Les nanovecteurs tétraèdres d'ADN potentialisent l'apoptose médiate par doxorubicine dans les cellules cancéreuses du côlon HT-29

Résumé

En tant que vecteur nanoscopique avec l'avantage de la modifiabilité et d'une biocompatibilité appropriée, la livraison par tétraèdre d'ADN (ADN tétra) est prometteuse pour améliorer l'efficacité inhibitrice de médicaments anticancéreux non ciblés. Dans cette investigation, la doxorubicine (Dox) a été assemblée sur un tétraèdre d'ADN modifié à l'acide folique via chimie click pour préparer un agent antitumoral ciblé. L'efficacité d'absorption cellulaire a été mesurée par imagerie fluorescente. La cytotoxicité, l'efficacité d'inhibition et le mécanisme correspondant sur la lignée de cellules cancéreuses du côlon HT-29 ont été évalués par test MTT, courbe de prolifération cellulaire, western blot et cytométrie de flux. Aucune cytotoxicité n'a été induite par l'ADN tétra, mais le ratio d'absorption cellulaire a augmenté nettement grâce à la pénétration facilitée à travers la membrane cellulaire par l'ADN tétra. En conséquence, l'acide folique-ADN tétra-Dox a markedly augmenté l'efficacité antitumorale avec des niveaux d'apoptose accrus. En détails, 100 µM était la concentration effective et une période d'incubation de 6 h était nécessaire pour l'induction d'apoptose. En conclusion, le tétraèdre d'ADN nanoscopique était un système de livraison sûr et efficace pour la Dox et a correspondantement amélioré l'efficacité anticancéreuse.

Contexte

La doxorubicine (Dox) est l'un des agents antinéoplasiques les plus largement utilisés, et de nombreuses études cliniques ont démontré que la Dox peut entraver significativement la croissance des cellules tumorales dans divers cycles cellulaires en inhibant la synthèse de l'ARN et de l'ADN [1, 2]. Des études antérieures suggéraient que la prolifération des cellules tumorales était efficacement bloquée en phase G1, et la métastase aussi inhibée par la Dox à une certaine concentration [3]. De plus, une inhibition efficace peut être atteinte à une dose relativement plus faible comparée aux autres médicaments anticancéreux [4]. Cependant, la Dox induit habituellement des effets secondaires résultant du manque de ciblage spécifique pour les cellules tumorales et de l'inhibition non sélective de l'ADN et de l'ARN, ce qui limite sérieusement les applications cliniques [5, 6]. Parallèlement, la faible capacité d'absorption cellulaire réduit l'accumulation de Dox dans les cellules tumorales [7]. Par conséquent, un système de livraison efficace pour la Dox devrait être développé pour rendre la Dox plus spécifique et efficace en ciblage, plus facilement encapsulable, et dotée d'une excellente capacité d'absorption et biocompatibilité.

Les vecteurs nanoscopiques, tels que liposomes et nanoparticules inorganiques, peuvent faciliter la pénétration de la Dox à travers la membrane des cellules tumorales, améliorant l'efficacité de ciblage [8]. Néanmoins, la livraison basée sur liposomes ne peut réduire les effets secondaires sur cellules normales en raison du ciblage relativement pauvre ; pendant ce temps, les vecteurs inorganiques, comme les nanoparticules de silice mésoporeuse, ne peuvent être complètement biodégradés in vivo, entravant le processus de nouvelle absorption de médicament et apportant une toxicité potentielle. Pour ces systèmes de livraison fonctionnels, la complexité de préparation, l'inhomogénéisation des structures nanoparticulaires et le faible rendement d'encapsulation entravent les expansions cliniques [9,10,11]. En tant que vecteur nanoscopique avec d'excellentes performances en livraison de médicaments, les structures à base d'ADN, comme le tétraèdre d'ADN (ADN tétra), peuvent pénétrer la membrane en évitant l'incompatibilité entre l'ADR électro-négatif et la membrane plasmique [12-17]. Médicaments et molécules de ciblage peuvent être tous deux attachés covalentement au tétraèdre d'ADN. De plus, l'absorption facile et la biodégradation des séquences tétraédriques d'ADN évitent la rétention prolongée. Les médicaments aptamères riches en guanine, comme AS1411, ont été livrés avec succès dans les cellules tumorales A549 et ont agi comme agents de ciblage et inhibiteurs [18]. Les facteurs de régulation immunitaire, comme CpG et siRNA, peuvent aussi être livrés aux cellules tumorales via le vecteur ADN tétra pour réguler les réponses immunitaires [19]. Avec les avantages de faible toxicité, biocompatibilité appropriée et ciblage ajustable, l'ADN tétra a montré une biosécurité et des potentiels pour la livraison de Dox.

Dans cette étude, des particules fonctionnelles de tétraèdre d'ADN assemblées avec Dox comme médicament anticancéreux et acide folique comme molécules de reconnaissance spécifiques [20], ont été conçues, synthétisées et caractérisées. L'efficacité anticancéreuse a été évaluée sur cellules cancéreuses du côlon considérant les récepteurs au folate significativement surrégulés à la surface de la membrane cellulaire. Spécifiquement, le niveau d'absorption cellulaire, le degré d'apoptose induite par Dox et l'inhibition de la prolifération cellulaire ont été mesurés sur lignées HT-29.

Méthodes

Réactifs et équipement

Les chaînes oligonucléotidiques d'ADN ont été achetées chez TAKARA à Dalian, Chine. Le milieu DMEM modifié de Dulbecco et le sérum fœtal bovin ont été achetés chez Gibco à NY, USA. Pénicilline et streptomycine ont été achetés chez Beyotime biotechnology à Shanghai, Chine. Acide folique, doxorubicine, bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT) et agarose ont été achetés chez Sigma-Aldrich à MO, USA. Tous les anticorps ont été achetés chez Abcam Company à Shanghai, Chine. Les autres réactifs ont été achetés chez Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd., à Shanghai, Chine.

Spectrophotomètre UV-Vis (Thermo Evolution 201) et incubateur à température constante ont été achetés chez Thermo Fisher aux USA ; centrifugeuse (GT10-1) chez Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd. ; spectrophotofluorimètre (UV-1800) chez Shimadzu Corporation. Microscopie confocale à balayage laser (Visitech) chez Leica ; instrument PCR (T100), électrophorèse protéique et acides nucléiques chez Bio-Rad ; analyseur de taille de particules par diffusion dynamique de lumière chez Beckman ; plaques de culture 96 ou 24 puits chez Dow Corning Corporation. Chromatographie liquide haute performance (HPLC, Agilent 1200) avec colonne C18 chez Agilent Technologies.

La lignée de cellules cancéreuses du côlon humaine HT-29 était maintenue en DMEM supplémenté avec 10 % sérum fœtal bovin, 100 U/mL pénicilline et 100 µg/mL streptomycine dans une atmosphère humidifiée contenant 95 % air et 5 % dioxyde de carbone à 37 °C.

Synthèse et purification du tétraèdre d'ADN

Dans cette investigation, la synthèse a suivi les procédures schématiques de la Fig. 1, et les séquences d'ADN simple brin (ssADN) du tétraèdre d'ADN sont fournies en Fig. 1 également. En détails, chaque ssADN était dissous dans tampon 0,5× TE, et la valeur de densité optique (DO) correspondante de l'ADN était déterminée par spectrophotomètre UV à 260 nm. Du tampon TE additionnel était suppléé pour amener les quatre chaînes à la même concentration. Le rapport de mélange des quatre ssADN était 1:1:1:1 à 1 µM dans 100 µL. La réaction était effectuée dans un appareil PCR avec conditions de cyclage : 95 °C, 10 min, refroidissement naturel à 4 °C. Tous les ssADN étaient purifiés par HPLC avec 260 nm comme pic d'absorption caractéristique. Dans le spectre HPLC, le temps de pic de l'ADN tétra était plus rapide que celui du brin simple, et le produit était collecté au point de temps correspondant.

Synthèse et caractérisation de l'acide folique-ADN tétra-Dox

Les groupes hydrogène libres de Dox et acide folique étaient modifiés avec groupe azide puis couplés au 3'-OH du ssADN via réaction click chemistry [21]. En ajoutant différentes quantités de ssADN marqués groupe fonctionnel, le rapport des groupes fonctionnels pouvait être contrôlé stœchiométriquement via hybridation spécifique des chaînes latérales. Pour la synthèse de l'acide folique-ADN tétra, le rapport molaire acide folique et tétraèdre d'ADN était fixé à 1:1. Pour la synthèse de l'ADN tétra-Dox, le rapport molaire Dox et tétraèdre d'ADN était fixé à 4:1. Pour la synthèse de l'acide folique-ADN tétra-Dox, le rapport molaire acide folique, tétraèdre d'ADN et Dox était respectivement fixé à 1:1:3. Toutes les synthèses étaient menées au niveau micromolaire à 37 °C puis stockées à 4 °C [22].

Dans cette étude, la série de complexes ADN tétra était caractérisée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) avec gel de séparation 8 % (39 % Acr-Bis) pour vérifier la pureté et les tailles moléculaires relatives. Les échantillons consistaient des différentes structures ADN tétra et tampon de chargement 6× avec rapport de mélange 2:1. Les échantillons étaient colorés et analysés après électrophorèse 90 min à 110 V. Pour déterminer les différences de tailles de particules, les échantillons ADN tétra étaient aussi scannés par instruments de diffusion dynamique de lumière (DLS) avec lumière dynamique.

Absorption cellulaire facilitée par ADN tétra

Pour les différentes structures de couplage conçues dans cette recherche, les taux d'absorption par cellules HT-29 étaient comparés pour déterminer l'efficacité de livraison du médicament. L'efficacité d'absorption cellulaire était évaluée et quantifiée en utilisant le spectre de fluorescence caractéristique de Dox, soit excitation à 470 nm et émission à 590 nm. Les cellules HT-29 à 2 × 10⁵/mL étaient ensemencées en plaques 24 puits et cultivées 24 h. Les cellules étaient incubées avec diverses structures ADN tétra à 10 µM pendant 24 h supplémentaires. Le milieu était alors éliminé, et les cellules rincées trois fois avec PBS. Pour la fixation cellulaire, 4 % paraformaldéhyde était ajouté immédiatement à température ambiante pour co-incubation 30 min, et les cellules rincées trois fois PBS à nouveau. Finalement, les plaques 24 puits étaient observées au microscope confocal laser pour comparer l'efficacité d'absorption cellulaire basée sur l'intensité lumineuse d'émission.

Cytotoxicité et efficacité anticancéreuse

La cytotoxicité et l'efficacité anticancéreuse étaient évaluées par test MTT, où une réaction redox se produit entre le MTT en DMSO et la succinate déshydrogénase intracellulaire. Les cellules HT-29 étaient ensemencées en plaques 96 puits et cultivées 24 h.

Pour la cytotoxicité de l'ADN tétra comme vecteur, un milieu contenant des structures ADN tétra à concentration 0-100 µM était ajouté pour 24 ou 48 h d'incubation supplémentaire. Alors, 100 µL de solution MTT (5 mg/mL) était ajouté à chaque puits, et le mélange incubé à 37 °C pendant 4 h. Le liquide était alors retiré, et les cellules lysées et dissoutes avec 200 µL DMSO. L'absorbance du surnageant était mesurée à 570 nm par Microreader. L'échantillon HT-29 non traité était considéré comme groupe témoin.

Pour le tétraèdre d'ADN couplé avec acide folique ou Dox, d'un côté la recherche se concentrait sur la stabilité, la biosécurité et l'efficacité d'inhibition ; de l'autre, si la Dox de l'ADN tétra-Dox avait des propriétés antitumorales comparables qu'avant était aussi exploré. Par conséquent, la cytotoxicité et l'efficacité antitumorale des complexes ADN tétra étaient évaluées. Les complexes respectivement à 100 µM étaient incubés avec cellules HT-29. Des échantillons cellulaires étaient collectés toutes les 6 h et détectés par test MTT pour évaluer l'effet de la période d'incubation. Une attention particulière était portée à la différence d'efficacité anticancéreuse résultant des variations de structures. De plus, les effets de concentration sur l'inhibition de HT-29 après traitement avec acide folique-ADN tétra-Dox étaient évalués à 0-200 µM via tests MTT.

Western blot et cytométrie de flux

Pour caractériser l'apoptose cellulaire induite par Dox facilitée par la livraison ADN tétra, des échantillons protéiques de cellules traitées étaient chauffés et craqués utilisant un liquide de pyrolyse, analysés par SDS-PAGE 12 % sous condition 100 V courant constant pour séparer les échantillons, puis transférés sur membranes PVDF 0,22 µm pendant 1 h. Les échantillons étaient bloqués avec lait écrémé 1 h. Après lavage trois fois avec PBST, les échantillons étaient incubés overnight avec anticorps anti-caspase-3 lapin. Ensuite, les échantillons étaient sondés avec anticorps secondaire chèvre-anti-lapin IgG 1 h puis lavés PBST et imager via système d'imagerie protéique Bio-Rad. De plus, GAPDH était choisi comme protéine de référence interne du fait de son expression stable dans les cellules.

La cytométrie de flux était utilisée pour quantifier les niveaux d'apoptose à la concentration et point de temps sélectionnés via tests MTT. Les cellules HT-29 étaient incubées avec inhibiteurs pendant un temps puis mesurées via cytométrie quantitative utilisant la méthode de double marquage Annexin V-PI.

Quantification de la prolifération cellulaire

La méthode de comptage cellulaire était utilisée pour quantifier la prolifération avec le temps. En détails, après traitement avec acide folique-ADN tétra-Dox pendant un temps à 100 µM, les cellules étaient digérées par trypsine 0,25 % pendant 30 s, puis un volume égal de milieu complet était ajouté pour terminer la réaction. Le surnageant était éliminé après centrifugation 1000 tr/min 3 min, et les cellules resuspendues dans milieu complet. Le nombre de cellules à chaque point de détection était enregistré au microscope optique utilisant plaques de comptage cellulaire, pour tracer la courbe de prolifération cellulaire.

Analyse statistique

Dans cette recherche, les significations des différences étaient déterminées utilisant le test t de Student (bilatéral ; variance égale deux échantillons). P < 0,05 signifie différences significatives entre groupes différents.

Résultats

Préparation de l'acide folique-ADN tétra-Dox

Dans le processus de synthèse spécifique, la Dox était mélangée avec le tétraèdre d'ADN en différentes proportions pour compléter le chargement et l'assemblage de la Dox (poids moléculaire = 543,52) et acide folique (poids moléculaire = 441,4). Comme montré Fig. 2a, du fait que Dox et acide folique sont des monomères avec poids moléculaire relativement bas et similaire, l'ADN en tétraèdre et les conjugués avec une molécule fonctionnelle avaient poids moléculaires grossièrement équivalents. Cependant, l'assemblage de Dox ou acide folique avec les quatre sommets d'ADN du tétraèdre faisait augmenter la taille moléculaire de l'ADN tétra de façon évidente. Comme montré Fig. 2b, la plupart de la taille monomère de l'ADN tétraédral était moins de 15 nm. Avec l'augmentation des groupes de couplage, la structure symétrique de l'ADN tétra était détruite et la médiane des tailles de particules des composés augmentait significativement. En particulier, l'expansion de taille de l'acide folique-ADN tétra-Dox étendait la médiane du diamètre à 20 nm.

Efficacité de livraison du médicament

Après incubation avec différentes structures ADN tétra pendant 24 h, l'efficacité intracellulaire de Dox était évaluée par imagerie fluorescente, où la fluorescence rouge intracellulaire est la fluorescence caractéristique de Dox ; donc, les cellules incubées avec ADN tétra n'exhibaient aucun signal fluorescent comme Fig. 3a, et les signaux rouges des cellules incubées avec complexes acide folique-ADN tétra-Dox et ADN tétra-Dox étaient évidemment plus élevés qu'avec Dox, signifiant l'efficacité d'absorption cellulaire significativement améliorée de Dox résultant de la pénétration facilitée à travers la membrane par l'ADN tétra, ainsi que la stabilité intracellulaire des conjugués entre Dox et ADN tétra.

L'analyse quantitative supplémentaire de l'intensité de fluorescence (Fig. 3b) confirmait les résultats visuels, et il n'y avait pas de différence significative entre complexes acide folique-ADN tétra-Dox et ADN tétra-Dox (P < 0,05). La méthodologie de co-incubation médicaments-cellules entrave l'exposition complète de la capacité de ciblage de l'acide folique. La concentration relativement élevée confirmait la reconnaissance spécifique des récepteurs au folate, qui est théoriquement plus évidente dans les applications in vivo avec le système circulant complexe. En bref, la livraison ADN tétra garantissait l'efficacité anticancéreuse de Dox.

Cytotoxicité et efficacité anticancéreuse

Premièrement, la viabilité des cellules HT-29 co-incubées avec différentes concentrations d'ADN tétra était examinée par test MTT. Il n'y avait pas de cytotoxicité évidente du traitement ADN tétra sur cellules HT-29 à 0-100 µM pour 24 et 48 h (Fig. 4a). Donc, le tétraèdre d'ADN nanoscopique fournissait une plateforme de vecteur de médicament biosûre.

Deuxièmement, résultant de la différence d'efficacité de livraison Dox, l'acide folique-ADN tétra-Dox et l'ADN tétra-Dox exhibaient une efficacité d'inhibition plus significative dans les 48 h (Fig. 4b). Du fait de l'absence de composants anticancéreux effectifs, l'ADN tétra-acide folique menait à une diminution négligeable (< 10 %) de viabilité pendant la co-incubation 48 h. Du fait que Dox ne peut pas objectivement pénétrer la membrane, la diminution de viabilité induite par Dox était moindre que les autres groupes. Particulièrement, l'acide folique-ADN tétra-Dox montrait une diminution plus précoce et significative à 6 h post-incubation, prouvant que le ciblage acide folique aide les médicaments à se localiser à la membrane, et fait agir la Dox plus promptement. Par contraste, l'ADN tétra-Dox a commencé à agir évidemment à 12 h post-incubation, démontrant l'importance des groupes de ciblage.

De plus, des cellules HT-29 étaient traitées avec acide folique-ADN tétra-Dox à 0-200 µM pour détecter la concentration effective (Fig. 4c). La viabilité cellulaire HT-29 déclinait rapidement avec l'augmentation de concentration (0-100 µM) du complexe, mais il n'y avait pas de différences significatives entre 100 et 200 µM, indiquant une manière dose-dépendante de l'acide folique-ADN tétra-Dox, où 100 µM peut être considéré comme concentration effective pour effet antitumoral. En plus, la viabilité cellulaire changeait significativement de 24 à 48 h pour les groupes 10, 20 et 50 µM, indiquant que la période d'incubation était aussi un facteur affectant l'efficacité anticancéreuse basée sur acide folique-ADN tétra-Dox.

Apoptose induite par acide folique-ADN tétra-Dox

En conséquence, basé sur les essais western blot (Fig. 5a), il y avait augmentation significative de l'expression de caspase-3 induite par acide folique-ADN tétra-Dox et ADN tétra-Dox, prouvant que l'apoptose était la voie principale de mort cellulaire induite par Dox.

La cytométrie de flux (Fig. 5b-e) a prouvé que 6 h d'incubation avec acide folique-ADN tétra-Dox à 100 µM induisait 68,7 % d'apoptose. Pendant ce temps, les niveaux d'apoptose induits par Dox et ADN tétra-Dox étaient seulement 32,8 et 60,5 % avec les mêmes conditions d'incubation.

Inhibition de la prolifération cellulaire

Basé sur les tests MTT, 100 µM était la concentration effective pour induction d'apoptose et était sélectionnée dans l'expérience de prolifération cellulaire. Comme montré par la courbe de prolifération cellulaire (Fig. 6), du fait du processus chronophage d'absorption cellulaire, l'inhibition de la prolifération n'était pas totalement montrée pendant le stade précoce de co-incubation. Un effet inhibiteur significatif était présenté après incubation avec acide folique-ADN tétra-Dox pendant plus de 6 h, prouvant l'existence d'endocytose améliorée par ADN tétra. Pendant ce temps, 6 h est une période comparative avec la période effective détectée en Fig. 4b.

Discussion

Comme moyen commun de modification d'ADN, la réaction click chemistry avait avantages de haut rendement réactionnel, bon contrôle et opération facile [21]. L'électrophorégramme affichait une seule bande (Fig. 2a), indiquant que des produits de haute pureté étaient obtenus par couplage covalent via réaction click chemistry. La propriété fluorescente de Dox la rend traçable in vitro et in vivo ; pendant ce temps, la fluorescence à l'intérieur des cellules tumorales prouvait indirectement la stabilité de l'acide folique-ADN tétra-Dox pendant le processus de pénétration à travers la membrane cellulaire. Donc, l'acide folique-ADN tétra-Dox était capable et stable pour applications biomédicales.

L'ADN tétra a la capacité de livrer des médicaments dans les cellules. Toutes les séquences d'ADN utilisées dans cette recherche n'étaient pas codées pour information génétique. Ainsi, aucun effet secondaire sur l'expression génique et le métabolisme cellulaire n'a été rapporté dans tous les examens. Pendant ce temps, du fait de la haute expression du récepteur au folate à la surface des cellules tumorales, l'acide folique est sélectionné comme molécule de ciblage spécifique du système de livraison pour améliorer l'efficacité d'absorption des complexes ADN tétra. Cependant, avec les circonstances d'ADN tétra à concentration relativement élevée, l'avantage du ciblage récepteur folate n'était pas pleinement reflété in vitro. En conséquence, pour application in vivo, l'acide folique était potentiel pour améliorer l'efficacité de ciblage dans le système circulant complexe.

Actuellement, les médicaments anticancéreux apportent communément des effets secondaires inattendus, donc la recherche sur l'amélioration de la capacité de ciblage des cellules tumorales et d'efficacité de livraison a été un sujet brûlant [23,24,25]. Des études antérieures montraient que la capacité du tétraèdre d'ADN pour transporter des médicaments était basée sur sa bonne compatibilité. Le tétraèdre d'ADN est un conteneur artificiel de modification favorable et biocompatibilité appropriée. Dans cette étude, le couplage réussi de Dox et acide folique avec tétraèdre d'ADN a atteint un effet inhibiteur satisfaisant et mené à une apoptose évidente de cellules HT-29. Du fait que l'ADN tétra peut être modifié et couplé avec médicaments et molécules de ciblage, l'enrichissement de concentration locale de médicament dans la cellule tumorale était réalisé. Les résultats ci-dessus prouvent la bonne reconnaissance pour cellules tumorales et effet inhibiteur correspondant amélioré via livraison ADN tétra, et ce système nanoscopique de livraison de médicament peut être utilisé plus extensivement.

Conclusions

En tant que stratégie de livraison de médicament nouvellement développée, les structures d'ADN nanoscopiques sont de faible coût, haute stabilité et faisabilité de synthèse ; en même temps, elles sont biosûres du fait de l'absence d'activité immune exogène. La stratégie de couplage tétraèdre d'ADN facilite la livraison ciblée de Dox, améliore l'efficacité anticancéreuse de Dox sur cellules cancéreuses du côlon, et fournit une inspiration et idée prometteuse pour la conception de médicaments.