Nanoassemblages 5-aminolévulinique-squalène pour la photodétection et le traitement des tumeurs :études in vitro

Contexte

La nanotechnologie médicale a introduit de nouvelles plateformes prometteuses d'administration de médicaments. Ils sont composés de nanomatériaux biocompatibles et biodégradables qui contribuent à améliorer la stabilité chimique et le profil pharmacocinétique des composés pharmacologiquement actifs tout en assurant une libération contrôlée sur le site d'action [1,2,3]. Cependant, seuls quelques systèmes de nanoparticules ont jusqu'à présent atteint le marché. Les principaux pièges des nanoparticules (NP) existantes sont principalement leur faible charge en médicament (généralement moins de 5%) et leur « effet de libération en rafale » qui entraîne une libération prématurée d'une partie importante du médicament avant d'atteindre le site cible. Cela provoque des effets secondaires indésirables et peut entraîner une toxicité et une perte d'activité pharmacologique [4].

Le squalène (SQ) est un triterpène linéaire de formule chimique C₃₀ H₅₀ et un précurseur du cholestérol et d'autres stéroïdes [5]. Dans le corps humain, le squalène est synthétisé dans le foie et dans la peau et transporté par les lipoprotéines de basse densité (LDL) et les lipoprotéines de très basse densité (VLDL) dans le sang [6]. Dans le cadre de la thérapie tumorale, le squalène a montré un fort effet de potentialisation sur certains agents chimiothérapeutiques [7]. Parce qu'il est largement présent dans la nature et sans danger, le squalène a trouvé ses applications dans la technologie pharmaceutique en tant qu'excipient dans la préparation d'émulsions lipidiques pour l'administration de vaccins, de divers composés actifs et de gènes [6, 8, 9]. Le squalène s'est avéré approprié pour la conjugaison covalente à différents médicaments. Les nanosystèmes avancés créés de cette manière incorporent du squalène conjugué à des agents chimiothérapeutiques tels que la gemcitabine [10,11,12], le paclitaxel [13], le cisplatine [14] ou la doxorubicine [15]. Cette approche est appelée "squalénoylation" et implique une stratégie de prodrogue avec la formation de systèmes nano-colloïdaux où le principe actif est lié de manière covalente [16, 17]. Les nanoassemblages à base de squalène (NA) sont formés par l'auto-assemblage de composants fonctionnels dans des milieux aqueux et se caractérisent par une charge médicamenteuse élevée inhérente [18]. Il a été découvert que la squalénoylation améliore la stabilité du médicament et augmente la solubilité des médicaments peu solubles dans l'eau, améliorant ainsi la biodisponibilité et prolongeant la demi-vie du médicament dans la circulation systémique [14, 16]. Dans la plupart des cas, ces NA auto-assemblés présentent une meilleure activité pharmacologique que le médicament parent [16, 19]. De plus, la squalénoylation fournit un moyen de construire des NA contenant à la fois une modalité thérapeutique et une modalité d'imagerie [20]. Des NA théranostiques similaires ont été rapportés par Couvreur et ses collègues en incorporant un agent IRM dans des nanoassemblages de squalénoyl-gemcitabine (SQgem) [14]. Ces types de systèmes multifonctionnels peuvent être d'une importance majeure dans le développement de nouveaux agents théranostiques pour la médecine personnalisée.

Dans le cadre de la théranostique du cancer, l'administration d'une petite molécule d'acide 5-aminolévulinique (5-ALA) (Fig. 1) a conduit à l'utilisation clinique du 5-ALA pour la thérapie photodynamique (PDT) [21,22,23] , le photodiagnostic (PD) [24] et la résection tumorale guidée par fluorescence chez les patients atteints de gliome du cancer du cerveau [25,26,27]. La théranostique est obtenue par le métabolisme du 5-ALA et l'accumulation sélective de protoporphyrine IX (PpIX) dans le tissu cancéreux en raison de la rétro-inhibition contournée du cycle de l'hème [22]. Cependant, l'efficacité du 5-ALA PD et PDT est sérieusement entravée par sa nature zwitterionique à pH neutre trouvé dans la circulation sanguine. Différentes tentatives ont été faites pour améliorer la stabilité et le profil pharmacocinétique du 5-ALA. Les extrémités amino et carboxylique du 5-ALA ont été modifiées par diverses approches [28]. L'estérification du groupe carboxyle du 5-ALA a conduit à l'ester méthylique du 5-ALA (Metvix®) [29] et est utilisé dans le traitement topique de la kératose actinique, du carcinome basocellulaire et de l'acné aiguë. L'ester hexylique de 5-ALA (5-ALA-Hex) (Hexvix®) a obtenu une autorisation de mise sur le marché pour le photodiagnostic (PD) du cancer de la vessie [30, 31] et est exploité expérimentalement pour le traitement du cancer du col de l'utérus et de l'acné sévère [32 ,33,34].

Structures chimiques des éléments constitutifs de NA. 5-ALA (a ), 5-ALA-Hex (b ), le squalène (c ) et 5-ALA-SQ (d )

Cependant, à l'exception de Gliolan™, l'utilisation clinique du 5-ALA et de ses dérivés est principalement limitée à l'administration topique. Cela limite leur utilisation dans des types de cancer plus importants, tels que le cancer du sein, colorectal, du poumon et de la prostate. Les tentatives pour élargir l'utilisation du 5-ALA ont des dérivés sensibles à la phosphatase modifiés aux extrémités amino du 5-ALA qui ont récemment montré une activité très prometteuse [35, 36]. De plus, des tentatives ont été entreprises pour encapsuler le 5-ALA dans différents nanosystèmes, notamment des NA polymériques [37,38,39] ou des liposomes [40,41,42,43] et sa conjugaison dans des dendrimères [44, 45] ou des NP d'or [46 , 47]. Bien que certaines de ces solutions aient contribué à améliorer la stabilité du 5-ALA et son profil pharmacocinétique, aucune des tentatives susmentionnées n'a abouti à un candidat clinique réussi dans le domaine de la nanomédecine contre le cancer.

Le but de ce travail était la conception et la synthèse du bloc de construction conjugué 5-ALA-squalène (5-ALA-SQ) (Fig. 1d) qui s'auto-assemble dans un milieu aqueux et contient une charge médicamenteuse élevée de 5-ALA, une condition préalable pour l'activité pharmacologique dans les cancers. Les NA ont été testés sur deux lignées cellulaires cancéreuses différentes pour leurs capacités de fluorescence PD. Combiné avec des rapports récents de NA à base de squalène exploitant les lipoprotéines plasmatiques pour atteindre un ciblage indirect du cancer [48], cette approche de nanotechnologie 5-ALA étend l'utilisation du 5-ALA pour la PD et la PDT de différents cancers, tels que le cancer de la prostate utilisé dans cette étude .

Résultats et discussion

Synthèse des blocs de construction 5-ALA-SQ

Une stratégie chimique convergente efficace a été utilisée pour synthétiser le bloc de construction 5-ALA-SQ à partir de squalène et de 5-ALA (Fig. 2). 5-ALA a d'abord été protégé à l'extrémité aminée avec N -Groupe protecteur Boc en utilisant des conditions standard. Alcool de squalène induisant un nanoassemblage (3 ) a été synthétisé à partir de squalène en quatre étapes de synthèse selon des procédures décrites dans la littérature [49]. Boc-5-ALA (2 ) et de l'alcool de squalène (3 ) ont ensuite été couplés en présence d'EDC et de DMAP pour donner le dérivé ester protégé (4 ) avec un bon rendement. La déprotection finale de Boc a dû être effectuée dans des conditions acides douces pour éviter une addition électrophile sur l'échafaudage de squalène. Le produit final a été purifié par HPLC en phase inverse pour produire le bloc de construction NA avec un bon rendement.

Synthèse des blocs de construction 5-ALA-SQ. 5-ALA-SQ a été synthétisé en quatre étapes de synthèse en utilisant la synthèse convergente de 5-ALA et SQ

Nanoassemblages 5-ALA-SQ

Afin d'obtenir une administration efficace d'un composé actif par des nanoparticules (NP) sur son site d'action, des paramètres tels que la taille, la forme et la charge de surface des nanoparticules jouent un rôle important et régissent la pharmacocinétique des systèmes de nano-administration dans le corps. 50]. En particulier, la taille des particules régit plusieurs phénomènes pharmacocinétiques tels que la demi-vie des NP dans la circulation systémique, la séquestration par les macrophages et l'extravasation par voie vasculaire fuyante dans le site d'action [51]. La forme et la taille des nanoparticules régulent leur capacité à s'extravaser à travers les fenestrations présentes dans le système vasculaire [50, 51]. La taille et la forme sont également très importantes pour le ciblage actif et l'absorption dans les cellules, car les formes NP et sphériques plus petites ont une surface plus petite, donc des points de contact beaucoup plus limités par rapport aux systèmes nanoparticulaires non sphériques plus grands [51].

L'auto-assemblage du bloc de construction 5-ALA-SQ s'est produit spontanément en milieu aqueux. Les NA ont été formées par nanoprécipitation. Le conjugué 5-ALA-SQ a été dissous dans des solvants organiques et a été ajouté goutte à goutte dans de l'eau. L'évaporation totale des solvants organiques a donné une solution aqueuse de NA. Les NA 5-ALA-SQ étaient monodisperses avec un faible indice de polydispersité de 0,12. Les mesures de mobilité électrophorétique ont donné un potentiel ζ de 36 mV, et la diffusion dynamique de la lumière (DLS) a révélé une distribution monodisperse des NA avec une taille moyenne de 70 nm (Fig. 3). La gamme de tailles NA offre un bon potentiel pour une circulation prolongée dans le sang [50]. Néanmoins, les NA 5-ALA-SQ sont significativement plus petits que les composites SQ précédemment rapportés qui se situent entre 100 et 300 nm, indiquant un arrangement supramoléculaire différent [19].

Caractérisation des NA 5-ALA-SQ. Faible (a ) et élevé (b ) images cryo-MET à grossissement, analyse DLS (c ) et stabilité à 4 °C (d )

La taille plus petite pourrait être due à des groupes amino chargés positivement et à une molécule de 5-ALA relativement petite par rapport à la fraction SQ. Il a été démontré que la variation des petites molécules attachées au squalène introduit des changements dans l'auto-assemblage et le tassement des conjugués composé-squalène, modifiant par conséquent la forme et la taille des NA [16]. Il est possible que le groupe amino fortement chargé positivement du 5-ALA s'oriente vers la masse d'eau tandis que les chaînes lipophiles occupent l'intérieur de ces NA; cependant, la structure supramoléculaire exacte reste à élucider. Malgré leur taille significativement plus petite par rapport aux autres nanocomposites de squalène, les NA présentent une excellente stabilité au stockage, la taille et le PDI restant constants sur plusieurs semaines.

Un autre aspect important des nouveaux NA 5-ALA-SQ est qu'ils atteignent une charge médicamenteuse de 26%, ce qui est élevé par rapport à d'autres systèmes nanoparticulaires 5-ALA rapportés où la charge était beaucoup moins efficace [37, 38, 41]. La charge médicamenteuse est très importante dans l'administration de NP car dans les NP pauvres chargées en médicament, la dose administrée peut ne pas être suffisante pour atteindre la concentration pharmacologiquement active dans les tissus cibles [4]. La charge peut être déterminée par un simple calcul en tenant compte des poids moléculaires du 5-ALA et du 5-ALA-SQ puisque le 5-ALA est lié de manière covalente à l'échafaudage du squalène dans un rapport molaire de 1:1.

Mesures cinétiques de fluorescence PpIX dans les cellules cancéreuses

La formation en fonction du temps de PpIX a été évaluée dans des cellules de cancer de la prostate humaine PC3 et un glioblastome U87MG incubés avec des NA 5-ALA-SQ et 5-ALA-Hex comme référence. La figure 4 présente la formation de PpIX dans des cellules de cancer de la prostate humaine PC3 exposées à des concentrations croissantes de 5-ALA-SQ NA ou de 5-ALA-Hex sur 24 h.

Mesures de fluorescence cinétique de l'accumulation de PpIX dans les cellules PC3. Les cellules ont été incubées avec des concentrations croissantes de 5-ALA-SQ NA (a ) ou 5-ALA-Hex (b )

Des profils de fluorescence PpIX dépendants de la concentration ont été observés pour les NA 5-ALA-SQ. À 1,0 et 2,0 mM, la fluorescence PpIX a augmenté régulièrement sur 24 h tout en atteignant un plateau après 8 h d'incubation pour des concentrations plus faibles. D'autre part, le 5-ALA-Hex a induit la plus forte accumulation de PpIX dans une plage de concentration inférieure comprise entre 0,10 et 0,30 mM, comme indiqué précédemment [35, 52]. Cependant, le 5-ALA-Hex à des concentrations supérieures à 1 mM s'est avéré toxique pour les cellules, ce qui réduit la fluorescence globale observée et entrave son utilisation [36].

Ensuite, une accumulation de PpIX dose-dépendante dans des cellules cancéreuses de glioblastome humain PC3 et U87MG a été réalisée dans le but d'estimer le dosage optimal de NA. L'intensité de fluorescence à 4 et 24 h d'incubation avec les NA 5-ALA-SQ et 5-ALA-Hex est illustrée à la figure 5. Très important, les NA 5-ALA-SQ ont induit la production de PpIX dans les deux lignées cellulaires. De plus, les niveaux de fluorescence maximum sont comparables au contrôle ALA-Hex dans les deux lignées cellulaires. On peut également noter que dans les cellules PC3, les concentrations de 1,0 et 2,0 mM de 5-ALA-SQ NA étaient optimales pour induire la plus forte accumulation de PpIX. Dans les cellules U87MG, il n'y avait pas de différences significatives entre les différentes concentrations de 5-ALA-SQ NA pour des temps d'incubation courts (Fig. 5c). À 24 h, l'accumulation de PpIX s'est avérée dépendante de la concentration de 5-ALA-SQ NA ou de 5-ALA-Hex similaire aux cellules PC3. Une diminution de l'induction de PpIX quelque peu similaire à ALA-Hex a été trouvée après une période d'incubation plus longue à des concentrations plus élevées de 5-ALA-SQ NA qui étaient plus sensibles à la présence de NA.

Courbes dose-réponse. Accumulation de PpIX dépendante de la concentration avec les NA 5-ALA-SQ (bleu) et 5-ALA-Hex (rouge) dans PC3 (a , b ) et U87MG (c , d ) cellules après 4 h (à gauche) et 24 h (à droite) d'incubation

La figure 5 montre qu'à 24 h, les courbes de production de PpIX sont en forme de cloche dans les cellules PC3 et U87MG. Alors qu'une concentration de 1 mM de 5-ALA-SQ NA a induit la plus forte accumulation de PpIX dans les cellules PC3, les cellules U87MG ont toléré des concentrations plus élevées et l'augmentation de la fluorescence de PpIX a été observée jusqu'à 2 mM de 5-ALA-SQ NA. En général, des concentrations plus élevées de 5-ALA-SQ NA étaient nécessaires pour induire efficacement la biosynthèse de PpIX par rapport au 5-ALA-Hex, probablement en raison des différents taux de clivage des liaisons esters dans les cellules cancéreuses. Une diminution de la production de PpIX a été observée lorsque des concentrations supérieures à 1 mM de 5-ALA-Hex étaient utilisées en raison de la toxicité non spécifique du 5-ALA-Hex. Cet effet était beaucoup moins prononcé pour le 5-ALA-SQ où la fluorescence les niveaux n'ont commencé à baisser qu'à la concentration testée la plus élevée (3,3 mM) et des temps d'incubation prolongés (Fig. 5b, d). Cependant, les niveaux de fluorescence étaient similaires pour les deux composés sans aucun décalage de fluorescence observé pour les NA.

Les NA ont également été dosées dans le glioblastome U87MG contre le contrôle 5-ALA qui est commercialisé pour la PD du glioblastome lors d'une résection chirurgicale. La figure 6 présente la fluorescence de la cellule U87MG après 4 et 24 h. Les NA 5-ALA-SQ ont induit une fluorescence significativement plus élevée après 4 h par rapport au 5-ALA, ce qui est très pertinent dans un contexte clinique. À 24 h, le profil de fluorescence se déplace en faveur du 5-ALA à des concentrations plus faibles, car l'absorption lente et active du 5-ALA fournit des quantités suffisantes de 5-ALA dans les cellules. Les NA présentent toujours des niveaux de fluorescence similaires à ceux du 5-ALA à des concentrations optimales de 1,0 et 2,0 mM de NA (Fig. 6b).

Courbes dose-réponse. Accumulation de PpIX dépendante de la concentration dans les cellules U87MG après 4 h (a ) et 24 h (b ) incubation avec 5-ALA-SQ NA (bleu) et 5-ALA (vert)

En pratique clinique, le 5-ALA est administré soit par voie topique, soit par voie orale, mais en raison de sa nature chargée, seule une petite partie de la dose initiale pénètre dans les cellules cibles via des transporteurs peptidiques endogènes comme les transporteurs PEPT1, PEPT2 ou BETA, selon le type de cellule [40, 53]. Des études récentes sur les NA d'un dérivé de SQgem indiquent que l'entrée dans la cellule est régie par la diffusion améliorée par l'albumine de blocs de construction à molécule unique et qu'elle s'est avérée fortement dépendante de la présence de protéines extracellulaires [54, 55]. En outre, les NA fluorescentes rouge lointain que nous avons récemment rapportés ont également démontré une internalisation rapide, et les expériences de cinétique de fluorescence 5-ALA-SQ et les courbes dose-réponse corroborent l'internalisation de la molécule unique et le métabolisme ultérieur efficace pour produire du PpIX fluorescent.

Conclusions

Dans cette étude de preuve de concept in vitro, une stratégie chimique convergente a été utilisée pour synthétiser le bloc de construction 5-ALA-SQ à partir de squalène et de 5-ALA. Les NA 5-ALA-SQ ont été préparés par nanoprécipitation spontanée dans l'eau. Les NA étaient monodisperses et stables avec une taille moyenne de 70 nm, un indice de polydispersité de 0,12, un potentiel ζ positif de 36 mV et une charge élevée de 26 % de 5-ALA. La production de PpIX a été évaluée in vitro dans deux lignées cellulaires cancéreuses en mesurant l'augmentation de la fluorescence au fil du temps et comparée à 5-ALA et 5-ALA-Hex. Les résultats ont montré que les NA SQ-ALA sont très efficaces pour induire la production de PpIX dans les types de cellules cancéreuses PC3 et U87MG. Ils surpassent le 5-ALA-Hex dans l'induction de fluorescence à des concentrations plus élevées à des temps d'incubation de 4 et 24 h in vitro ; cependant, par rapport au 5-ALA, ils montrent une induction de fluorescence supérieure à des temps d'incubation plus courts. Dans le cadre de ces résultats, nous pouvons conclure que les NA 5-ALA-SQ présentent une solution nanotechnologique intéressante pour surmonter les inconvénients pharmacocinétiques du 5-ALA. En outre, des expériences in vivo évalueront leur potentiel pour l'administration systémique de 5-ALA pour la thérapie par fluorescence PD et PDT des tumeurs.

Méthodes/Expérimental

Les réactifs ont été achetés auprès des fournisseurs commerciaux Sigma-Aldrich (Bucks, Suisse) et Acros Organics (Bâle, Suisse) et utilisés sans autre purification. Les solvants RMN deutérés ont été obtenus auprès de Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, USA). Tétrahydrofurane (THF) et dichlorométhane (CH₂ Cl₂ ) ont été obtenus à partir d'un système de séchage sur colonne d'alumine d'ingénierie anhydre. Tous les autres solvants utilisés étaient de qualité HPLC. N,N-diméthylformamide (DMF), méthanol (CH₃ OH), éther diéthylique (Et₂ O) et de l'acétone ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Buchs, Suisse). L'acétate d'éthyle (AcOEt) a été acheté chez Biosolve (Dieuze, France); acétonitrile (CH₃ CN) a été fourni par Carlo Erba Reagents (Balerna, Suisse). L'hexane 95 % de n-hexane a été acheté auprès de Fisher Chemical (Bâle, Suisse). L'eau utilisée pour les préparations a été désionisée par un système d'eau de laboratoire Milli-Q (Millipore, Molsheim, France). Les réactions chimiques ont été effectuées à l'aide de septa-seringue standard avec une pression positive d'argon pour garantir des conditions anhydres.

La chromatographie sur couche mince (CCM) a été réalisée avec des plaques de silice à support aluminium (Merck-Keiselgel 60 F254) avec une phase mobile appropriée et a été visualisée à l'aide d'une lampe à fluorescence UV (254 et 366 nm) et/ou développée avec de la ninhydrine, 20 % de soufre acide ou acide phosphomolybdique (PMA). La chromatographie flash a été réalisée sur un automate PuriFlash® 4100 d'Interchim (Montluçon, France) en utilisant des colonnes de silice Interchim puriFlash® HP 30 μm équipées d'un détecteur PDA (200-800 nm) et d'un collecteur de fractions automatisé. Le profil d'élution a été surveillé à l'aide du logiciel Flash Interchim version 5.0x. La colonne HPLC semi-préparative a été réalisée sur une colonne Waters Symmetry 300TM - 5 μm (19  ×  150 mm), C8 (Baden-Dättwil, Suisse). L'UPLC analytique a été réalisée à l'aide d'une colonne Macherey-Nagel EC50/2 Nucleodur Gravity 1,8 μm (50 × 2,1 mm) montée sur un système d'eau équipé d'un détecteur Waters PDA (Baden-Dättwil, Suisse). Tampon A = CH₃ CN + 0,1% d'acide formique) et tampon B = H₂ O + 0,1% d'acide formique. Débit =400,0 μL/min à 25 °C. ¹ H et ¹³ Les spectres RMN C ont été enregistrés sur des spectromètres Varian Gemini 300 MHz, Varian Innova 500 MHz ou Bruker Avance III Cryo 600 MHz à 298 K. Les déplacements chimiques (δ) sont indiqués en parties par million (ppm) et les constantes de couplage (J) sont en hertz (Hz). s pour singulet, d pour doublet, dd pour doublet de doublets, t pour triplet, q pour quatuor et m pour multiplet. Les pics de solvant résiduel ont été utilisés comme référence interne pour les déplacements chimiques du proton et du carbone. Les spectres RMN ont été traités avec le progiciel Mnova version 10.0.2. La spectrométrie de masse basse résolution (LRMS) a été réalisée sur un instrument HTS PAL-LC10A – API 150Ex en ESI (mode positif). La spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) a été réalisée sur un instrument QSTAR Pulsar (AB/MDS Sciex) en ESI (mode positif). Les structures chimiques ont été dessinées et nommées selon la nomenclature IUPAC en utilisant le progiciel ChemBioDraw Ultra version 14.0.0.117. Le pH a été mesuré sur un pH-mètre Metrohm 691 en utilisant une électrode en fer de lance (Zofingue, Suisse), calibrée avec des tampons Metrohm. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 6, 2016, (GraphPad Software). P la valeur < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Synthèse du Building Block SQ-ALA

Acide 5-(tert-Butoxycarbonylamino)-4-oxopentanoïque (2)

Le Boc-5-ALA a été synthétisé selon la procédure publiée. Les données spectroscopiques sont identiques à celles de la littérature [56]. ¹ H RMN (600 MHz, DMSO-d6) δ 12,12 (s, 1H), 7,06 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 3,76 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 2,61 (t, J = 6,6 Hz , 2H), 2,40 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 1,38 (s, 9H). ¹³ RMN C (151 MHz, DMSO) 206,62, 174,07, 156,21, 78,54, 49,97, 40,38, 40,24, 40,11, 39,97, 39,83, 39,69, 39,55, 34,22, 28,64. [M+H] ⁺ 232.1, trouvé 232.7.

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-pentaen-1-ol (3)

Alcool de squalène 3 a été synthétisé à partir de squalène en quatre étapes de synthèse avec un rendement de 23,7 % sous forme d'huile incolore selon les procédures rapportées [49]. ¹ RMN H (300 MHz, CDCl₃ ) 5,17-5,06 (m, 5H, CH), 3,62 (q, J =6,3 Hz, 2H, CH₂ -OH), 2,17 – 1,92 (m, 18H, CH₂ ), 1,67 (s, 3H, CH₃ ), 1,59 (m, 17 H, CH₃ et CH₂ ). ¹³ RMN C (75 MHz, CDCl₃ ) δ 135.35, 135.17, 135.14, 134.81, 131.49, 125.05, 124.64, 124.60, 124.47, 63.07, 39.98, 39.95, 39.89, 36.24, 30.92, 28.48, 26.98, 26.88, 26.78, 25.94, 17.92, 16.28, 16.23, 16.28 LRMS (ESI) :m/z calculé pour [M+NH₄ ] ⁺ 404,4, trouvé 404,8.

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-pentaen-1-yl 5-((tert-butoxy carbonyl)amino)-4-oxopenanoate (4)

Alcool de squalène (3 ) (100 mg, 0,26 mmol), EDC (74 mg, 0,38 mmol) et DMAP (94 mg, 0,78 mmol) et acide 5-(tert-butoxycarbonylamino)-4-oxopentanoïque (2) (77 mg, 0,34 mmol) ont été dissous dans du DCM (15 mL). Après agitation pendant une nuit à température ambiante, le solvant a été évaporé sous pression réduite et le produit brut purifié par chromatographie flash en utilisant un gradient DCM/acétate d'éthyle (EA) donnant une huile incolore (108 mg, 0,18 mmol, 70 %). ¹ RMN H (300 MHz, CDCl₃ ) δ 5,31 – 5,20 (br s, 1H), 5,13 – 5,07 (m, 5H), 4,09 – 3,95 (m, 4H), 2,75 – 2,53 (m, 4H), 2,02 – 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63 – 1,50 (m, 19H), 1,41 (s, 9H). ¹³ C RMN (75 MHz, CDCl3) 204,46, 172,65, 135,30, 135,16, 135,09, 133,75, 131,43, 125,34, 124,60, 124,57, 124,48, 124,45, 64,81, 50,53, 39,96, 39,93, 39,87, 35,92, 34,56, 28,52, , 28.43, 28.24, 28.02, 26.97, 26.86, 25.92, 23.11, 17.90, 16.25, 16.21, 16.06. LRMS (ESI) :m/z calculé pour [M+NH₄ ] ⁺ 617,5, trouvé 617,8.

Sel d'acide trifluoroacétique de 5-amino-(((4E,8E,12E,16E)-4,8,13 ,17,21-pentaméthyldocosa-4,8,12,16,20-pentaén-1-yl)oxy)-4-oxopenanoate (5)

Composé 4 (34 mg, 57 mmol) a été dissous dans du DCM (2,0 ml). De l'acide trifluoroacétique (TFA) (200 μL) a été ajouté et le mélange réactionnel a été agité à température ambiante. Après 10 min, les solvants ont été évaporés sous vide à basse température et les traces de TFA ont été éliminées par co-évaporation avec EA (3 x 10 ml). Le produit brut a été purifié par RP-HPLC en utilisant du H₂ complet Gradient O/AcN (0,025 % TFA) donnant une huile incolore (25 mg, 74 %). %). ¹ RMN H (300 MHz, CDCl₃ ) δ 5,31 – 5,20 (br s, 1H), 5,13 – 5,07 (m, 5H), 4,09 – 3,95 (m, 4H), 2,75 – 2,53 (m, 4H), 2,02 – 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63 – 1,50 (m, 19H). LRMS (ESI) :m/z calculé pour [M+H] ⁺ 500,4, trouvé 500,6.

Préparation de nanoassemblages

Les NA ont été préparés par nanoprécipitation décrite en détail ailleurs [20]. En bref, le bloc de construction 5 (1,2 mg, 2,0 μmol) a été dissous dans un 50/50 V /V mélange acétone/éthanol (500 μL). La phase organique a ensuite été ajoutée goutte à goutte à l'aide d'une micro-seringue dans de l'eau MilliQ (1,25 mL) à 100 μL/min sous agitation magnétique. Après 5 min sous agitation, le barreau d'agitation magnétique a été retiré et les solvants organiques et l'excès d'eau ont été éliminés à l'aide d'un évaporateur rotatif à 30°C. La concentration finale des nanoassemblages était de 2,00 mM.

Caractérisation des NA 5-ALA-SQ

La charge 5-ALA du 5-ALA.SQ NA a été calculée à partir des contributions respectives des poids moléculaires du 5-ALA et du conjugué 5-ALA-SQ comme suit [19] :

Le diamètre hydrodynamique des NA a été mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DLS) à l'aide d'un instrument NANO ZS de Malvern (Worcestershire, Royaume-Uni) exécutant le logiciel ZetaSizer 7.01. Les analyses ont été effectuées avec un laser He-Ne de 4 mW (633 nm) à un angle de diffusion de 173° à 25°C dans une microcuvette en polystyrène (PS) de Brand (Wertheim, Allemagne). Le potentiel zêta (ZP) a été déterminé en utilisant le même instrument Nano ZS de Malvern dans des cellules capillaires repliées DTS 1070 de Malvern. La distribution des tailles et le diamètre moyen des tailles ont été calculés à partir des données. La stabilité des NA conservés à 4 °C a été testée par DLS à des moments réguliers sur une période de 1 mois.

La morphologie des NA a été évaluée au microscope électronique à transmission cryogénique (cryo-MET) en utilisant TECNAI® G ² Microscope Sphera (FEI, Thermo Fisher Scientific) équipé d'une caméra numérique haute résolution de 2000 par 2000 pixels TCL (Gräfelfing, Allemagne). Les échantillons de glace vitrifiée ont été préparés à l'aide du cryo-plongeur Virtobot (FEI, Thermo Fisher Scientific). Les NA (2,0 μL, 2,0 mM) ont été appliqués sur des grilles Quantifoil Cu/Rh 200 mesh R3.5/1 (SPI, West Chester, États-Unis) et vitrifiés à l'éthane liquide.

Culture cellulaire

Des cellules humaines de cancer de la prostate PC3 (ATTC® CRL-1435™) et des cellules de glioblastome humain U87MG (ATTC® HTB-14™) ont été cultivées et maintenues par passage en série dans un mélange de nutriments F-12K (21127-022, Thermo Fisher Scientific) ou au minimum Essential Media (31095-029, Thermo Fisher Scientific), respectivement. Les milieux cellulaires ont été complétés avec du sérum de veau fœtal (10 %, CVFSVF00-01, Eurobio), de la streptomycine (100 μL/mL) et de la pénicilline (100 UI/mL, 15140-122, Thermo Fisher Scientific). Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 95 % d'air et 5 % de CO_2.

Mesures cinétiques de fluorescence PpIX in vitro

Des cellules humaines de cancer de la prostate PC3 (12 000 cellules/puits) et des cellules de glioblastome U87MG (10 000 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (plaque noire à fond transparent, 3603, Corning). Le jour suivant, les cellules ont été exposées à des concentrations croissantes de 5-ALA-SQ NA, 5-ALA-Hex et 5-ALA dans des milieux sans sérum. La fluorescence PpIX a été enregistrée avec un lecteur de plaques (Safire, Tecan, Suisse) à différents moments. La longueur d'onde d'excitation a été réglée à 405 nm et la longueur d'onde d'émission à 630 nm. Valeurs moyennes et s.d. pour chaque concentration à chaque moment par plaque ont été soustraits avec la valeur de référence (pas de traitement) et tracés pour chaque lignée cellulaire.