaire des cellules VSMC et 7721 par CCK-8. Les cellules ont été prétraitées avec des CNP dopés au Ce à différentes concentrations pendant 24 h, puis ont été administrées par H₂ O₂ à différents dosages. b Viabilité cellulaire des CMLV et c 7721 cellules cultivées avec différentes concentrations de CNP dopés Ce sous 560 μM H₂ O₂ -stress oxydatif induit par le dosage CCK-8

Propriétés antioxydantes et activité de piégeage des radicaux libres des CNP dopés Ce in vitro

La propriété d'enzyme mimétique des nanomatériaux d'oxyde de cérium est propice à leurs applications thérapeutiques potentielles. On a examiné si les CNP dopés au Ce en solution protégeraient suffisamment les cellules VSMC et 7721 contre les radicaux libres. Pour ces études, H₂ O₂ a été utilisé pour induire la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui entraînent une altération ou la mort des cellules. Premièrement, l'IC₅₀ La valeur de la viabilité cellulaire a été déterminée pour explorer l'effet protecteur des CNP dopés au Ce. La viabilité des cellules VSMC et 7721 présentait la faible valeur après l'ajout de H₂ O₂ . Une tendance à l'augmentation de l'activité apoptotique pour les CMLV et les cellules 7721 a été observée avec l'augmentation de H₂ O₂ concentration en solution (Fig. 4b). En d'autres termes, l'élévation des ROS était dose-dépendante, ce qui a également révélé la dose létale médiane (LD₅₀ ) de VSMC et 7721 cellules était d'environ 549 et 556 umol/ml, respectivement. En conséquence, le LD₅₀ H₂ O₂ via le stress oxydatif était de 560 μM, ce qui était proche des résultats de la littérature [33].

Ensuite, l'effet antioxydant des CNP dopés Ce sous LD₅₀ de H₂ O₂ a été testé à l'aide d'un test du kit de comptage cellulaire-6 (CCK-8). En raison de leurs propriétés électroniques uniques, les CNP dopés Ce ont une tendance inhérente à exister dans des états d'oxydation double (Ce ³⁺ et Ce ⁴⁺ ) et se voient conférer une activité antioxydante via un comportement d'oxydoréduction. Lorsque ROS existe, Ce ⁴⁺ peut être commuté en continu sur Ce ³⁺ ainsi que l'activité persistante de piégeage des radicaux libres [34, 35]. Comme le montre la figure 4c, ces résultats impliquaient que la viabilité cellulaire des cellules VSMC et 7721 avait été progressivement améliorée avec l'augmentation de la concentration de CNP dopés au Ce sous le même stress oxydatif. En particulier, la viabilité cellulaire a été récupérée d'environ 88,0 % à la concentration de CNP dopé Ce de 400 μg/ml. Par conséquent, les CNP dopés au Ce ont présenté un effet antioxydant exceptionnel d'une manière dose-dépendante via une capacité efficace de piégeage des radicaux libres.

La coloration des morts vivants et le test de cytométrie en flux ont été utilisés pour découvrir davantage l'effet cyto-antioxydant des CNP dopés au Ce. Comme le montre la Fig. 5, une fluorescence verte intense sans rouge a été observée dans les 7721 cellules traitées avec des CNP simples dopés au Ce, mais une grande fluorescence rouge a pu être observée dans le H₂ O₂ traitement de 556 uM, qui a démontré H₂ O₂ pourrait induire considérablement l'apoptose cellulaire. Mais H₂ O₂ -l'apoptose induite avait été progressivement atténuée avec l'augmentation des concentrations de CNP dopés au Ce. En particulier, seule une petite quantité de fluorescence rouge a pu être observée après un traitement CNP dopé Ce de 400 μg/ml sous H₂ O₂ -un stress oxydatif induit qui indique une viabilité cellulaire plus élevée. Un test de cytométrie en flux a été effectué pour étudier l'effet antioxydant des CNP dopés au Ce. Dans le nuage de points de la cytométrie en flux variable double, le signal d'émission d'Annexine-V-FITC a été tracé sur le x -axis, tandis que le signal d'émission PI a été tracé sur le y -axe. Plusieurs régions cellulaires ont été définies comme suit :l'annexine V-/PI––sont considérées comme des cellules vivantes, l'annexine V+/PI––est synonyme de cellules d'apoptose précoce et l'annexine V+/PI+––représente des cellules d'apoptose/nécrose tardives. Comme le montre la figure 6, le groupe témoin présentait une fraction faible et normale d'apoptose tardive des cellules de 1,45 %, mais H₂ O₂ Le traitement a montré un taux extrêmement élevé d'apoptose tardive cellulaire de 46,4 %. Comme nous l'avions prévu, la proportion de cellules apoptotiques traitées par différentes concentrations de CNP dopés Ce a une tendance à la baisse progressive. Comparé à 46,4% d'apoptose cellulaire tardive sous le H₂ O₂ traitement, le pourcentage d'apoptose a nettement diminué à 24,2, 20,0, 15,1 et 11,2 % après un traitement CNP dopé Ce de 50, 100, 200 et 400 μg/ml. Sur la base des résultats de la coloration des morts vivants et de la cytométrie en flux, il a révélé que les CNP dopés au Ce exerçaient des effets antioxydants favorables contre l'apoptose induite par le stress oxydatif de manière dose-dépendante.

Fluorescent images of 7721 cells incubated with different concentrations of Ce-doped CNPs under H₂ O₂ -induced oxidative stress for 24 h by live-dead staining (scale bars = 50 μm)

Flow cytometry profiles of 7721 cells were examined to determine the percentages of early apoptosis and late apoptosis cells with different treatments

Conclusions

In summary, we reported a novel Ce-doped CNPs with the capability of scavenging free radicals. The preparation method is simple by using one-step synthesis in the bio-mineralization manner. Different from the former surface modification (such as PVP), the as-prepared Ce-doped CNPs exhibited the improvement in biocompatibility and dispersibility in aqueous solution. Furthermore, in vitro studies showed albumin-based bio-mineralization Ce-doped CNPs not only own superoxide dismutase feature but also alleviate the oxidative damage caused by H₂ O₂ , which have a protective effect on cells in this periods of study. Furthermore, the concentration of Ce-doped CNPs plays important roles in the recovery of apoptotic cells. Herein, the novel Ce-doped CNPs have promising biomedical applications in diseases prevention and treatment of oxidative stress-mediated.