Administration ciblée de doxorubicine par liposomes fonctionnalisés avec un aptamère anti-EpCAM : efficacité dans les modèles de carcinome du côlon C26

Résumé

Dans cette étude, nous avons fonctionnalisé en surface la doxorubicine (DOX) nano-liposomale PEGylée (Caelyx®) avec un aptamère anti-EpCAM (molécule d'adhésion des cellules épithéliales) via post-insertion d'aptamère anti-EpCAM conjugué au DSPE-mPEG₂₀₀₀ dans le Caelyx® (ED-lip). La taille, la charge, le profil de libération, la cytotoxicité et l'absorption cellulaire de la formulation ont été déterminés. La caractérisation de l'ED-lip a démontré une légère augmentation de la taille et de l'indice de polydispersité (PDI) ainsi qu'une diminution du potentiel zêta, confirmant l'efficacité de la post-insertion. Les résultats de cytométrie de flux et de microscopie à fluorescence ont montré que l'ED-lip améliore significativement le taux d'absorption cellulaire sur la lignée C26 par rapport au Caelyx®. L'ED-lip présente également des effets cytotoxiques supérieurs, confirmant l'efficacité de l'aptamère anti-EpCAM comme ligand de ciblage. La pharmacocinétique et la biodistribution tissulaire des formulations chez des souris porteuses de tumeurs C26 ont démontré que l'ED-lip ne modifie pas le profil de distribution de la DOX par rapport au Caelyx®. En outre, l'ED-lip améliore efficacement l'accumulation tumorale de la DOX et favorise la survie des animaux. Ces résultats suggèrent que la fonctionnalisation du Caelyx® avec un aptamère anti-EpCAM est prometteuse pour le traitement du cancer et mérite des investigations supplémentaires.

Introduction

Les systèmes d'administration de médicaments à l'échelle nanométrique (NDDS) de 100 à 200 nm s'accumulent passivement dans le microenvironnement tumoral via l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR). Ce phénomène résulte de la perméabilité accrue de l'endothélium tumoral et du drainage lymphatique défaillant. Cependant, des données récentes indiquent que moins de 1 % du médicament administré atteint le site tumoral. L'incapacité à pénétrer la matrice extracellulaire dense, le retour du médicament libéré dans la circulation et l'hétérogénéité des tumeurs expliquent cet échec. Différentes stratégies ont été employées pour améliorer l'accumulation tumorale des NDDS en exploitant des stimuli endogènes et exogènes. Certains NDDS répondent à des stimuli exogènes comme la lumière et peuvent être utilisés pour l'imagerie tumorale. Divers nanomatériaux inorganiques possèdent des propriétés anticancéreuses, mais leur toxicité et leur innocuité environnementale requièrent une attention particulière.

L'administration ciblée active constitue une approche majeure pour améliorer la délivrance d'agents thérapeutiques vers les tumeurs tout en minimisant l'exposition des tissus sains. Un agent de ciblage idéal doit avoir une affinité pour des protéines de surface ou des récepteurs surexprimés par des cellules ou tissus spécifiques.

La molécule d'adhésion des cellules épithéliales (EpCAM) est une glycoprotéine transmembranaire considérée comme un ligand candidat pour le ciblage actif. Des études récentes montrent que l'EpCAM est faiblement exprimée sur les cellules épithéliales saines, tandis que son expression augmente jusqu'à 1000 fois dans les cellules cancéreuses. Au cours du développement tumoral, le pattern d'expression de l'EpCAM passe des membranes basales et basolatérales des épithéliums normaux à la surface apicale des cellules épithéliales tumorales. Cette expression différentielle fait de l'EpCAM une cible très intéressante pour améliorer l'index thérapeutique des médicaments.

L'EpCAM est également reconnue comme marqueur de cellules souches cancéreuses (CSC) ou de cellules initiatrices de tumeurs (TIC), son expression étant associée à un mauvais pronostic. Les CSC/TIC possèdent des capacités d'autorénouvellement et jouent un rôle clé dans le développement tumoral et les métastases. La surexpression de l'EpCAM a été rapportée dans les CSC de diverses tumeurs solides. Récemment, les aptamères ont suscité un vif intérêt comme molécules potentiellement puissantes pour servir de ligands de ciblage dans les NDDS. Les aptamères sont des séquences d'oligonucléotides d'ADN ou d'ARN possédant des structures secondaires et tertiaires qui leur confèrent une affinité pour leurs cibles, comme les récepteurs de surface cellulaire. Ils présentent plusieurs avantages : non-immunogènes, faible poids moléculaire (8-25 kDa), stabilité chimique et thermique, synthèse et modifications chimiques peu coûteuses et évolutives. Le ciblage sélectif des NDDS via un aptamère anti-EpCAM spécifique représente une option efficace pour délivrer des agents chimiothérapeutiques dans le microenvironnement tumoral. Différentes études ont montré que des nanovecteurs fonctionnalisés avec un aptamère anti-EpCAM améliorent efficacement la délivrance de médicaments anticancéreux aux cellules tumorales.

L'objectif de cette étude est de développer des nano-liposomes PEGylés chargées en doxorubicine (DOX) et fonctionnalisés avec un aptamère d'ADN anti-EpCAM (SYL3C) (ED-lip) comme modèle de NDDS. Cette fonctionnalisation a été réalisée par chimie de couplage EDC/NHS entre le groupe amine de l'aptamère et le groupe carboxyle du DSPE-mPEG₂₀₀₀, lequel est ensuite post-inséré dans le liposome (Figure 1). L'ED-lip a été caractérisé pour sa taille, son potentiel zêta, son taux d'encapsulation de la doxorubicine, son profil de libération et sa cytotoxicité. Nous avons ensuite évalué si ces ED-lip pouvaient améliorer l'absorption cellulaire in vitro et délivrer la DOX à la tumeur par ciblage actif chez des souris porteuses de carcinomes du côlon C26.

Résultats et Discussion

Le Caelyx®, doxorubicine liposomale PEGylée, est l'un des agents chimiothérapeutiques les plus utilisés et le premier nanoparticule approuvé par la FDA pour le traitement du cancer de l'ovaire, du sarcome de Kaposi lié au SIDA et du myélome multiple. Le Caelyx® pénètre passivement le site tumoral via l'effet EPR. Bien qu'il améliore significativement la pharmacocinétique et la demi-vie de la DOX, ses principales limitations restent une absorption cellulaire insuffisante et un faible taux de libération du médicament au site tumoral. Ici, nous avons utilisé l'aptamère SYL3C comme ligand de ciblage pour fonctionnaliser la doxorubicine liposomale (ED-lip) afin de cibler la molécule EpCAM à la surface des cellules cancéreuses, permettant ainsi une délivrance active de la DOX vers la cible spécifique.

Conjugaison du DSPE-mPEG₂₀₀₀ à l'aptamère

Nous avons utilisé la chimie de couplage EDC/NHS pour conjuguer des aptamères anti-EpCAM fonctionnalisés par une amine au groupe carboxyle activé du DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH. L'avantage de cette réaction réside dans la stabilité de la liaison amide formée et la réduction des interactions non spécifiques entre aptamères. Les aptamères peuvent être modifiés avec un groupement amine ou thiol et conjugués covalentement à un groupe carboxyle activé ou à un groupement maléimide, respectivement. Les aptamères modifiés par thiol se conjuguent au groupement maléimide du DSPE-PEG₂₀₀₀, puis sont post-insérés dans la structure liposomale pour décorer la surface externe. Une limitation majeure de la chimie maléimide-thiol est l'oxydation possible des groupements thiol pendant le stockage, formant des liaisons disulfure (S-S) entre deux aptamères modifiés, les rendant incapables de réagir avec le maléimide. L'utilisation de réactions EDC/NHS augmente les rendements et améliore la méthode de post-insertion.

Les aptamères présentent des avantages par rapport aux anticorps : facilité de synthèse et de mise à l'échelle, faible toxicité systémique et absence d'immunogénicité. Après conjugaison de l'aptamère au lipide, la méthode de post-insertion a été utilisée pour obtenir du Caelyx® décoré d'aptamères anti-EpCAM (ED-lip). Cette technique est simple, efficace et assure un taux d'incorporation élevé des aptamères dans les liposomes.

L'électrophorèse sur gel d'agarose a servi à évaluer la post-insertion de l'aptamère anti-EpCAM sur le liposome. Comme le montre la Figure 2, les aptamères chargés négativement migrent dans le gel et leurs bandes sont observées, alors qu'aucune bande correspondante n'apparaît pour la formulation ED-lip, celle-ci restant piégée dans le puits. Ces résultats confirment la post-insertion réussie des micelles conjuguées à l'aptamère à la surface des liposomes.

Caractérisation physicochimique de l'ED-lip

Le Tableau 1 présente la caractérisation physicochimique du Caelyx® et de l'ED-lip. La modification du Caelyx® avec l'aptamère anti-EpCAM n'a pas d'effet significatif sur la taille des particules (p > 0,05). La taille du Caelyx® avant insertion était d'environ 96 nm avec un PDI de 0,11 ; après post-insertion (ED-lip), la taille augmente partiellement à 117 nm avec un PDI de 0,14, restant dans une gamme souhaitable pour la délivrance tumorale. Des études antérieures ont également rapporté une augmentation de la taille et du PDI lors de l'incorporation de ligands de ciblage. Le potentiel zêta de l'ED-lip (-19,25 mV) devient plus négatif que celui du Caelyx® (-12 mV), ce qui est cohérent avec la conjugation d'aptamères d'ARN qui diminue le potentiel zêta. L'augmentation de la taille et du potentiel zêta négatif témoigne de la post-insertion réussie des aptamères conjugués à la surface du liposome. Ces résultats concordent avec nos études précédentes montrant que l'attachement d'aptamères à la surface du Caelyx® entraîne une légère augmentation de la taille et un potentiel zêta plus négatif. Toutefois, l'efficacité de la post-insertion devrait être optimisée en termes de temps et de température d'incubation pour obtenir des liposomes plus efficaces avec une meilleure taille et PDI. L'efficacité d'encapsulation du Caelyx® et de l'ED-lip était de 100 % (Tableau 1).

Le nombre d'aptamères post-insérés à la surface du liposome a été déterminé comme décrit précédemment. La teneur totale en phospholipides de la formulation liposomale, mesurée par dosage du phosphate, était de 14 mM. Sachant que le nombre moyen de molécules lipidiques dans un liposome de 100 nm est de 8 × 10⁴, le nombre de liposomes par millilitre est d'environ 10¹⁴. Le poids moléculaire de l'aptamère était de g/mol. Le nombre de molécules DSPE-mPEG₂₀₀₀-aptamère a été déterminé par dosage du phosphate, où les moles de phosphate correspondent aux moles de molécules conjuguées. Selon ces données, le nombre de molécules d'aptamère par aliquote de 1 ml est de 10¹⁵.

Profil de libération de la DOX

L'insertion de micelles conjuguées à l'aptamère à la surface externe du Caelyx® pourrait affecter le profil de libération de la DOX. Nous avons donc évalué la libération de la DOX depuis l'ED-lip comparée au Caelyx® dans du dextrose à 5 % avec 50 % de sérum fœtal bovin (FBS), un milieu mimant le comportement de libération dans le plasma. La Figure 3 montre qu'il n'y a pas de différence significative dans la libération de la DOX entre les deux formulations sur 24 h, seules des quantités négligeables étant libérées. Ce résultat est cohérent avec nos études antérieures indiquant que l'insertion d'aptamères à la surface du liposome n'affecte pas la stabilité de la membrane ni le profil de libération de la DOX, principalement grâce à la stabilité de la formulation Caelyx® obtenue par une méthode de chargement à distance pilotée par un gradient de pH.

Interaction cellulaire et absorption cellulaire par microscopie à fluorescence

L'interaction et l'absorption cellulaire des formulations liposomales ont été évaluées à 4 °C et 37 °C (Figure 4). L'évaluation de l'efficacité de ciblage de l'ED-lip a montré qu'il n'y avait pas de différence entre les intensités de fluorescence moyennes (MFI) des cellules CHO-K1 traitées avec le Caelyx® et l'ED-lip à 4 °C et 37 °C (Figure 4a, c). En revanche, les données démontrent que l'ED-lip ciblé présente une absorption significativement plus élevée par les cellules C26 comparé au Caelyx® à 4 °C et 37 °C (Figure 4b, d), cette différence étant statistiquement significative à 37 °C (p < 0,0001). L'ED-lip montre une absorption significativement supérieure au Caelyx® (p < 0,001). Ces résultats indiquent que l'ED-lip améliore la spécificité de ciblage car l'aptamère anti-EpCAM a une affinité plus grande pour la lignée C26 que pour les cellules CHO-K1. La DOX libre traverse librement la bicouche lipidique et entre dans la cellule, présentant l'absorption cellulaire la plus élevée et donc la cytotoxicité la plus forte. Dans le cas du Caelyx®, la PEGylation limite le taux d'endocytose et réduit la cytotoxicité. Cependant, la présence de l'aptamère anti-EpCAM à la surface du liposome (ED-lip) augmente le taux d'internalisation de la formulation et sa cytotoxicité par rapport au Caelyx®. Les données de microscopie à fluorescence montrent que la différence d'absorption cellulaire entre l'ED-lip et la DOX libre sur la lignée C26 à 37 °C n'est pas significative (Figure 5). Cependant, l'échelle basée sur l'intensité de la DOX internalisée (Tableau 2) montre que l'ED-lip et la DOX libre présentent des différences statistiquement significatives avec le Caelyx® pour l'absorption cellulaire C26 (p < 0,001). Bien que les cellules C26 expriment un faible niveau d'EpCAM à leur surface, les données suggèrent que la présence de l'aptamère anti-EpCAM peut améliorer le processus d'internalisation des liposomes.

Étude de cytotoxicité

Les effets cytotoxiques de la DOX libre, du Caelyx® et de l'ED-lip sont présentés à la Figure 6. Différentes concentrations de formulations ont été utilisées pour traiter les cellules pendant 1, 3 et 6 h, suivies d'une incubation de 72 h. Les données montrent que toutes les formulations affectent les cellules de manière dose- et temps-dépendante. La viabilité des cellules C26 traitées avec l'ED-lip diminue par rapport aux cellules traitées avec le Caelyx®. Comme les cellules CHO-K1, négatives pour l'EpCAM, répondent moins à l'ED-lip qu'aux cellules C26, il semble que l'aptamère anti-EpCAM augmente la délivrance spécifique du Caelyx® aux cellules cibles. Ces résultats confirment l'absorption cellulaire spécifique de l'ED-lip par les cellules C26 et soulignent l'importance de l'administration ciblée avec des agents de ciblage spécifiques pour une délivrance sélective du médicament aux cellules cibles, réduisant les effets secondaires en évitant les cibles non intentionnelles. Comme rapporté précédemment, le ciblage actif du Caelyx® avec des ligands spécifiques tels que les aptamères et les anticorps améliore le ciblage tumoral actif et la délivrance spécifique du médicament aux cellules cibles, ce qui renforce l'efficacité thérapeutique de la DOX.

Biodistribution et pharmacocinétique

Pour évaluer l'impact de l'aptamère anti-EpCAM sur la biodistribution de la DOX, nous avons injecté une dose de 10 mg/kg d'ED-lip et de Caelyx® chez des souris porteuses de tumeurs C26 sous-cutanées. La concentration de DOX dans le plasma à 3, 12, 24, 48 et 72 h post-injection est montrée à la Figure 7. Le comportement des concentrations plasmatiques de DOX était similaire dans les deux groupes, sans différence significative. Comme le montre le Tableau 3, la conjugation de l'aptamère anti-EpCAM à la surface liposomale diminue légèrement le temps de circulation à demi-vie de 39,3 h à 34,2 h et le temps de résidence moyen (MRT) de 47,6 à 42,9 h. Les paramètres pharmacocinétiques indiquent que la conjugation de l'aptamère accélère légèrement la clairance des liposomes, ce qui est cohérent avec des rapports antérieurs. L'adsorption de protéines et l'élimination consécutive par le système phagocytaire mononucléaire (MPS) pourraient expliquer cette accélération de la clairance sanguine des nanoparticules conjuguées au ligand.

La Figure 8 compare les concentrations de DOX dans les principaux organes prélevés chez les groupes recevant le Caelyx® et l'ED-lip. Le principal effet secondaire de la DOX libre est la cardiotoxicité, que le Caelyx® réduit significativement. La biodistribution de l'ED-lip dans le foie, le poumon et la rate est significativement plus élevée que celle du Caelyx® à 3 h. La présence de vaisseaux sanguins perméables et l'augmentation de la taille et du PDI de l'ED-lip après post-insertion pourraient expliquer cette accumulation plus importante dans ces tissus aux temps précoces. Il a été montré que l'augmentation de la taille des nanoparticules à 150 nm renforce leur accumulation dans le foie, le poumon et la rate. Par ailleurs, les résultats de biodistribution illustrent clairement le mécanisme EPR dans l'accumulation des nanoparticules dans la tumeur. La Figure 8 montre que l'ED-lip et le Caelyx® s'accumulent progressivement au site tumoral, atteignant un maximum vers 12 h, restant stable jusqu'à 24 h, puis diminuant à 48 et 72 h. À tous les points temporels (3, 12, 24, 48 et 72 h), l'accumulation de l'ED-lip dans la tumeur est significativement supérieure à celle du Caelyx®, ce qui pourrait être dû à l'efficacité du ciblage actif par l'aptamère anti-EpCAM. Ces résultats indiquent que l'attachement de l'aptamère à la surface du liposome n'affecte pas la distribution de la DOX dans le rein. Il semble donc que les aptamères anti-EpCAM favorisent efficacement la pénétration tumorale spécifique des liposomes, ce qui pourrait aussi être dû à la surexpression de molécules EpCAM dans les cellules endothéliales vasculaires tumorales. Des études antérieures ont indiqué que les aptamères anti-EpCAM pouvaient améliorer la pénétration tumorale dans des xénogreffes. Les CSC/TIC sont également cibles de la thérapie anti-EpCAM. L'administration d'aptamères anti-EpCAM comme ligands de ciblage pour cibler l'EpCAM a montré des effets prometteurs dans le ciblage des CSC. On peut suggérer qu'une partie de l'effet antitumoral efficace de l'ED-lip pourrait être due au ciblage réussi des CSC.

Activité antitumorale in vivo

L'efficacité thérapeutique de l'ED-lip a été évaluée dans le modèle de carcinome du côlon C26. La taille de la tumeur, le poids corporel et la survie ont été suivis pendant près de 2 mois (Figure 9 et Tableau 4). Les données indiquent que l'ED-lip n'a pas d'influence évidente sur le poids corporel des souris, tout comme le Caelyx® (Figure 9a). Comme le montre la Figure 9b, après injection intraveineuse de Caelyx® et d'ED-lip, le taux de croissance tumorale est efficacement inhibé jusqu'au jour 30 post-injection, sans différence significative entre les groupes traités par liposomes. Après 30 jours, le taux de croissance tumorale s'accélère, mais reste plus lent que dans le groupe témoin recevant du PBS. La différence entre le groupe Caelyx® et le groupe ED-lip n'était pas significative pendant les 30 premiers jours post-injection. Les résultats de survie sont représentés par une courbe de Kaplan-Meier. La Figure 9c montre que l'ED-lip améliore la courbe de survie comparé au PBS ou au Caelyx®. Les principaux indicateurs de l'étude de survie sont résumés dans le Tableau 4. Les tumeurs de trois souris du groupe ED-lip ont été complètement guéries, rendant le temps de survie médian (MST) indéfini pour ce groupe. Le traitement par l'ED-lip a augmenté le temps pour atteindre le point final (TTE) de 41,1 à 49,7 jours et a entraîné une activité antitumorale efficace avec 90,27 % de retard de croissance tumorale (TGD) et un MST indéfini en raison de l'élimination complète de la tumeur chez trois souris (Tableau 4).

Les données de taille tumorale démontrent que l'ED-lip inhibe dramatiquement la croissance tumorale. L'analyse de survie montre que le traitement par l'ED-lip augmente le MST et le TTE. Le groupe recevant l'ED-lip présentait un TGD% plus élevé et était plus efficace que le Caelyx®. Nos résultats sont cohérents avec la concentration élevée de DOX dans le tissu tumoral du groupe traité par l'ED-lip. Par conséquent, la doxorubicine liposomale conjuguée à l'aptamère améliore sa pénétration et par conséquent l'accumulation du médicament au site tumoral, ce qui augmente l'efficacité du Caelyx® et le TGD% dans les données de survie. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que les aptamères anti-EpCAM pourraient servir d'agents de ciblage importants pour l'administration de médicaments.

Conclusion

Nous avons fonctionnalisé en surface le Caelyx® avec un aptamère anti-EpCAM (SYLC3) via post-insertion (ED-lip). La cytométrie de flux et la microscopie à fluorescence ont montré un niveau élevé d'absorption de DOX dans les cellules C26, indiquant que l'aptamère améliore le taux d'internalisation de l'ED-lip. Les données pharmacocinétiques indiquent que la post-insertion de DSPE-mPEG-EpCAM ne modifie pas la pharmacocinétique de la DOX par rapport au Caelyx®. Cependant, la biodistribution tissulaire montre une accumulation tumorale plus importante de l'ED-lip par rapport au Caelyx® même après 72 h post-injection. Nous avons démontré que l'ED-lip avait des effets thérapeutiques améliorés chez des souris porteuses de tumeurs C26. Les paramètres de survie améliorés chez les souris traitées par l'ED-lip suggèrent que le liposome de DOX ciblant l'EpCAM est un vecteur d'administration de médicaments prometteur pour le traitement des cancers et mérite des investigations supplémentaires.

Matériaux et Méthodes

Matériaux

L'aptamère d'ADN anti-EpCAM 5'-Amine (séquence 5' -CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3') (SYL3C) a été acheté chez BIONEER (Daejeon, Corée du Sud). Le DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH a été acheté chez Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Le Dowex®, l'EDC (1-Ethyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide), le NHS (N-Hydroxysuccinimide), la pénicilline-streptomycine et le Fluoroshield™ avec DAPI ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Le Caelyx® disponible dans le commerce a été acheté chez Behestan Darou Company (Téhéran, Iran).

Conjugaison du DSPE-mPEG₂₀₀₀ à l'aptamère

L'aptamère anti-EpCAM a été lié au DSPE-mPEG₂₀₀₀ par liaison covalente entre les amines primaires (-NH2) de l'aptamère et le groupe carboxyle (–COOH) du DSPE-mPEG₂₀₀₀ (Figure 1). La conjugaison a été réalisée par chimie de couplage EDC/NHS. Brièvement, le DSPE-mPEG₂₀₀₀ a été dispersé dans un tampon MES (acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique) (pH 6,5) et 400 mM d'EDC et 100 mM de NHS ont été ajoutés. La dispersion a été agitée pendant 15 min pour activer les groupes carboxyles du lipide. Ensuite, l'aptamère anti-EpCAM a été ajouté et agité pendant 2 h à température ambiante dans l'obscurité. Le ratio molaire lipide:aptamère anti-EpCAM était de 1:1 et le ratio molaire EDC/NHS était de 10 fois celui du lipide.

Modification du Caelyx® avec DSPE-mPEG-Aptamère anti-EpCAM

L'ED-lip a été synthétisé par la méthode de post-insertion. Pour ce faire, des micelles de DSPE-mPEG-aptamère anti-EpCAM ont été ajoutées à 1 ml de Caelyx® pendant 30 min à 60 °C. Les quantités de DSPE-mPEG-aptamère anti-EpCAM ont été déterminées selon le dosage au phosphate de Bartlett. Basé sur le nombre approximatif de liposomes par millilitre de Caelyx® (environ 10¹⁴), le volume de DSPE-mPEG-aptamère anti-EpCAM a été ajusté pour atteindre 10 aptamères par liposome. L'électrophorèse sur gel d'agarose a été utilisée pour confirmer la post-insertion.

Caractérisation physicochimique

La taille des particules, l'indice de polydispersité (PDI) et la charge de surface ont été déterminés par diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Nano-ZS ; Malvern, UK). Pour éliminer la DOX libre, les liposomes ont été mélangés à de la résine Dowex® et agités pendant 60 min, puis passés sur des colonnes Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories Inc.) pour éliminer la résine. Les quantités de DOX dans les formulations liposomales ont été déterminées par spectrofluorimétrie (LS-45, Perkin-Elmer, UK), (excitation:émission 485:590 nm).

Étude de libération

Pour évaluer la libération de la DOX, 1 ml de formulation a été ajouté à 9 ml de dextrose (avec 50 % de sérum fœtal bovin) et des échantillons ont été prélevés à intervalles réguliers (0, 1, 2, 4, 6, 12 et 24 h). Après élimination de la DOX libre par résine Dowex®, les quantités de médicament restantes dans les liposomes ont été déterminées par spectrofluorimétrie et le pourcentage de libération calculé.

Culture cellulaire

Les lignées cellulaires de carcinome du côlon C26 et d'ovaire de hamster chinois (CHO-K1) ont été achetées à l'Institut Pasteur d'Iran. Les cellules étaient cultivées en milieu RPMI1640 supplémenté avec 10 % de FBS (Gibco, Thermos Fisher Scientific, USA), 100 UI/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine. L'incubation se faisait à 37 °C avec 5 % de CO₂ et 95 % d'air humidifié.

Essai d'interaction cellulaire et d'absorption cellulaire

L'interaction et l'absorption cellulaire des formulations ont été évaluées à 4 °C et 37 °C respectivement. Deux lignées cellulaires, CHO-K1 et C26, ont été sélectionnées. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits (2,5 × 10⁵ par puits). Après incubation nocturne à 37 °C, les traitements ont été ajoutés et les plaques placées à 4 °C et 37 °C pour 3 h supplémentaires. Les cellules ont été lavées au PBS, trypsinisées. L'intensité de fluorescence de la DOX a été déterminée par cytométrie de flux (BD FACSCalibur). Les données ont été analysées avec le logiciel FlowJo version 7.0.

Évaluation par microscopie à fluorescence

1 × 10⁶ cellules C26 par puits ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits contenant des lames de verre stériles. Après incubation nocturne à 37 °C et 5 % d'humidité, les cellules ont été traitées avec la DOX libre, le Caelyx® et l'ED-lip pendant 24 h pour une absorption cellulaire complète. Les cellules ont été lavées au PBS et fixées au formaldéhyde à 4 %. Les lames ont été colorées avec Fluoroshield™ avec DAPI et montées sur lames de verre. Les traitements ont été effectués en triplicat. Six zones par lame ont été sélectionnées sous grossissement × 200. La fluorescence intrinsèque de la DOX a été utilisée pour évaluer l'absorption cellulaire du médicament. L'échelle était basée sur le pourcentage de cellules montrant une absorption de DOX dans chaque champ microscopique : 1: 0-20%, 2: 20-40%, 3: 40-60%, 4: 60-80%, 5: 80-100%.

Évaluation de la cytotoxicité

Les valeurs IC50 de la DOX libre, du Caelyx® et de l'ED-lip ont été déterminées par test MTT. Les cellules CHO-K1 et C26 ont été ensemencées à une densité de 5 × 10³ cellules par puits dans des plaques à 96 puits à 37 °C. Après incubation nocturne, les formulations liposomales et la solution de DOX libre ont été diluées en série dans un milieu sans FBS et ajoutées aux cultures cellulaires pour 1, 3 et 6 h à 37 °C. Les cellules ont été lavées et incubées 72 h supplémentaires. Les densités optiques (DO) ont été mesurées à 570 nm contre un fond de 630 nm sur un lecteur de microplaques Stat-Fax 2100 (Awareness Technology Inc. USA). Les valeurs IC50 ont ensuite été calculées.

Étude animale

Des souris BALB/c femelles (4-6 semaines, 18-20 g) ont été maintenues en cages séparées à 22 ± 2 °C avec alimentation et eau à volonté. L'anesthésie a été réalisée par injection intrapéritonéale (i.p) de kétamine et xylazine (100 mg/kg kétamine et 10 mg/kg xylazine). 3 × 10⁵ cellules C26 par souris en 60 μl PBS ont été injectées sous-cutanément au flanc droit. Deux semaines après l'inoculation, lorsque les tumeurs atteignaient environ 5 mm³, les souris ont été réparties aléatoirement en 3 groupes (n = 3 pour la biodistribution et n = 5 pour l'étude antitumorale par groupe). Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d'éthique animale de l'Université des Sciences Médicales de Mashhad et réalisés selon les règles internationales relatives aux droits des animaux.

Études de biodistribution et pharmacocinétique

Quatorze jours après l'inoculation tumorale, les souris ont été traitées par une dose de 10 mg/kg de Caelyx® et d'ED-lip par voie intraveineuse (i.v.) via la veine caudale. Le groupe témoin a reçu 200 μl de solution PBS. À des intervalles de temps définis (3, 12, 24, 48 et 72 h) post-injection, les souris ont été euthanasiées et des échantillons de sang et de tissus (foie, rate, rein, poumon, cœur et tumeur) ont été prélevés. La concentration de doxorubicine dans chaque échantillon a été mesurée par intensité de fluorescence à l'aide d'un spectrofluorimètre LS-45 (Perkin-Elmer, UK). La concentration de doxorubicine de chaque échantillon a été mesurée et l'analyse non-compartimentale des paramètres pharmacocinétiques a été calculée à partir des profils de concentration sanguine en fonction du temps. Les paramètres calculés incluaient l'aire sous la courbe concentration-temps (AUC), l'aire sous la courbe du premier moment (AUMC), la demi-vie (t_1/2), le volume de distribution (V_d), C_max, T_max, le temps de résidence moyen (MRT) et la clairance (Cl).

Activité antitumorale in vivo

Pour évaluer l'activité antitumorale, 10 jours après l'inoculation, les souris avec tumeurs palpables ont reçu une dose unique i.v. de 10 mg/kg de Caelyx® et d'ED-lip. Du PBS a été injecté dans le groupe témoin négatif. Les paramètres incluant le temps pour atteindre le point final (TTE), le pourcentage de retard de croissance tumorale (TGD), le temps de survie médian (MST) et la survie ont été déterminés. Pendant l'étude, les souris ont été observées pour leur santé et les changements de poids corporel. Le volume tumoral a été mesuré à l'aide d'un pied à coulisse numérique et calculé comme suit :

$$ \mathrm{Volume\ tumoral}=(\mathrm{Hauteur}\times \mathrm{Longueur}\times \mathrm{Largeur})\times 0,52 $$

Pour des raisons éthiques, les souris étaient retirées de l'étude si la croissance tumorale dépassait 1000 mm³, une perte de poids > 20 % ou des signes de faiblesse étaient observés.

Analyse statistique

Les données ont été analysées avec GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Les données sont présentées en moyenne ± SEM d'au moins trois expériences indépendantes. Le test t a été utilisé pour évaluer les résultats de l'étude de libération, de cytométrie de flux et de biodistribution. L'ANOVA a été employée pour évaluer les résultats de microscopie à fluorescence et des volumes tumoraux. La méthode de Kaplan-Meier a été utilisée pour calculer les paramètres de survie (TTE, MST, TGD%). p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données soutenant les conclusions de cet article sont incluses dans l'article.

Abréviations

EpCAM:

Molécule d'adhésion des cellules épithéliales

NDDS:

Systèmes d'administration de médicaments à l'échelle nanométrique

DOX:

Doxorubicine

EPR:

Perméabilité et rétention accrues

ECM:

Matrice extracellulaire

CSC:

Cellule souche cancéreuse

TIC:

Cellule initiatrice de tumeur

MFI:

Intensités de fluorescence moyennes

MPS:

Système phagocytaire mononucléaire

EDC:

1-Ethyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PDI:

Indice de polydispersité

DLS:

Instrument de diffusion dynamique de la lumière

FBS:

Sérum fœtal bovin

OD:

Densité optique

AUC:

Aire sous la courbe concentration-temps

AUMC:

Aire sous la courbe du premier moment

t_½:

Demi-vie

V_d:

Volume de distribution

MRT:

Temps de résidence moyen

Cl:

Clairance

TTE:

Temps pour atteindre le point final

TGD:

Pourcentage de retard de croissance tumorale

MST:

Temps de survie médian

i.p.:

Intrapéritonéal

i.v.:

Intraveineux