L'artésunate vectorisé par nanoparticules potentialise l'efficacité antitumorale via l'apoptose mitochondriale

Résumé

L'artémisinine et ses dérivés exercent un large spectre d'activités anticancéreuses et induisent des effets significatifs dans les cellules tumorales. Ils sont rapidement absorbés, largement distribués et tuent sélectivement les cellules tumorales. Comme de faibles concentrations d'artésunate (Ats) dépendent principalement de l'oncose pour induire la mort cellulaire, leurs effets antitumoraux sont limités. Pour obtenir de meilleurs effets, nous avons conçu de nouvelles nanoparticules d'albumine sérique bovine (BSA) chargées en artésunate afin d'atteindre une accumulation mitochondriale de l'Ats et d'induire une apoptose médiée par les mitochondries. Les résultats montrent que, comparées à l'Ats libre qui repose sur la mort oncotique, les nanoparticules BSA-Ats présentent une cytotoxicité plus élevée et des effets apoptotiques significatifs induits par la distribution de l'Ats dans les mitochondries. Cela indique que les nanoparticules BSA-Ats endommagent l'intégrité mitochondriale et activent l'apoptose médiée par les mitochondries en surrégulant les protéines apoptotiques et en facilitant la libération rapide du cytochrome C.

Contexte

L'artémisinine et ses dérivés sont largement utilisés contre le paludisme pour leur forte activité antipaludique et leur faible toxicité. Des recherches ont aussi montré leur activité antitumorale significative, avec peu d'effets secondaires et une bonne tolérance. L'artésunate (Ats) inhibe définitivement la croissance des cellules tumorales et induit des effets anticancéreux significatifs. Des expériences indiquent que l'Ats cause différents degrés d'apoptose et d'oncose après 48 h, dépendants de la dose. À faibles concentrations, l'Ats n'induit pas d'apoptose évidente et la mort cellulaire s'accompagne d'une mort de type oncose. Pour obtenir de meilleurs effets antitumoraux, des doses plus élevées d'Ats étaient utilisées, mais cela confirmait sa toxicité sérieuse et sa suppression de la moelle osseuse. Il est donc nécessaire de trouver un traitement efficace pour réduire la dose efficace d'Ats et améliorer son efficacité antitumorale.

Les mitochondries jouent un rôle clé dans la régulation des effets apoptotiques et oncotiques de l'Ats. Elles régulent aussi la transduction de divers signaux apoptotiques. Quand les mitochondries sont attaquées par des médicaments, leur perméabilité augmente et le potentiel de membrane diminue, entraînant un gonflement de la membrane mitochondriale interne et la libération rapide du cytochrome C dans le cytoplasme. De plus, certaines protéines de la famille des caspases sont activées, induisant la cascade de l'apoptose cellulaire.

Pour améliorer les effets antitumoraux de l'Ats, de nouvelles techniques ont tenté d'augmenter la distribution du médicament dans les cellules tumorales ou d'améliorer la délivrance ciblée vers les organites cellulaires. Les nanoparticules (NP), en tant qu'outil clé du traitement ciblé du cancer, ont été largement étudiées et montrent un potentiel prometteur. Grâce à leur petite taille et grande surface, elles peuvent entrer dans la circulation sanguine, traverser les jonctions endothéliales et migrer vers le site tumoral, réalisant une distribution ciblée et améliorant la biodisponibilité. De plus, les NP peuvent contrôler la libération du médicament par dégradation du biomatériau, prolongeant la demi-vie d'élimination, améliorant la concentration sanguine efficace et réduisant la fréquence de dosage. Surtout, les NP chargées en médicament peuvent être délivrées à des emplacements spécifiques dans les cellules, améliorant l'efficacité du traitement.

Pour améliorer les effets antitumoraux de l'Ats à faibles concentrations, nous avons conçu de nouvelles NP BSA chargées en Ats. En raison du pH bas dans les cellules tumorales, l'accumulation de protons sur la membrane mitochondriale externe crée un potentiel transmembranaire électropositif à l'extérieur et négatif à l'intérieur, favorisant la délivrance de BSA. L'accumulation massive d'Ats dans les mitochondries peut ainsi déclencher efficacement l'apoptose médiée par les mitochondries. Les résultats montrent que, comparée à la mort oncotique typique induite par l'Ats libre, l'Ats est spécifiquement transférée dans les mitochondries via les NP BSA et favorise l'activation mitochondriale des protéines caspases apoptotiques, déclenchant une apoptose significative et soulignant la cytotoxicité plus élevée.

Méthodes

Matériaux

La BSA a été achetée chez Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), l'Ats chez Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, Chine). Les lignées cellulaires SMMC-7721 et Plc proviennent de l'Institut de Biochimie et Biologie Cellulaire de l'Académie Chinoise des Sciences (Shanghai, Chine). Tous les autres réactifs étaient de grade analytique.

Préparation et caractérisation des NP BSA chargées en Ats

Les NP BSA-Ats ont été préparées par une méthode de désolvatation selon la littérature. Brièvement, 1,0 mL d'alcool anhydre contenant une certaine quantité d'Ats a été ajouté rapidement à 0,5 mL de solution BSA à 37 °C jusqu'à opalescence. Après évaporation de l'éthanol, les NP ont été précipitées, puis 8 % de glutaraldéhyde (0,5 μL/mg BSA) a été ajouté pour induire le réticulage sous agitation pendant 24 h. Les NP ont été collectées et lavées trois fois à l'eau déionisée pour analyser leurs caractérisations physiques : diamètre hydrodynamique, indice de polydispersité (PDI), potentiel zêta et morphologie (Zetasizer Brookhaven, MET JEM-1200EX). L'efficacité d'encapsulation de l'Ats a été déterminée par une méthode rapportée.

Test MTT

Deux lignées tumorales (SMMC-7721 et Plc) ont été incubées avec 20 % FBS. La densité cellulaire ajustée à 1 × 10⁶ cellules/mL, puis diluée à 1 × 10⁵ cellules/mL. Les suspensions ont été ajoutées dans des plaques 96 puits (100 μL/puits, ~1 × 10⁴ cellules/puits) pour 24 h à 37 °C, 5 % CO₂, 95 % O₂. Le milieu a été remplacé par un milieu sans sérum contenant Ats libre ou NP BSA-Ats à différentes concentrations, incubé 24 h. 50 μL de MTT (5 mg/mL) ajoutés par puits pour 4 h. Après centrifugation (1000 rpm, 5 min), le surnageant éliminé, 150 μL DMSO ajouté pour dissoudre les cristaux. L'absorbance mesurée à 490 nm (Synergy-2, BioTek).

Distribution intracellulaire des NP BSA

Les cellules SMMC-7721 et Plc en phase logarithmique ont été traitées à la trypsine, concentration ajustée à 1 × 10⁶ cellules/mL. Cultivées en plaques 6 puits pour adhérence, puis incubées avec NP BSA marquées au rhodamine B. Le noyau coloré au Hoechst (bleu) 15 min à 37 °C, les mitochondries au MitoTracker Green FM. La localisation des NP BSA suivie par microscopie confocale (FluoView FV10i, Olympus).

Variation du potentiel de membrane mitochondriale

JC-1 permet de déterminer les changements de potentiel mitochondrial. Potentiel élevé : JC-1 forme des agrégats rouges dans les mitochondries (excitation 525 nm, émission 590 nm). Potentiel diminué : JC-1 passe au cytoplasme, monomère vert fluorescent (excitation 490 nm, émission 530 nm). Les cellules ensemencées dans des plats confocaux à 1 × 10⁶ cellules/mL pour 12 h. Milieu remplacé par milieu sans sérum contenant Ats ou NP BSA-Ats. Après 9 h, lavage PBS, ajout de 2 mL JC-1 (2 μmol/L), incubation 30 min à 37 °C à l'obscurité. Observation au microscope confocal laser (FluoView FV10i).

Mesure de la production de ROS et coloration du réticulum endoplasmique (RE)

Cellules incubées avec 20 % FBS, densité 1 × 10⁶ cellules/mL, diluées à 1 × 10⁵ cellules/mL, ajoutées en plaques 96 puits (100 μL/puits, ~1 × 10⁴ cellules/puits) pour 24 h à 37 °C, 5 % CO₂, 95 % O₂. Ats libre et NP BSA-Ats incubés 6, 12, 24 h, puis 10 μM DCFH-DA (Sigma) 30 min. Lavage PBS à froid pour éliminer NP non internalisées. Fluorescence DCF (excitation 485 nm, émission 530 nm) détectée au lecteur de plaques (Synergy-2, BioTek) pour évaluer le stress oxydatif. Groupes test traités 24 h, sonde ER-Tracker Blue-White DPX (Molecular Probes) ajoutée 30 min. Après lavage PBS, morphologie du RE observée par microscopie confocale.

Évaluation oncose/apoptose par cytométrie de flux

Selon notre protocole antérieur, un test de coloration Annexin V-FITC/iodure de propidium (PI) a évalué l'oncose et l'apoptose induites par Ats libre et NP BSA-Ats. Cells lysées à la trypsine, ensemencées en plaques 6 puits à 1 × 10⁶ cellules/mL pour 24 h. Milieu remplacé par milieu sans sérum contenant Ats libre et NP BSA-Ats. Après traitement, cellules collectées et suspendues dans tampon Nicoletti (Beijing 4A Biotech) contenant PI et Annexin V-FITC. Changements morphologiques observés au confocal. Pour vérifier les taux d'apoptose et d'oncose, les pourcentages de cellules apoptotiques précoces (Q4), oncotiques (Q2), nécrotiques (Q1) et vivantes (Q3) quantifiés par cytométrie de flux.

Analyse Western blot des protéines apoptotiques et cytochrome C

Un essai Western blot a déterminé les niveaux de protéines relatives après incubation 24 h d'Ats libre ou NP BSA-Ats avec cellules SMMC-7721. Cellules lysées dans tampon RIPA froid avec inhibiteurs de protéases et phosphatases (Roche). Concentrations protéiques dosées par kit BSA modifié (Thermo Fisher) et normalisées avant chargement sur gel SDS-PAGE 10 %. Niveaux des protéines cibles photographiés et analysés par système UVP (iBox Scientia 600).

Résultats

Caractéristiques des NP BSA-Ats et étude de viabilité cellulaire

Les NP BSA-Ats présentent une forme sphérique, dispersées homogènement avec PDI faible (0,016). Taille moyenne ~99,9 ± 2,3 nm, potentiel zêta négatif ~-25,6 ± 4,3 mV. Le profil de libération montre une libération lente et soutenue (Fig. 1c). Comparé à la libération rapide de l'Ats libre (>85 % en 6 h), l'Ats piégé dans le cœur des NP diffuse lentement, libérant 78,9 % en 48 h. Cela indique que les NP contrôlent la libération via la dégradation du biomatériau, prolongeant la demi-vie, améliorant la concentration sanguine efficace et réduisant la fréquence de dosage.

Le test MTT montre que la cytotoxicité de l'Ats libre augmente avec la concentration, et les NP BSA-Ats présentent une cytotoxicité graduellement accrue. Les deux inhibissent la croissance tumorale, ratio d'inhibition dose-dépendant. Comparé à l'Ats libre, les NP BSA-Ats démontrent une cytotoxicité et sensibilité plus élevées dans les deux lignées, avec une inhibition cellulaire plus grande. Les IC50 pour SMMC-7721 et Plc avec NP BSA-Ats sont 50,1 et 44,9 μg/mL (24 h), contre 69,2 et 74,9 μg/mL pour Ats libre. Cela indique que l'Ats chargé dans les NP BSA change sa localisation intracellulaire, tuant plus de cellules.

Capture cellulaire in vitro des NP BSA

La distribution intracellulaire des NP BSA observée par microscopie confocale (Fig. 2). Après 3 h de co-culture avec NP marquées rhodamine B, fluorescence rouge visible dans le cytoplasme ; avec le temps, la majorité des NP internalisées diffusent dans le cytoplasme, fluorescence rouge accrue. Les NP BSA dans le cytoplasme se colocalisent avec les mitochondries (fluorescence jaune = fusion rouge NP + vert MitoTracker), prouvant l'accumulation spécifique des NP BSA dans les mitochondries, suggérant que l'Ats peut y être délivré via les NP BSA.

Analyse du potentiel de membrane mitochondriale

Pour clarifier si les NP BSA-Ats interfèrent avec la fonction mitochondriale après délivrance d'Ats, les changements de potentiel ont été déterminés (Fig. 3). Après coloration JC-1, les mitochondries des cellules traitées Ats libre montrent une forte fluorescence rouge, faible verte, indiquant JC-1 agrégé, intégrité mitochondriale préservée, potentiel élevé. À l'inverse, les cellules traitées NP BSA-Ats montrent une fluorescence verte plus forte, indiquant membrane mitochondriale sérieusement endommagée, potentiel significativement diminué. Cela prouve que l'Ats est délivré avec succès aux mitochondries via les NP BSA, entraînant une dépolarisation mitochondriale.

Mesure ROS et coloration RE

La génération massive de ROS cause la peroxydation des phospholipides de la membrane mitochondriale interne et diminue le potentiel mitochondrial, libérant le cytochrome C. DCFH-DA comme sonde fluorescente détecte les ROS. DCFH-DA traverse la membrane, hydrolysé en DCFH par estérases, piégé dans la cellule. ROS intracellulaires oxydent DCFH non fluorescent en DCF vert fluorescent. La fluorescence DCF indique le niveau ROS intracellulaire.

Les deux lignées traitées Ats libre et NP BSA-Ats montrent une augmentation ROS temps-dépendante. Comparé à l'Ats libre, la génération ROS avec NP BSA-Ats est significativement amplifiée. Après 48 h, les niveaux ROS dans SMMC-7721 et Plc augmentent 1,53 et 1,28 fois vs Ats libre. Cela soutient l'accélération de la production ROS intracellulaire par les NP. Comparé au contrôle et Ats libre, après traitement NP BSA-Ats, l'intensité de fluorescence ER-Tracker augmente significativement, suggérant un stress RE déclenché avec augmentation ROS. Cela confirme que l'Ats localisé dans les mitochondries via NP BSA augmente les radicaux libres, déclenche le stress RE et active la voie apoptotique mitochondriale caspase-dépendante.

Évaluation apoptose/nécrose

Test Annexin V-FITC/PI. Cellules vivantes : pas de fluorescence. Apoptotiques : Annexin V-FITC seul (vert). Oncogènes : membrane endommagée, noyau fragmenté, vert + rouge. Fig. 5a : comparé au contrôle, Ats libre et NP BSA-Ats induisent oncose et apoptose (vert + rouge forts). Surtout avec NP BSA-Ats, intensités Annexin V-FITC et PI significativement accrues, indiquant oncose et apoptose amplifiées.

Pourcentages (Fig. 5b) : Ats libre → taux oncose 24,4 % et 4,6 %, apoptose 4,9 % et 7,1 % (SMMC-7721, Plc). NP BSA-Ats → apoptose 10,9 % et 11,5 %, oncose 29,0 % et 21,6 %. La délivrance mitochondriale d'Ats via NP BSA accélère la mort tumorale en amplifiant oncose et apoptose. NP BSA-Ats déclenchent la transduction du signal apoptotique et favorisent la cascade apoptotique médiée par les mitochondries.

Analyse Western blot

Pour explorer la mort cellulaire par apoptose induite par Ats libre et NP, Western blot des protéines apoptotiques. Dans cellules SMMC-7721 traitées NP BSA-Ats, expression Bax significativement augmentée (Fig. 6). Cela suggère qu'avec les NP BSA, l'Ats s'accumule dans les mitochondries et cause leur dysfonction. Le monomère Bax cytoplasmique se transfère à la membrane externe mitochondriale, s'oligomérise, forme un canal, augmentant la perméabilité. L'expression du cytochrome C cytoplasmique est particulièrement augmentée, ainsi que caspase-3 et caspase-9. Donc, par perméabilité accrue, cytochrome C libéré rapidement dans le cytoplasme, active les caspases et promeut la cascade apoptotique. En contraste, Ats libre n'a pas d'effet significatif sur l'expression des protéines apoptotiques et cytochrome C, suggérant qu'il ne déclenche pas l'apoptose médiée par les mitochondries et repose principalement sur l'oncose. Les NP BSA augmentent l'accumulation mitochondriale d'Ats et activent les effets apoptotiques médiés par les mitochondries, menant à une apoptose significative et augmentant l'expression des protéines apoptotiques primaires.

Discussion

Oncose et apoptose sont deux voies de mort cellulaire. L'apoptose est un processus actif de mort programmée. L'oncose décrit une mort caspase-indépendante, caractérisée par gonflement, perméabilité accrue, rupture membranaire, souvent appelée nécrose, considérée accidentelle et non contrôlée. Notre étude montre que l'Ats inhibe la croissance tumorale, ratio dose-dépendant. L'Ats dépend principalement de l'oncose pour la mort cellulaire, activant la mort caspase-indépendante (oncose). Inversement, avec NP BSA-Ats, celles-ci sont internalisées, rapidement localisées dans les mitochondries pour libérer l'Ats. L'Ats mitochondrial génère ROS, déclenche stress RE, active la voie apoptotique caspase-dépendante médiée par les mitochondries en réduisant le potentiel mitochondrial, libérant cytochrome C, favorisant l'expression de Bax, caspase-3 clivée, caspase-9. Ensemble, NP BSA-Ats augmentent la délivrance mitochondriale d'Ats et amplifient oncose et apoptose, augmentant la cytotoxicité et induisant une mort cellulaire significative.

Conclusions

En résumé, l'Ats libre dans les cellules tumorales dépend fortement de l'oncose pour inhiber la prolifération (mort de type oncose) ; cytotoxicité limitée. En contraste, NP BSA-Ats activent la voie apoptotique mitochondriale et déclenchent simultanément des effets oncotiques ; ensemble, ils potentialisent l'efficacité antitumorale synergique. L'étude souligne l'importance des NP BSA-Ats pour améliorer les effets cytotoxiques et apoptotiques de l'Ats, et le rôle des NP BSA dans la diversification des voies de mort cellulaire induites par l'Ats. Comparé à l'Ats libre, NP BSA-Ats induisent une cytotoxicité plus grande et une apoptose significative dans les cellules tumorales.