Nanogels gélatine/silice réactifs au redox fonctionnalisés par l'aptamère AS1411 pour une livraison ciblée de siARN

Résumé

L'interférence ARN (RNAi) offre une spécificité inégalée pour le silence génique, pourtant la stabilité du siARN et la livraison tissulaire précise restent des facteurs limitants. Nous avons conçu un système bi-réactif en conjuguant des nanogels à base de gélatine (GS) avec l'aptamère AS1411 ciblant la nucléoline et le siARN substitué par désoxynucléotides via un lien disulfure. Ce design permet l'amarrage transitoire du siARN et déclenche sa libération dans un microenvironnement tumoral riche en glutathion. Dans les cellules A549 positives pour la nucléoline, les nanogels Apt-GS/siARN se désassemblent lors de l'exposition au GSH intracellulaire, livrant efficacement le siARN au cytosol et atteignant un knockdown puissant de luciférase. Les essais de cytotoxicité ont confirmé la biocompatibilité à des concentrations thérapeutiquement pertinentes. Ces nanogels ciblant les tumeurs, réactifs au redox, représentent une plateforme prometteuse pour la thérapie cancéreuse basée sur siARN.

Introduction

L'RNAi exploite le silence génique séquentiel-spécifique, le positionnant comme candidat principal pour traiter troubles génétiques, cancers et maladies infectieuses grâce à sa précision et faible toxicité. Comparés aux oligonucléotides antisens, les petits ARNs interférents (siARN) affichent une résistance aux nucléases accrue. Les modifications chimiques — telles que la substitution de ribonucléotides par désoxynucléotides — ont montré qu'elles augmentent la stabilité du siARN tout en conservant ~40 % de l'activité RNAi. Malgré ces avancées, une livraison efficace et tissulaire-spécifique reste un défi formidable.

Les porteurs nanoparticulaires peuvent protéger le siARN de la dégradation et faciliter la livraison ciblée. La nucléoline, surexprimée à la surface de nombreuses cellules cancéreuses proliférantes, est une cible attractive pour l'absorption tumorale-spécifique. L'aptamère ADN G-quadruplex AS1411 (AGRO100) lie la nucléoline avec haute affinité et a entré les essais cliniques de Phase II comme agent anticancéreux. Des études précédentes ont conjugué avec succès AS1411 à divers nanomatériaux, atteignant l'internalisation sélective de cellules tumorales. La gélatine, une protéine biodégradable, a été employée pour l'encapsulation de siARN en raison de son excellente biocompatibilité et propriétés de gélification. Notre groupe a précédemment développé des nanogels gélatine réticulés par siloxane (NG GS) avec taille et charge de surface contrôlées, démontrant une transfection efficace in vitro et in vivo.

Surmonter les barrières intracellulaires — surtout l'échappement endosomal et la libération du siARN — est critique. Les liaisons réactives aux stimuli, telles que les liaisons disulfure qui se coupent dans l'environnement haut en glutathion (GSH) des cellules tumorales, ont attiré un intérêt significatif. Les porteurs réticulés par disulfure peuvent déclencher une libération explosive de charges thérapeutiques spécifiquement dans les cellules malignes.

Ici, nous présentons un système de nanogel hybride combinant NG GS, ciblage par aptamère AS1411, et un lien disulfure pour libération de siARN déclenchée par redox. Nous évaluons sa capacité à améliorer l'absorption cellulaire, atteindre le silence génique tumorale-spécifique, et maintenir une faible cytotoxicité.

Méthodes

Matériaux

Gélatine (Bloom 240-270, pH 4,5-5,5) provenait de BBI Company Inc. (USA). SPDP, GPSM, et APTMS étaient achetés de Sigma-Aldrich (USA). MTT, DMEM, FBS, pénicilline, et streptomycine étaient obtenus de Hyclone (USA). AS1411, 5'-FAM-AS1411, et le contrôle négatif TDO étaient synthétisés par Sangon Biotech (Chine). SiARN Luc substitué par désoxynucléotides (brin sens : 5'-SH-(CH2)6-CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3' ; brin antisens : 3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5' ; antisens marqué FAM) était purifié par HPLC par Gene Pharma (Chine). Lipofectamine 2000, le plasmide luciférase pGL3, et le système d'essai luciférase étaient de Promega (USA). Cellules adénocarcinome pulmonaire A549 et fibroblastes NIH 3T3 étaient fournis par le Centre d'Ingénierie Biomédicale de l'Université de Xiamen (Chine). Tous les réactifs étaient de grade analytique ; la verrerie était soigneusement nettoyée et rincée à l'eau déionisée.

Séquences ADN utilisées :

• Aptamère AS1411 : 5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3'
• Contrôle TDO : 5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3'

Préparation et caractérisation des complexes Apt-GS/siARN

Les NG GS ont été synthétisés via un processus sol-gel : GPSM (0,2 g) a été ajouté à 20 mL de 0,75 % gélatine dans HCl (pH 3) à 60 °C pendant 30 min, suivi par APTMS (0,08 g) et une incubation de 24 h. Les NG GS résultants ont été purifiés par centrifugation (14 000 tr/min, 25 °C, 12 min) trois fois. Ensuite, NG GS (0,5 mL, 5 g L⁻¹ PBS) ont été réagis avec SPDP (25 µL, 20 mM DMSO) pendant 60 min à température ambiante, puis incubés avec AS1411 thiolé (1 mg mL⁻¹) pendant 12 h. Les nanogels Apt-GS ont été récupérés par centrifugation et lavés à l'eau déionisée trois fois. La suspension NG Apt-GS activée SPDP (80 mL, 5 mg mL⁻¹) a été mélangée avec le brin sens siARN overnight à 4 °C. Après purification, le brin antisens a été recuit en chauffant à 94 °C pendant 5 min et refroidissant à 47 °C pendant 20 min, formant les complexes Apt-GS/siARN.

La microscopie électronique en transmission (MET, Hitachi S-4300) a révélé des particules sphériques. La diffusion dynamique de lumière (Malvern Zetasizer) a mesuré les diamètres hydrodynamiques et potentiels zêta. L'efficacité de conjugaison a été quantifiée par fluorescence de l'ADN marqué FAM et essai ninhydrine pour groupes amino de surface (≈0,642 mmol g⁻¹).

Analyse par électrophorèse sur gel

L'électrophorèse a été réalisée à 100 V pendant 20-30 min sur gel d'agarose 2 % dans tampon TBE. Les images ont été capturées avec un système de documentation de gel. Pour les études de libération, les complexes GS/siARN et Apt-GS/siARN ont été incubés avec 10 mM GSH (PBS) pendant 2 h avant chargement.

Cytotoxicité in vitro

Les essais MTT ont été conduits sur cellules A549 (1 × 10⁴ cellules/puits) en plaques 96 puits. Après 24 h pour atteindre 70 % confluence, les cellules ont été traitées avec nanogels (100-600 µg mL⁻¹) en DMEM sans sérum pendant 24 h, suivis de 4 h incubation avec MTT (5 mg mL⁻¹). DMSO a été ajouté, et l'absorbance a été lue à 490 nm. Les expériences étaient tripliquées ; la viabilité (%) était calculée relative aux contrôles non traités.

Internalisation cellulaire

Cellules A549 et 3T3 ont été incubées avec 25 µL Apt-GS ou TDO-GS marqués FAM (2 mg mL⁻¹) pendant 10 h en milieu sans sérum à 37 °C. Les cellules ont été fixées avec 4 % paraformaldéhyde et imager par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Pour la cytométrie de flux, les cellules ont été traitées avec nanogels marqués FAM (2 mg mL⁻¹) pendant 0,5-16 h, puis lavées, resuspendues dans PBS glace, et analysées sur un cytomètre EPICS XL. L'inhibition d'absorption a été évaluée en pré-incubant les cellules avec AS1411 libre (0,5, 5, 50 µM) pendant 8 h avant d'ajouter les nanogels.

Silence génique

Cellules A549 (2 × 10⁵ cellules/puits) et NIH 3T3 (4 × 10⁵ cellules/puits) ont été transféctées avec complexes Apt-GS/siARN (80 µg mL⁻¹) pendant 8 h. Trois régimes de traitement étaient évalués : (a) Apt-GS/siARN seul ; (b) Apt-GS/siARN suivi par liposome (A-GS/si→Lip) ; (c) Apt-GS/siARN et liposome simultanés (A-GS/si+Lip). Après 40 h additionnelles, l'activité luciférase était mesurée avec un système d'essai luciférase. Les données étaient présentées comme moyenne ± SEM (triplicat).

Résultats et Discussions

Synthèse et caractérisation des complexes GS-AS1411/siARN

Les images MET (Fig. 1) ont confirmé que les NG GS vides et Apt-GS formaient des particules sphériques uniformes avec diamètres de 170-200 nm. L'imagerie fluorescence a démontré la conjugaison réussie d'AS1411 et siARN. La quantification a révélé ~0,65 µmol g⁻¹ d'aptamère sur GS. Les tailles hydrodynamiques augmentaient de 162,3 nm (GS) à 216,5 nm (Apt-GS) et 234,9 nm (Apt-GS/siARN), reflétant la fonctionnalisation de surface. Les potentiels zêta changeaient de +40,1 mV (GS) à +33,9 mV (Apt-GS) et -24,9 mV (Apt-GS/siARN), indiquant une réduction de charge de surface qui devrait diminuer la liaison protéique non-spécifique et la cytotoxicité.

Chargement et libération du siARN

L'électrophorèse sur gel a montré un chargement efficace du siARN sur les complexes Apt-GS/siARN, comme en témoigne la mobilité réduite (couloirs 10-11). Lors de l'incubation avec 10 mM GSH, le siARN était libéré en 2 h (couloirs 6-7), confirmant le désassemblage déclenché par redox. La capacité de chargement était estimée à 3:1 à 2:1 pmol siARN par µg de nanogel. L'emprisonnement physique (mélange siARN libre avec GS) affichait une rétention plus faible, soulignant l'avantage de l'attachement covalent.

Cytotoxicité et ciblage nucléoline

Les essais MTT (Fig. 4) ont révélé >80 % viabilité pour GS, Apt-GS, et Apt-GS/siARN à travers 100-600 µg mL⁻¹, démontrant une excellente biocompatibilité. La viabilité légèrement réduite avec Apt-GS était attribuée à l'inhibition NF-κB induite par AS1411 et disruption d'organelles. La microscopie fluorescence et cytométrie de flux (Figs. 5 & 6) ont confirmé l'absorption sélective : Apt-GS montrait 96 % internalisation dans cellules A549 versus 52 % dans fibroblastes 3T3. La compétition avec AS1411 libre réduisait l'absorption de 50 % (fluorescence) et 30 % (pourcentage cellules positives), confirmant l'endocytose médiée par nucléoline.

Interférence ARN

Les essais de knockdown luciférase (Fig. 7a) ont démontré une réduction 4,6 fois dans cellules A549 avec Apt-GS/siARN, comparé à seulement 6 % dans cellules NIH 3T3, soulignant la spécificité tumorale. L'addition de liposomes (A-GS/si→Lip) n'améliorait pas significativement le silence (30,4 %) par rapport à Apt-GS/siARN seul, tandis que le traitement liposome concomitant (A-GS/si+Lip) augmentait le knockdown à 41,6 %. Le silence le plus élevé (≈ 2,7 fois sur 3T3) était atteint à 80 µg mL⁻¹, avec une efficacité diminuée à 120 µg mL⁻¹ probablement due à une cytotoxicité accrue.

Conclusions

Nous avons conçu une plateforme de nanogel ciblant la nucléoline, réactive au redox, qui protège le siARN modifié par désoxynucléotides et le libère spécifiquement dans le cytosol tumoral riche en GSH. Les nanogels Apt-GS/siARN ~200 nm, chargés positivement, atteignent un silence génique tumorale-sélectif puissant (~5 fois amélioration dans cellules A549) tout en maintenant une faible cytotoxicité. Ces résultats valident la stratégie de combiner chimie lien disulfure et ciblage par aptamère pour une livraison efficace de siARN et représentent une étape prometteuse vers les thérapeutiques RNAi cliniques.