Nanoparticules de carbone dopées au cérium synthétisées par voie verte : piégeage supérieur des radicaux hydroxyles pour une thérapie antioxydante

Résumé

Les avancées récentes en nanomédecine ont mis en lumière les nanoparticules d'oxyde de cérium comme de puissants antioxydants. Nous présentons ici une méthode simple et respectueuse de l'environnement qui utilise l'albumine sérique bovine (BSA) pour biominéraliser des nanoparticules carbonées dopées au cérium (Ce-CNPs). Les particules obtenues sont monodisperses, avec un diamètre moyen de 14,7 nm, et présentent de nombreux groupes de surface hydrophiles assurant une dispersion stable à long terme dans les milieux aqueux. Les études de cytotoxicité in vitro (CCK-8) confirment une toxicité cellulaire négligeable sur une large gamme de doses. Face aux espèces réactives de l'oxygène induites par le peroxyde d'hydrogène, les Ce-CNPs font preuve d'une capacité exceptionnelle de piégeage des radicaux hydroxyles, protégeant les cellules musculaires lisses vasculaires et les cellules tumorales 7721 des dommages oxydatifs de manière dose-dépendante. Ces résultats établissent les Ce-CNPs comme des piégeurs de ROS prometteurs, à faible toxicité, pour le traitement des maladies liées au stress oxydatif.

Contexte

Le stress oxydatif, défini comme un déséquilibre entre la production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) et les défenses antioxydantes, sous-tend de nombreuses maladies chroniques, notamment l'athérosclérose, le cancer et la neurodégénérescence. Le radical hydroxyle (•OH), hautement réactif, est particulièrement dommageable, initiant la peroxydation lipidique, la modification des protéines et les cassures des brins d'ADN qui culminent en mort cellulaire et lésion tissulaire. Les stratégies thérapeutiques visant à réduire les niveaux d'ERO, surtout le •OH, suscitent donc un grand intérêt clinique.

Les nanoparticules d'oxyde de cérium (CeO₂ NPs) sont apparues comme de puissants nano-enzymes grâce au cycle redox réversible Ce³⁺/Ce⁴⁺. Cela leur permet de mimer les activités de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT), piégeant respectivement le •O₂⁻ et le H₂O₂. Néanmoins, les CeO₂ NPs conventionnelles nécessitent souvent des revêtements de surface (ex. PVP) pour obtenir une stabilité aqueuse et une biocompatibilité, ce qui peut altérer leurs propriétés intrinsèques. Notre étude contourne cette limitation en incorporant des ions cérium dans un cadre carboné dérivé de la BSA, produisant des Ce-CNPs dotés d'une hydrophilie intrinsèque et d'une performance antioxydante robuste.

Section expérimentale

Matériaux et réactifs

L'albumine sérique bovine (BSA), le diacétate de fluorescéine (FDA) et l'iodure de propidium (PI) provenaient de Sigma (New York, NY, USA). Le sérum fœtal bovin (FBS) et le milieu DMEM (Dulbecco's Minimum Essential Medium) étaient fournis par Invitrogen China Limited (Shanghai). Le nitrate de cérium hexahydraté (Ce(NO₃)₃·6H₂O), le violet de méthyle (MV), le sulfate ferreux heptahydraté (FeSO₄·7H₂O) et le H₂O₂ à 30 % étaient achetés auprès d'Aladdin Reagent Corporation (Shanghai) et de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing). Tous les chimiques étaient de grade analytique et utilisés sans purification supplémentaire ; l'eau déionisée était employée tout au long.

Synthèse des nanoparticules carbonées dopées au cérium

Les Ce-CNPs ont été préparés via une voie de biominéralisation adaptée de la synthèse templatée par BSA rapportée par Wang et al. En bref, 1,25 g de BSA étaient dissous dans 50 mL d'eau déionisée sous agitation continue pour former une solution limpide. Une solution de Ce(NO₃)₃·6H₂O à 300 mM était ensuite ajoutée goutte à goutte en maintenant une agitation vigoureuse. Simultanément, du NaOH 2,0 M était introduit lentement pour porter le pH à 12. Le mélange était agité à 55 °C pendant 8 h, donnant une suspension brune qui refroidissait à température ambiante. Le produit était filtré sur membrane PES 0,22 µm pour éliminer les gros agrégats, dialysé contre l'eau (COPM 14 kDa) pendant 3 jours, et lyophilisé sous vide. La poudre résultante était stockée pour caractérisation ultérieure.

Techniques de caractérisation

La microscopie électronique à transmission (MET, JEOL JEM-2100) a fourni des données morphologiques à 200 kV. Les distributions de taille étaient calculées avec ImageJ (NIH). La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR, Nicolet Nexus 470) et la spectroscopie photoélectronique X (XPS, PHI 5000) identifiaient les groupes fonctionnels de surface et les états d'oxydation. La diffraction des rayons X (DRX, Rigaku D/MAX-2000) confirmait les phases cristallines. Les spectres d'absorption UV-Vis (Shimadzu UV-2550) étaient enregistrés pour les études en solution.

Essai photométrique UV-Vis de piégeage des radicaux

Les Ce-CNPs (10 µM) étaient dispersés dans du Tris-HCl 0,1 M (pH 5,0) et soniqués pour améliorer la solubilité. Un mélange réactionnel contenant 3,0 × 10⁻⁵ M MV, 0,15 mM FeSO₄·7H₂O, 1,0 M H₂O₂ et la suspension de Ce-CNPs (0,17 mM) était préparé dans un volume de 10 mL. Après 5 min à température ambiante, l'absorbance à 582 nm était mesurée pour quantifier la récupération du MV, reflétant le piégeage des radicaux hydroxyles.

Essai de viabilité cellulaire (CCK-8)

Les cellules VSMC et 7721 (1,5 × 10⁴ cellules/puits) étaient ensemencées dans des plaques à 96 puits et cultivées jusqu'à ~80 % de confluence. Après 24 h, le milieu était remplacé par du DMEM contenant 0–400 µg/mL de Ce-CNPs, et les cellules étaient incubées 24 h. Le réactif CCK-8 (10 µL/puit) était ajouté et incubé 4 h. L'absorbance à 490 nm était lue sur un lecteur de microplaques Synergy HT ; la viabilité était exprimée en % du témoin non traité.

Modèle de stress oxydatif induit par le peroxyde d'hydrogène

Pour modéliser la lésion oxydative, les cellules VSMC et 7721 étaient exposées à du H₂O₂ à 30 % à des concentrations de 50 µmol mL⁻¹ à 800 µmol mL⁻¹ pendant 4 h. Après traitement, la viabilité cellulaire était évaluée par CCK-8 comme décrit ci-dessus, permettant de déterminer la DL₅₀ du H₂O₂ (≈560 µM).

Essais d'apoptose et de viabilité (coloration Live-Dead)

Les cellules pré-traitées avec des Ce-CNPs (0–400 µg/mL) étaient ensuite mises au défi avec 560 µM H₂O₂ pendant 4 h. La coloration Live-Dead (Calcein-AM/PI) était réalisée sur des cellules 7721 cultivées dans des plaques à 6 puits, et les images de fluorescence étaient capturées au microscope confocal.

Analyse de l'apoptose par cytométrie de flux

Après exposition au H₂O₂, les cellules 7721 étaient récoltées, lavées, et marquées avec l'Annexin V-FITC et le PI. Les échantillons étaient analysés sur un cytomètre Beckman Coulter Epics XL MCL ; les pourcentages d'apoptose précoce (Annexin V⁺/PI⁻) et tardive (Annexin V⁺/PI⁺) étaient calculés avec FlowJo 7.6.2.

Analyse statistique

Les données représentent la moyenne ± SEM. Une ANOVA à un facteur suivie du test post-hoc de Tukey était appliquée ; p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Résultats et discussion

Synthèse et morphologie des nanoparticules

La stratégie de biominéralisation a produit des Ce-CNPs hautement monodisperses, comme le montre la MET (Figure 1a). Les particules présentaient une morphologie polygonale, non agrégée, avec un diamètre moyen de 14,7 ± 0,8 nm (Figure 1b). La dispersion aqueuse restait limpide pendant plusieurs jours, indiquant une excellente stabilité colloïdale — un atout majeur pour l'administration biomédicale.

Chimie de surface et état d'oxydation

L'analyse XPS a confirmé la coexistence de Ce³⁺ (≈15,99 %) et Ce⁴⁺, soutenant la nature redox-active des particules (Figure 2b). Le spectre C 1s (Figure 2c) révélait des pics à 285,0, 287,8 et 288,9 eV, correspondant aux groupes C–C, C=O et C–O, tandis que le spectre O 1s (Figure 2d) montrait des pics à 530,5 et 531,8 eV, indiquant des liaisons Ce–O et des hydroxyles de surface. Les spectres FT-IR (Figure 3A) affichaient un large pic d'étirement O–H à 3400 cm⁻¹ et des pics liés aux nitrates à 1510 et 1450 cm⁻¹, confirmant la présence de groupes fonctionnels hydrophiles et l'incorporation réussie des ions cérium.

Les diagrammes DRX (Figure 3B) révélaient des pics caractéristiques d'un réseau hybride carbone-cérium, avec des pics carbone près de 24,4° et des réflexions de céria à 30,3°, 35,23° et 43,2°, confirmant l'intégration réussie du Ce dans le cadre carboné.

Cytotoxicité in vitro

Les essais CCK-8 ont démontré que les Ce-CNPs ne compromettaient pas la viabilité cellulaire jusqu'à 400 µg/mL (Figure 4a). Même à la dose la plus élevée, la viabilité restait supérieure à 90 %, soulignant l'excellente biocompatibilité des particules.

Efficacité antioxydante

Le peroxyde d'hydrogène à 560 µM a été identifié comme la DL₅₀ pour les cellules VSMC et 7721. Un pré-traitement avec les Ce-CNPs améliorait significativement la survie de manière dose-dépendante, 400 µg/mL restaurant la viabilité à ~88 % (Figure 4c). La coloration Live-Dead (Figure 5) montrait une réduction marquée des cellules rouges (PI-positives) avec l'augmentation des Ce-CNPs, confirmant la protection contre l'apoptose oxydative. La cytométrie de flux (Figure 6) quantifiait l'apoptose : le H₂O₂ seul induisait 46,4 % d'apoptose tardive, qui chutait à 24,2, 20,0, 15,1 et 11,2 % avec 50, 100, 200 et 400 µg/mL de Ce-CNPs, respectivement.

Conclusions

Nous avons développé une synthèse verte, en une étape, de nanoparticules carbonées dopées au cérium, hautement dispersibles, biocompatibles, et dotées d'un puissant pouvoir de piégeage des radicaux hydroxyles. Les particules conservent le cycle redox intrinsèque Ce³⁺/Ce⁴⁺, leur permettant de mimer les activités SOD et CAT et de protéger les cellules vasculaires et tumorales des lésions oxydatives induites par H₂O₂. Leur efficacité antioxydante dose-dépendante et leur cytotoxicité minimale positionnent les Ce-CNPs comme des candidats attractifs pour la prévention et le traitement des pathologies liées au stress oxydatif.