Nanoparticules biodégradables, sensibles aux tumeurs, pour l'imagerie bimodale du cancer du sein

Résumé

Les agents de contraste à ultrasons (US) remplis de gaz s'effondrent facilement dans le corps, et le gaz peut facilement s'échapper, ce qui limite l'efficacité de l'imagerie US. Pour résoudre ce problème, un système multi-mode injectable générateur de gaz a été développé qui transporte l'agent de contraste négatif MR Fe₃O₄, le colorant fluorescent Cy5.5 et le donneur de CO₂ libérateur (Na₂CO₃). Les nanoparticules peuvent générer en continu du dioxyde de carbone (CO₂) dans le tissu tumoral acide dans le corps, donnant à la tumeur un fort signal d'écho sous imagerie ultrasonique. De plus, les nanoparticules confèrent d'excellents effets pour l'imagerie MR et fluorescence du tissu tumoral. Les résultats indiquent que ce système NP sensible au pH fournit de bons effets en imagerie MR/US/fluorescence. Cette étude fournit une référence utile pour l'imagerie multi-mode des tumeurs.

Introduction

En pratique clinique, les microbulles sont principalement appliquées comme agents de contraste à ultrasons pour l'imagerie en temps réel de divers organes et vaisseaux sanguins. Les agents de contraste à ultrasons traditionnels consistent généralement en des matériaux tels que les lipides ou les protéines qui enferment de l'air ou des gaz perfluorocarbonés. Les espèces gazeuses encapsulées dans les microsphères ont une faible stabilité dans le sang et une demi-vie courte en raison de la diffusion rapide des défauts de microbulles. De plus, comme la taille des microbulles remplies de gaz est généralement grande (environ 1 à 8 μm), il est difficile pour les microbulles de pénétrer dans l'environnement tumoral hôte par extravasation tissulaire. Par conséquent, l'application actuelle de bulles de taille micron dans l'imagerie intravasculaire est limitée. Les agents de contraste à ultrasons idéaux devraient généralement exhiber une taille optimale pour le transport à travers l'espace vasculaire tissulaire, une durée adéquate d'effet acoustique, un bon ciblage et biocompatibilité, et une élimination facile du corps. Le concept de « nanoparticules génératrices de gaz » a été proposé dans des recherches antérieures, et de telles nanoparticules ont le potentiel pour une utilisation dans l'imagerie de contraste par ultrasons. Ces nanoparticules génératrices de gaz sont supérieures aux microbulles remplies de gaz actuelles en performance, et le gaz généré en continu permet une imagerie ultrasonique intense. Les nanoparticules génératrices de gaz peuvent améliorer la perméation et la rétention, et elles peuvent circuler stablement dans le sang et s'accumuler efficacement dans le tissu tumoral.

Il reste un défi de détecter de minuscules tumeurs occultes par les méthodes d'imagerie traditionnelles, telles que l'imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomodensitométrie (TDM) et les ultrasons, qui sont limitées par de longs temps d'acquisition, une dose de radiation élevée et une faible sensibilité. Il est nécessaire d'intégrer différentes méthodes d'imagerie et de développer une technologie d'imagerie multi-modale pour atteindre une synergie intégrée pour la détection précoce du cancer. Les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétique (Fe₃O₄) peuvent être utilisées comme agents de contraste IRM négatifs dans l'imagerie pondérée T2. Le Fe₃O₄ a des propriétés globales attrayantes, y compris une petite taille de particule, une forte pénétration, une haute aimantation, un bon métabolisme et une toxicité relativement faible. Les agents de contraste Fe₃O₄ pour le diagnostic IRM du cancer à stade précoce ont été largement étudiés en raison de leur haute relaxation et contraste. En plus, l'imagerie de fluorescence en temps réel a une excellente résolution et peut être une méthode précieuse pour définir le stade tumoral, guider la résection tumorale et surveiller les effets du traitement.

Ici, ces nanoparticules sont principalement encapsulées par l'acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA), qui a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) pour une utilisation comme matériau biosûr. Les particules PLGA sont modifiées avec le peptide RGD pour permettre la liaison à l'intégrine αvβ3 à la surface des cellules de cancer du sein et avec Cy5.5 comme colorant fluorescent pour l'imagerie in vivo, et elles sont encapsulées avec Fe₃O₄ pour agir comme agent de contraste négatif T2 en IRM (Schéma 1a). En raison de la glycolyse up-régulée dans le tissu tumoral, qui pourrait produire plus d'acide lactique et de protons dans l'environnement extracellulaire, le pH des tissus tumoraux (6,8-7,2) est plus bas que celui des tissus normaux (pH 7,4). Ainsi, nous avons conçu le carbonate de sodium (Na₂CO₃) dans le PLGA pour produire des bulles de CO₂ au pH plus bas des tissus tumoraux pour l'imagerie par ultrasons. Pour vérifier leur application prometteuse dans l'imagerie tumorale, les propriétés complètes de ces nanoparticules multi-mode pour l'imagerie in vitro ont été systématiquement caractérisées, y compris leur cytotoxicité, spécificité de ciblage et biodistribution dans le tissu tumoral, par trois modes d'imagerie.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD

Les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD ont été conçues comme agents de contraste multi-mode ciblés RGD en encapsulant un polymère biocompatible de PLGA avec Fe₃O₄ et Na₂CO₃ et un agent ciblé d'intégrine via une liaison chimique biodégradable (Schéma 1b).

Les images de microscopie électronique à transmission ont montré que les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD étaient des sphères claires avec des particules d'oxyde de fer uniformément dispersées visibles dans la coquille (Fig. 1a). La taille hydrodynamique moyenne des NPs a été mesurée à 117,6 nm par diffusion dynamique de la lumière, et l'indice de polydispersité moyen était de 0,234 (Fig. 1b). La charge de surface des NPs a été confirmée par des mesures de potentiel zêta à -21,7 mV (Fig. 1c). La mesure du spectre de fluorescence a révélé que Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD avait la longueur d'onde d'émission maximale à 685 nm, indiquant que Cy5.5 a été encapsulé avec succès dans le noyau PLGA (Fig. 1d). Les valeurs de magnétisation à saturation pour Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD et NPs libres de Fe₃O₄ étaient égales à 32,6 et 42,5 emu/g, respectivement (Fig. 1e). Ces résultats indiquaient la caractéristique superparamagnétique des nanoparticules à température ambiante. Le spectre FITR de Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD a montré que la vibration d'étirement N-H et le pic d'absorption -OH apparaissaient autour de 3432 cm⁻¹. En outre, nous avons trouvé une amélioration (1628 cm⁻¹) de la vibration d'étirement C=O. Comparé à celui des NPs non ciblés, le pic caractéristique (le carboxyle) à 1735 cm⁻¹ des NPs ciblés était significativement réduit. Les résultats ont montré la liaison entre le groupe carboxyle sur la surface de la microsphère et le groupe amino sur le peptide RGD. La liaison in vitro des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD est montrée en Fig. 1f.

Liaison in vitro des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD

L'intégrine αvβ3 est généralement hautement exprimée sur les cellules endothéliales tumorales du cancer du sein et peut favoriser la métastase tumorale. L'immunofluorescence cellulaire pour l'expression de l'intégrine αv dans les cellules MDA-MB-231 était beaucoup plus élevée que celle dans les cellules MCF-7 ; les cellules A549 servaient de contrôles positifs (Fig. 2a). L'internalisation cellulaire des NPs a été étudiée par CLSM (Fig. 2b). Les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD ont montré un taux de liaison beaucoup plus élevé aux cellules MD-MB-231 que les NPs non ciblés. Les images de fluorescence ont aussi révélé que les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se liaient au cytoplasme cellulaire, et les images fusionnées montraient les mêmes emplacements que l'expression de l'intégrine αv.

Essai de cytotoxicité

La cytotoxicité in vitro des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD a été estimée dans les cellules MDA-MB-231 en utilisant un essai CCK8, tandis que les cellules A549 et MCF-7 traitées avec NPs étaient utilisées comme contrôles (Fig. 2c). Dans la gamme de concentrations de Fe de 5-80 μg/mL, la viabilité cellulaire des cellules A549 et MB231 n'était pas significativement réduite, et les deux étaient au-dessus de 70 %. En contraste, les cellules MCF-7 ont montré une diminution significative de la viabilité cellulaire à environ 50 % à des concentrations de Fe supérieures à 40 μg/mL. Les résultats CCK8 ont démontré que les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD montraient une cytotoxicité significativement plus faible dans les cellules MDA-MB-231 sur une gamme de concentration donnée.

Imagerie de contraste in vitro

Nous avons utilisé un fantôme de gel d'agar pour étudier la performance des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD in vitro à différentes valeurs de pH (Fig. 3a). Les images de contraste à ultrasons des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD étaient significativement améliorées à pH faiblement acide (pH 6,8) comparé au pH 7,2, probablement parce que le pH 7,2 ne produit pas assez de bulles CO₂ pour l'imagerie par ultrasons. En contraste, quand les NPs étaient dans un environnement faiblement acide, assez de bulles pouvaient être générées pour l'imagerie par ultrasons. Cette caractéristique est pertinente pour les tumeurs, qui exhibent une haute hétérogénéité tissulaire et divers niveaux de pH (pH 6,8-7,2) in vivo. L'intensité du signal de l'image à ultrasons a ensuite été analysée (Fig. 3b). Les rapports d'intensité de signal du groupe NP non ciblé (pH = 7), NP non ciblé (pH = 5), NP ciblé (pH = 7) et NP ciblé (pH = 5) par rapport à l'intensité de signal du groupe blanc étaient de 112 %, 145 %, 167 % et 178 ± 4 %, respectivement, ce qui indique clairement que le groupe NP ciblé (pH = 5) avait le signal US le plus fort.

Pour l'étude IRM in vitro, à mesure que la concentration de Fe dans les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD augmentait, l'intensité du signal pondéré T2 montrait une diminution significative, indiquant la possibilité de ces NPs pour une utilisation comme agents de contraste MR T2 (Fig. 3c). Le taux de relaxation transverse (r2) des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD a été calculé à 19,597 mM⁻¹ s⁻¹. Bien que le taux de relaxation transverse (r2) des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD soit plus bas que celui de nombreux autres agents superparamagnétiques IRM, la composition de Fe₃O₄ peut augmenter le r2, qui était 2,94 fois plus élevé que le r2 des particules SPIO utilisées cliniquement.

Imagerie de contraste par ultrasons des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD

Pour démontrer le potentiel des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD pour l'imagerie par ultrasons dans les tumeurs, nous avons administré une injection en queue de veine de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD à des souris nues xénogreffées de cancer du sein et surveillé les images ultrasoniques en fonction du temps (Fig. 4a). Avant l'injection, les images de la tumeur, du foie et de la zone sous-cutanée ont été enregistrées. Immédiatement après l'injection, la zone des tissus tumoraux n'a pas montré d'amélioration de contraste. L'amélioration de la zone tumorale a été observée à partir de 30 min après l'injection et a duré 90 min. Les résultats d'ultrasons in vivo ont montré que les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD généraient assez de bulles dans les tissus tumoraux acides pour produire une réflectivité échogène pour l'imagerie par ultrasons. Comme contrôle, nous avons aussi obtenu des images du foie et des tissus sous-cutanés à différents moments après l'injection des NPs ciblés. Tout au long de la période d'observation, aucune amélioration significative n'a été trouvée dans la zone d'injection sous-cutanée, et l'amélioration dans le foie, qui diminuait avec le temps, était significativement plus faible que celle dans les tumeurs (Fig. 4b). Ce résultat indique que les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD circulant dans le corps au pH physiologique ne produisent pas une quantité substantielle de bulles CO₂ pour l'amélioration du contraste par ultrasons.

IRM des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD

Pour l'IRM in vivo, pour démontrer que les NPs peuvent être utilisées pour l'imagerie tumorale spécifique, les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD ont été injectées directement dans les tumeurs et les muscles. Les résultats ont montré que la zone tumorale exhibait une diminution significative du contraste MR T2 après l'injection des NPs ciblés, et l'intensité du signal diminuait significativement de 8875 à 0 min à 5972 à 120 min après l'injection (Fig. 5a, b). Cependant, avec la même quantité de nanoparticules injectées, la zone musculaire sous-cutanée montrait une diminution de signal T2 beaucoup plus faible. Cette découverte démontre l'efficacité des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD avec agents de contraste T2-MR hypersensibles ciblés par l'intégrine pour une utilisation dans l'imagerie tumorale ciblée. Dans le groupe d'injection en queue de veine, l'imagerie T2-MR a aussi montré une diminution évidente du contraste dans la tumeur à 24 h post-injection, démontrant l'accumulation tumorale élevée des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD (Fig. 5c, d). De plus, des signaux T2 diminués ont été observés dans le foie et les reins, indiquant que les ions fer dans les NPs pouvaient être rapidement éliminés du corps. Par conséquent, l'IRM a révélé que les nanoparticules Fe₃O₄ enveloppées de PLGA exhibaient un ciblage tumoral passif efficace via l'effet de perméabilité et rétention accrue (EPR), surtout le ciblage médié par RGD, mais pouvaient être décomposées et rapidement excrétées in vivo.

Imagerie de fluorescence et histologie

Deux cents microlitres de NPs ont été injectés par voie intraveineuse chez les souris pour l'imagerie de fluorescence in vivo. Dans le groupe injecté avec NPs ciblés RGD, le signal de fluorescence de Cy5.5 augmentait graduellement dans la zone tumorale et atteignait un pic à 4 h après l'injection, indiquant que les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD peuvent s'accumuler efficacement dans la tumeur. Dans le groupe non ciblé, les NPs étaient distribuées dans tout le corps après l'injection et rapidement éliminées, et elles ne s'accumulaient pas dans la tumeur pendant une longue période (Fig. 6a). Les souris ont ensuite été disséquées, et les organes principaux et tumeurs ont été collectés pour l'imagerie de fluorescence in vitro, ce qui a révélé une forte absorption tumorale des NPs ciblés (Fig. 6b, c). L'intensité de fluorescence de Cy5.5 dans les tumeurs des souris injectées avec NPs ciblés était 1,5 fois celle des souris injectées avec NPs non ciblés.

De plus, le ciblage tumoral spécifique des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD a été vérifié par l'imagerie de fluorescence de sections tumorales congelées (Fig. 7a). La coloration immunofluorescente de sections tumorales avec des anticorps contre les intégrines αv et β3 a révélé une expression significative de l'intégrine αvβ3 dans les tissus tumoraux. La fluorescence de l'intégrine αv et β3 a été fusionnée avec la fluorescence Cy5.5 des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD pour obtenir une image de coloration immunohistochimique révélant la colocalisation. Les résultats d'immunofluorescence dans les tissus tumoraux indiquaient que les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD se lient spécifiquement à l'intégrine αvβ3 dans le cancer du sein malin MB231. De plus, la coloration H&E des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD comparée au groupe non ciblé a montré que toutes les sections de tissus d'organes avaient une morphologie pathologique normale et aucune réponse de dommage histopathologique (Fig. 7b). Tous les résultats de l'analyse de cytotoxicité et histologique ci-dessus indiquaient que les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD n'induisaient pas de toxicité significative aux tissus d'organes majeurs in vivo, et leur bonne biocompatibilité peut être raisonnablement attribuée au PLGA.

Conclusions

En conclusion, les résultats ci-dessus démontrent une approche créative et réussie pour l'IRM du cancer du sein à travers un ciblage magnétique et un système générateur de gaz qui est activé dans le microenvironnement tumoral. Les NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD exhibent une excellente performance d'imagerie et une bonne biocompatibilité dans les modes d'imagerie MR/ultrasons/fluorescence. Notre travail montre le fort potentiel pour le diagnostic tumoral avec une imagerie multi-modale améliorée.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA) (lactide:glycolide = 75:25, Mw = 20 000), colorant Cyanine5.5, et alcool polyvinylique (PVA) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Company (Shanghai, Chine). Le peptide RGD a été synthétisé sur mesure par GenicBio BioTech Co. Ltd. (Shanghai, Chine). Les nanoparticules Fe₃O₄ et le carbonate de sodium (Na₂CO₃) ont été achetés auprès de Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, Chine). Dichlorométhane (CH₂Cl₂) et diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été obtenus auprès de Solarbio Company (Pékin, Chine). Tous les produits chimiques étaient de grade analytique.

Synthèse des nanoparticules Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD

Premièrement, 12,5 mg de PLGA et 0,25 mL de chloroforme ont été mélangés ensemble. Ensuite, 5 μL de Cy5.5, 15 μL de nanoparticules magnétiques modifiées à l'acide oléique dispersées dans le chloroforme (OA@Fe₃O₄, 10 mg/mL), 5 μL de carbonate de sodium (Na₂CO₃), et 1,5 mL de solution PVA 1 % ont été ajoutés en séquence et émulsionnés avec un processeur ultrasonique pendant 2 min. Ensuite, 12,5 mL de solution PVA 0,3 % ont été ajoutés et agités pendant 3-4 h à température ambiante, et 12,5 mL de solution PVA 0,4 % ont été ajoutés pour agitation (500 tr/min) pendant la nuit pour éliminer le solvant organique résiduel. La solution ci-dessus a été soumise à plusieurs lavages par ultrafiltration avec ddH₂O et puis diluée avec un tampon PB (pH = 7,4) à un volume final de 1,25 mL. Ensuite, 0,25 mg d'EDC et 1,25 mg de NHS ont été ajoutés à la solution mixte ci-dessus. Le mélange a été agité pendant 30 min à 25 °C et puis lavé trois fois par ultrafiltration et resuspendu dans une solution tampon PB (pH = 7,4). Ensuite, 1,25 mg de cRGD a été ajouté à la solution et agité à 4 °C pendant la nuit. Pour éliminer EDC, NHS et tout cRGD résiduel, la solution transparente a été filtrée par un tube d'ultrafiltration. Finalement, les NPs Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD ont été resuspendues dans 1,25 mL d'eau déionisée et stockées à 4 °C.

Caractérisation des nanoparticules

Les diamètres dynamiques et le potentiel zêta des nanoparticules ont été mesurés par un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK). La morphologie des nanoparticules a été obtenue en utilisant un microscope électronique à transmission FEI Tecnai F20. Le chargement de Cy5.5 a été enregistré par un spectromètre de fluorescence Hitachi F-7000. Le FTIR a été réalisé en utilisant un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (Alpha II, Bruker, Suisse). Un magnétomètre à échantillon vibrant (VSM, Lake Shore 7410) a été appliqué pour déterminer la courbe d'hystérésis des nanoparticules et du Fe₃O₄ libre.

Cellules et animaux

Les cellules de cancer du sein humain MDA-MB-231 ont été gracieusement fournies par la Banque de Cellules Souches, Académie Chinoise des Sciences. Les cellules étaient maintenues à 37 °C dans 95 % d'air et 5 % CO₂. Des souris BALB/c femelles (4 semaines) ont été achetées auprès de Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. et maintenues selon des protocoles approuvés par le Centre des Animaux de Laboratoire de l'Université Médicale du Guangxi. Les expériences sur animaux ont été suivies avec le Guide pour le Soin et l'Utilisation des Animaux de Laboratoire, publié par le Comité d'Éthique des Animaux du Centre des Animaux de Laboratoire, Université Médicale du Guangxi. Les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 ont été transplantées dans le flanc droit de souris BALB/c (2 × 10⁶ en 200 μl cellules par souris) et laissées croître pendant 10-14 jours (diamètre moyen 5 mm) avant l'imagerie.

Expression cellulaire de l'intégrine αv

L'immunofluorescence cellulaire a été réalisée pour confirmer l'expression élevée de l'intégrine αv dans les cellules MDA-MB-231. Les cellules A549 et MCF-7 ont été utilisées comme contrôles. Les cellules ont été ensemencées sur des plats de culture à fond de verre de 35 mm (MatTek, USA) à 2 × 10⁴ cellules mL⁻¹ pendant 24 h. Après incubation, les cellules ont été fixées pendant 20 min à température ambiante avec 4 % de paraformaldéhyde. Ensuite, elles ont été incubées avec un anticorps monoclonal anti-intégrine αv de lapin (ab179475, Abcam) à 4 °C pendant la nuit et un anticorps anti-IgG de lapin pendant 1 h à température ambiante. Finalement, les cellules ont été colorées avec DAPI. Les images ont été acquises par microscopie confocale à balayage laser (TCS SP8, Leica, Allemagne).

Pour évaluer l'efficacité de ciblage des nanoparticules, une étude d'internalisation cellulaire a été réalisée en utilisant la microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Les cellules ont été ensemencées sur des plats de culture à fond de verre de 35 mm (MatTek, USA) à 2 × 10⁴ cellules mL⁻¹ pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été incubées avec NPs ciblés RGD (30 μg mL⁻¹, 0,5 mL) à pH 7,4 pendant 2 h, et les NPs non ciblés ont été utilisés comme contrôles. Après incubation, les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 20 min et puis incubées avec l'anticorps αv. Au moyen de la colocalisation, nous avons vérifié la liaison ciblée des nanoparticules à l'intégrine sur les cellules.

Essai CCK8

La biocompatibilité des nanoparticules Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD a été évaluée par une étude de cytotoxicité. Les cellules MDA-MB-231, A549 et MCF-7 ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits à 5 × 10³ cellules mL⁻¹ pendant 24 h. Ensuite, 0,1 mL de suspension de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD à des concentrations de Fe de 5, 10, 20, 40 et 80 μg/mL a été ajouté à chaque puits et incubé pendant 24 h. Finalement, 10 μL de solution CCK8 a été ajouté, et la suspension a été incubée pendant 1 h supplémentaire. Les résultats ont été déterminés par un lecteur de microplaques (Thermo Scientific, USA) à 450 nm.

Imagerie par ultrasons avec rehaussement de contraste

L'imagerie par ultrasons des nanoparticules a été réalisée en utilisant un système Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Canada). Les NPs ciblées RGD et non ciblées ont été ajoutées au modèle d'agarose, et le PBS a été utilisé comme contrôle. Les images ont été enregistrées en mode B et mode CEUS avec différents tampons pH de 7,2 et 6,8. La zone d'intérêt a été tracée, et la valeur grise moyenne a été mesurée dans les images en mode B.

Pour l'imagerie par ultrasons in vivo, les souris ont été anesthésiées avec 2 % d'isoflurane (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., Chine), et la température corporelle a été maintenue à 37 °C avec un tapis chauffant. Un total de 200 μL de NPs ciblées RGD a été injecté via la queue de veine. Les animaux témoins ont reçu une injection sous-cutanée avec la même quantité de NPs. Les images ultrasoniques ont été enregistrées en utilisant un transducteur 7 MHz pour acquérir continuellement des images ultrasoniques des tumeurs, foies et zones sous-cutanées. La zone de focus acoustique a été placée au centre de la tumeur avec la plus grande section transversale, et un champ de vision contenant la tumeur et son tissu adjacent a été obtenu.

Imagerie par résonance magnétique

Les examens IRM des NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD ont été effectués en utilisant un IRM 3,0 T (GE Healthcare, USA) et une bobine animale (RF TECH LIMITED, Chine). Les NPs avec différentes concentrations de Fe de 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 et 1 mM ont été scannées dans des tubes Eppendorf de 1 mL, et le PBS a été utilisé comme contrôle. L'IRM T2 a été réalisée pour chaque tube en utilisant une séquence FSE pondérée T2 (épaisseur de coupe 3 mm, TR/TE 2000/74,4 ms, FOV 8 × 8 cm, et matrice 320 × 256). Les relaxivités (r2) ont été calculées par un ajustement linéaire du temps de relaxation inverse en fonction de la concentration de Fe.

Pour l'IRM in vivo, les souris ont été aléatoirement divisées en deux groupes (n = 3) pour le balayage MR qui ont reçu soit (1) une injection locale de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD dans les tissus musculaires et tumoraux sous-cutanés ou (2) une injection en queue de veine de NPs Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD. Les images de base des souris ont été prises avant l'injection des nanoparticules. Pour le groupe un, la même quantité de NPs a été injectée dans les tissus sous-cutanés et tumoraux, et le balayage IRM a été effectué toutes les 30 min pour enregistrer la transition de signal des tissus. Pour le groupe deux, l'imagerie tumorale a été réalisée dans les positions axiale et coronale, et les paramètres MR étaient les mêmes que ceux utilisés pour l'imagerie in vitro. L'intensité de signal (SI) dans la région d'intérêt (ROI) a été mesurée et comparée aux signaux tissulaires à différents moments avant et après l'injection.

Imagerie de fluorescence tumorale

Pour l'imagerie de fluorescence in vivo, un système d'imagerie de fluorescence in vivo (FX PRO, Bruker, Suisse) a été utilisé pour le balayage, et les souris ont été aléatoirement divisées en deux groupes (n = 3) : (1) NPs ciblés RGD et (2) NPs non ciblés. Les images ont été capturées toutes les 30 min pendant une période de 4 h après l'injection. Ensuite, les organes importants et tumeurs ont été récoltés et imagés, et la distribution de fluorescence dans les organes du corps a été observée. L'analyse quantitative de l'intensité de fluorescence a été réalisée en utilisant un logiciel d'imagerie moléculaire (Bruker, Suisse). Ces organes importants ont ensuite subi une coloration H&E pour évaluer la toxicité tissulaire. Les sections tumorales congelées ont aussi été soumises à une coloration immunohistochimique de fluorescence avec des anticorps contre les intégrines αv et β3.

Disponibilité des données et matériaux

Les conclusions faites dans ce manuscrit sont basées sur les données qui sont toutes présentées et montrées dans cet article.

Abréviations

Cy5.5 :

Sulfo-Cyanine5.5 NHS ester

DAPI :

4′,6-diamidino-2-phénylindole

EDC :

1-Éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide chlorhydrate

FSE :

Écho de spin rapide (Fast spin echo)

MR :

Résonance magnétique (Magnetic resonance)

NHS :

N-hydroxysuccinimide

PB :

Tampon phosphate (Phosphate buffer)

PBS :

Tampon phosphate salin (Phosphate buffered saline)

PEG :

Polyéthylène glycol (Polyethylene glycol)

PVA :

Alcool polyvinylique (Polyvinyl alcohol)

RGD :

Arginine-glycine-aspartate

TE :

Temps d'écho (Echo time)

TR :

Temps de répétition (Repetition time)