Nanoparticules de silice mésoporeuse co-administrant un inhibiteur de NQO1 et du 5-fluorouracile, potentialisant l'activité antitumorale dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou
Résumé
Les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (CETC) sont parmi les formes les plus mortelles de cancer, 90 % provenant de cellules épidermoïdes. La NAD(P)H:quinone oxydoréductase 1 (NQO1), une enzyme surexprimée dans le carcinome épidermoïde, joue un rôle important dans la prolifération et la chimiorésistance. Les objectifs principaux étaient d'étudier l'effet inhibiteur du ß-lapachone (ARQ761 en forme clinique) dans les CETC et l'effet combinatoire du 5-FU et du ß-lap pour améliorer l'efficacité thérapeutique. Des nanoparticules de silice mésoporeuse assemblées par bicouche lipidique et chargées en 5-FU/ß-lap ont été préparées et étudiées pour leurs propriétés physico-chimiques et biologiques. Le ß-lap a montré une inhibition concentration-dépendante de l'activité enzymatique NQO1 dans les cellules Cal33. Notamment, un effet inhibiteur significatif a été observé à 20–50 µg/mL de ß-lap. La combinaison 5-FU+ß-lap a entraîné une viabilité cellulaire plus faible ; surtout, les nanoparticules de silice mésoporeuse chargées en 5-FU/ß-lap (FNQ-MSN) ont présenté une viabilité cellulaire significativement plus faible que chaque médicament seul ou leur combinaison physique. Le ß-lap a diminué la bande protéique de NQO1 par rapport au témoin ; cependant, la diminution la plus notable du niveau de NQO1 a été observée dans le groupe traité par FNQ-MSN. Les FNQ-MSN ont induit plus de 60 % d'apoptose cellulaire (précoce et tardive) et une fragmentation nucléaire prédominante, indiquant l'effet anticancéreux supérieur du régime combiné à base de vecteur. Une diminution notable du volume tumoral a été observée avec le mélange physique 5-FU+ß-lap ; toutefois, le traitement combiné à base de vecteur (FNQ-MSN) a significativement retardé la croissance tumorale et prolongé la survie de souris xénogreffées porteuses de tumeurs. Ces résultats suggèrent le potentiel de l'inhibiteur de NQO1 pour potentialiser le potentiel chimiothérapeutique du 5-FU dans le traitement des CETC.
Introduction
Les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (CETC) sont parmi les cancers les plus mortels, 90 % provenant de cellules épidermoïdes [1]. Les CETC sont hautement angiogéniques et leur vasculature exprime diverses cytokines dont les facteurs de croissance fibroblastiques (FGF) et les facteurs de croissance endothéliaux vasculaires (VEGF), liés à une métastase plus élevée et une survie médiocre [2]. L'incidence des CETC en Chine est au sixième rang des décès par cancer avec environ 250 000 nouveaux cas en 2015 et 77 500 décès. Le taux de survie global à 5 ans est très faible en raison de la nature agressive, des rechutes précoces, des métastases élevées et de la mortalité élevée due au mauvais pronostic [3]. Le traitement principal est la chirurgie suivie de radiothérapie ou chimiothérapie. Plus précisément, la chimiothérapie utilisée efficacement aux stades précoces ou post-chirurgicaux contrecarrerait la croissance tumorale [4, 5]. Une chimiothérapie efficace éradiquerait les cellules cancéreuses et inhiberait la rechute. Cependant, la chimiothérapie prolongée à agent unique entraîne souvent une résistance et une efficacité réduite [6]. Il est donc nécessaire d'employer des stratégies innovantes pour améliorer la survie et la qualité de vie des patients atteints de CETC.
Plusieurs agents anticancéreux utilisés contre les CETC incluent le cisplatine, le 5-fluorouracile (5-FU), le paclitaxel, le docétaxel. Parmi eux, le 5-FU est employé en thérapie de première ligne dans les CETC et autres carcinomes épidermoïdes [7]. Le 5-FU est un analogue de la pyrimidine qui inhibe irréversiblement la thymidylate synthase dans les cellules cancéreuses, supprimant la réplication de l'ADN et causant la mort cellulaire [8]. Comme tous les anticancéreux, le 5-FU a des effets indésirables en circulation systémique et cause une toxicité aux tissus normaux ; cependant, la combinaison du 5-FU avec un second agent pourrait potentiellement réduire les effets secondaires et améliorer l'efficacité thérapeutique globale [9].
La NAD(P)H:quinone oxydoréductase 1 (NQO1) est une flavoprotéine élevée dans les tissus tumoraux de 100 à 200 fois par rapport aux tissus normaux [10]. Cette oxydoréductase à deux électrons est une enzyme de détoxication de phase II inductible, capable de détoxiquer les quinones en formant des hydroquinones stables [11]. La NQO1 s'exprime à un faible niveau basal dans les tissus humains normaux, protégeant les cellules contre le cyclage redox et le stress oxydatif et stabilisant le suppresseur p53. La NQO1 est surexprimée de manière constitutive dans plusieurs cancers dont le sein, le pancréas et les carcinomes épidermoïdes [12]. La surexpression de NQO1 favorise la progression tumorale et rend les cellules cancéreuses plus résistantes aux chimiothérapeutiques comme le 5-FU ou le cisplatine (inducteurs de stress oxydatif), faisant de NQO1 une cible oncologique potentielle pour améliorer l'efficacité thérapeutique [13]. Il a été rapporté que l'invalidation de NQO1 par siRNA potentialisait l'effet cytotoxique de multiples médicaments comme la gemcitabine ou la doxorubicine [14]. Plusieurs inhibiteurs synthétiques et naturels de NQO1 sont rapportés : coumarines, curcumines, ES936 [15,16,17]. Dans cette étude, nous avons utilisé le ß-lapachone (ß-lap, 3,4-Dihydro-2,2-diméthyl-2H-naphtho[1,2-b]pyran-5,6-dione) comme inhibiteur de NQO1 [18]. Le ß-lap agit par un mécanisme dépendant de NQO1 et génère une quantité significative d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) entraînant des dommages aux brins d'ADN et la mort des cellules cancéreuses [19].
L'utilisation de nanoparticules pour l'administration systémique de petites molécules devient une approche prometteuse en cancérologie [20]. Les nanoparticules chargées en médicament nécessitent moins de doses et améliorent l'efficacité anticancéreuse tout en réduisant les effets indésirables. Parmi tous les vecteurs, la nanoparticule de silice mésoporeuse (MSN) a un potentiel significatif pour délivrer efficacement la charge aux tissus tumoraux [21, 22]. Les pores de taille micrométrique permettent un chargement stable des médicaments et empêchent leur libération dans la circulation systémique, favorisant l'accumulation préférentielle dans les tissus cancéreux perméables via l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR) [23].
Globalement, l'objectif principal était de combiner les bénéfices thérapeutiques du 5-FU et de l'inhibiteur de NQO1 pour potentialiser l'effet anticancéreux dans les CETC. L'effet anticancéreux in vitro a été analysé par diverses techniques : viabilité cellulaire, western blot, cytométrie de flux/test d'apoptose au Hoechst, test vivant/mort. Des études in vivo ont été menées sur le modèle xénogreffe porteur de cellules Cal33.
Conclusion
En résumé, nous avons formulé avec succès des nanoparticules de silice mésoporeuse enrobées de bicouche lipidique et chargées en 5-FU+ß-lap. Nous avons montré que : (i) effet antitumorale du ß-lap de manière concentration-dépendante dans les cellules tumorales CETC, (ii) la combinaison 5-FU+ß-lap entraîne une inhibition significative des protéines NQO1 et Bcl-2, (iii) la combinaison à base de vecteur FNQ-MSN démontre une réduction significative de la charge tumorale dans le xénogreffe CETC. Ces données indiquent sans équivoque qu'une dose sous-létale d'inhibiteur de NQO1 (ß-lap) pourrait potentiellement potentialiser l'efficacité thérapeutique du 5-FU dans les tumeurs CETC et pourrait être étendue au traitement clinique d'autres malignancies.
Matériaux et méthodes
Préparation des nanoparticules de silice mésoporeuse chargées en 5-FU/ß-lap et enrobées de bicouche lipidique
La MSN chargée en médicament a été préparée en dissolvant le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) (210 mg) dans 180 mL d'eau et porté à ébullition à 80 °C, puis le 5-FU et le ß-lap ont été ajoutés à 20 % p/p du total des nanoparticules, puis le fluorure d'ammonium (NH4F) (30 mg) a été ajouté et agité 60 min. Ensuite, 1,6 mL de tétraéthyl orthosilicate (TEOS) a été ajouté goutte à goutte pendant 30 min et agité en continu 3 h. Des colloïdes blanc semi-transparent se sont formés, récupérés par centrifugation (15 min) à 10 000 tr/min à 24 ± 1 °C. Les MSN ont été resuspendues dans l'eau ultrapure, le cycle de centrifugation répété 2 fois. Séparément, un film mince a été préparé avec DSPE-PEG2000 (2 % du poids total des MSN) et hydraté avec l'eau contenant les MSN chargées. Le mélange a été immédiatement sonotrodié pendant 5 min à 50 W à température ambiante (25 °C). La MSN supportée par bicouche lipidique PEGylée a été lavée deux fois et resuspendue dans l'eau ultrapure.
Analyse de la taille particulaire, du potentiel zêta et de la morphologie
Le diamètre particulaire, l'indice de polydispersité (IP) et le potentiel zêta ont été évalués par Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). Les particules ont été analysées par diffusion dynamique de la lumière (DDL) et les dispersions bien diluées avant l'expérience. Toutes les expériences ont été effectuées en triplicat à température ambiante. La morphologie a été déterminée par MET (CM 200 UT, Philips, MA, USA) à 100 kV. Brièvement, les dispersions ont été diluées, une goutte déposée sur une grille TEM 300 mailles et laissée sédimenter 10 min. Les particules ont été contre-colorées avec l'acide phosphotungstique 2 % (PTA) en coloration négative, séchées à l'air et observées au MET.
Chargement du médicament
L'analyse du chargement du médicament a été réalisée de deux façons : calcul du médicament non chargé dans le surnageant et du médicament chargé dans la nanoparticule. L'efficacité de chargement a été déterminée par HPLC. L'HPLC était équipée d'une pompe Shimadzu LC-20 AD PLC et d'un détecteur SPD-M20A PDA avec logiciel Shimadzu LC contenant une colonne C18 à phase inverse (Phenomenex C18, 150 × 4,6 mm, 5 µm). La phase mobile pour le 5-FU est un mélange acétonitrile/eau (10:90, v/v) à 1 mL/min. Longueur d'onde de détection 265 nm pour le 5-FU. La phase mobile pour le ß-lap est acétonitrile/eau (31:69, v/v) à 35 °C, détection à 254 nm. La capacité de chargement (LC) et l'efficacité de chargement (LE) ont été calculées par :
LE (%) = (Wtotal 5-FU+ß-lap − Wfree 5-FU+ß-lap) / Wtotal 5-FU+ß-lap × 100
LC (%) = (Wtotal 5-FU+ß-lap − Wfree 5-FU+ß-lap) / Wtotal NP masse × 100
Étude de libération du médicament
La libération du 5-FU et du ß-lap a été évaluée dans le PBS (pH 7,4) et l'ABS (pH 5,0) à 37 °C par dialyse. Brièvement, 1 mg équivalent de chaque nanoparticule chargée a été placé dans une membrane de dialyse dans 1 mL de tampon respectif, scellée. La membrane a été placée dans 25 mL de tampon ABS et PBS respectifs dans un bain d'agitation à 37 °C. Des échantillons ont été prélevés à intervalles prédéterminés et remplacés par un volume égal de tampon frais. La quantité de médicament libérée a été évaluée par HPLC comme décrit précédemment.
Culture cellulaire et test d'activité NAD(P)H:quinone oxydoréductase 1 (NQO1)
La cellule CETC Cal33 a été cultivée en milieu DMEM modifié de Dulbecco complété par 10 % FBS et 1 % mélange antibiotique, maintenue en conditions ambiantes en incubateur. Pour le test d'activité NQO1, les cellules Cal33 ont été semées en plaque de 96 puits à 8 × 103 cellules/puits et incubées une nuit. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de ß-lap et incubées 24 h. La digitonine 0,8 % (50 µL de 2 nM EDTA) a lyse les cellules et le test a été réalisé avec le ménadiol et le MTT comme réaction de couplage substrat, activité mesurée à 620 nm. Le test a été effectué en triplicat.
Test de viabilité cellulaire in vitro
Le test de viabilité du ß-lap à concentrations croissantes et le test de viabilité des régimes individuels et combinatoires ont été réalisés par test MTS. Brièvement, les cellules Cal33 ont été semées en plaque de 96 puits à 1 × 104 cellules/puits et incubées une nuit. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec des concentrations croissantes de ß-lap ; séparément, les cellules ont été traitées avec les régimes individuels et combinatoires de 5-FU et ß-lap à concentration de base 5, 10 et 20 µg/mL et incubées 24 h. Les cellules ont été lavées deux fois et traitées avec la solution MTS selon les instructions du fabricant. La viabilité cellulaire a été calculée par rapport aux cellules non traitées, et un lecteur de microplaques a mesuré l'absorbance à 460 nm.
Analyse par Western Blot
Les cellules semées en plaque de 6 puits ont été traitées avec concentrations croissantes de ß-lap ; séparément, cellules traitées avec régimes individuels (5-FU ou ß-lap) et combinatoire (FNQ-MSN) et incubées 24 h. Les cellules ont été récoltées, lysées (tampon M-per), centrifugées, et le surnageant contenant les protéines collecté. La concentration protéique a été évaluée par méthode BCA. Un gel de polyacrylamide Bis-Tris 10 % a séparé les protéines, transférées immédiatement sur membrane PVDF. La membrane a été bloquée avec 5 % lait écrémé en tampon TBS contenant Tween 20 (TBST, pH 7,2). Les anticorps primaires : NQO1 polyclonal lapin (1:1000), Bcl-2 monoclonal souris (1:1000), GAPDH monoclonal souris (1:1000) ont été incubés overnight à 4 °C. La membrane a été lavée au TBST puis incubée avec anticorps secondaires (anti-souris ou anti-lapin IgG) à dilution 1:10000. Après lavage au TBST, les bandes ont été révélées par substrat ECL et les densités évaluées par photodéveloppeur.
Apoptose et test au Hoechst
Les cellules Cal33 ont été semées en plaque de 6 puits à 2 × 105 cellules/puits et incubées une nuit. Les cellules ont été traitées avec régimes individuels (5-FU ou ß-lap) et combinatoire (FNQ-MSN) et incubées 24 h. Les cellules ont été récoltées, lavées, centrifugées, culotées. Elles ont été traitées avec 2,5 µL d'annexine V et 2,5 µL de PI et incubées 15 min dans le noir. Les cellules ont été portées à 1 mL et évaluées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS, BD, FACSverse). 10 000 cellules ont été analysées. Procédure similaire pour l'ensemencement et le traitement, puis coloration au Hoechst 33342 (10 µg/mL) pendant 10 min. Les cellules ont été lavées et fixées au paraformaldéhyde 4 % (PFA) et relavées. La morphologie cellulaire a été observée au microscope à fluorescence (Nikon A1, Japon).
Efficacité antitumorale des FNQ-MSN dans le modèle xénogreffe de tumeur CETC
Des souris mâles BALB/c de 18-22 g, âgées de 4-5 semaines, ont été fournies par le Centre d'installation animale de l'Université de l'industrie légère de Zhengzhou, Henan. Les animaux étaient maintenus en salle climatisée avec cycle 12 h jour/nuit, accès libre à la nourriture et l'eau. Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le Comité d'éthique de l'Université de l'industrie légère de Zhengzhou. Pour établir un modèle xénogreffe, 1 × 107 cellules Cal33 dans 150 µL de milieu de culture ont été inoculées sous-cutanément dans la hanche droite. Quand la taille moyenne de la tumeur atteignait 80–100 mm³, les souris ont été divisées aléatoirement en 5 groupes (témoin, 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap, FNQ-MSN) avec 8 souris par groupe. Le 5-FU a été administré à 5 mg/kg et le ß-lap à 25 mg/kg, 3 fois avec un intervalle de 3 jours par injection intraveineuse. Le poids des souris et le volume tumoral ont été surveillés régulièrement pendant 18 jours. Le volume tumoral a été calculé par :
V (mm³) = Largeur² (mm²) × Longueur (mm) / 2
L'étude n'a observé aucune mort de souris due au chargement tumoral et tous les animaux ont été euthanasiés au CO2 puis sacrifiés par dislocation cervicale à la fin.
Analyse statistique
Les groupes multiples ont été comparés par analyse de variance à deux facteurs (ANOVA). Seuil de significativité p < 0,05 considéré significatif, toutes les données présentées en moyenne ± écart-type sauf mention contraire.
Résultats et discussion
Préparation des nanoparticules de silice mésoporeuse supportées par bicouche lipidique chargées en 5-FU/ß-lap
Dans cette étude, nous avons personnalisé une nanoparticule de silice mésoporeuse stabilisée par bicouche lipidique PEGylée. La MSN chargée en 5-FU/ß-lap a été préparée par la méthode émulsion-sonication, puis introduite dans le ballon contenant le film lipidique mince de DSPE-PEG2000. Le mélange a été soniqué et la MSN enrobée de lipides contenant 5-FU/ß-lap obtenue (FNQ-MSN) (Fig. 1a). Les efficacités de chargement (LE) du 5-FU et du ß-lap étaient de 91,5 ± 1,65 % et 92,9 ± 1,24 % respectivement. Les FNQ-MSN présentaient 8,1 ± 1,12 % p/p de 5-FU et 7,6 ± 0,95 % p/p de ß-lap, indiquant une haute capacité de chargement (LC) du vecteur MSN. La présence de la bicouche lipidique empêche la libération indésirable en circulation systémique et donc la toxicité. La taille particulaire moyenne de la MSN chargée était de 92,1 ± 0,85 nm (IP ~ 0,089) ; l'assemblage de la bicouche lipidique (FNQ-MSN) l'a augmentée à 128,4 ± 1,24 nm (IP ~ 0,115), indiquant une présence solide de lipides à la surface (Fig. 1b). Le potentiel zêta a changé de −18,2 ± 1,22 à −26,4 ± mV. La petite taille des FNQ-MSN permet l'accumulation préférentielle dans les tissus tumoraux perméables via l'effet EPR. De plus, la PEGylation de surface confère une excellente stabilité et un temps de circulation sanguine prolongé, augmentant les chances d'accumulation tumorale. L'image MET montre une ressemblance morphologique aux liposomes, forme sphérique parfaite uniformément répartie. L'image MET montre clairement une couche externe grise et un cœur plus sombre, indiquant l'assemblage lipidique à la surface de la MSN (Fig. 1c). La taille observée au MET corrobore la taille DLS du zetasizer. Les MSN possèdent des canaux bien ordonnés pour la distribution homogène des molécules de médicament. La propriété de surface des pores est un facteur important pour le chargement stable des petites molécules. Les forces physiques impliquées dans l'interaction hôte-invité incluent principalement les forces hydrophobes et les forces de van der Waals. Une plus grande capacité de chargement fournit une concentration intracellulaire plus élevée et une efficacité de destruction plus élevée au site tumoral. Les FNQ-MSN ont présenté une excellente stabilité dans le PBS et la taille particulaire est restée inchangée pendant 30 jours. Cette stabilité améliorée du système vecteur et la haute capacité de chargement amélioreront la biodistribution et l'efficacité du traitement tumoral.
Figure 1. a Schéma de la construction des nanoparticules de silice mésoporeuse enrobées de bicouche lipidique chargées en 5-FU et ß-lap. Les deux médicaments sont chargés dans les pores de la MSN puis stabilisés par l'assemblage de la bicouche lipidique PEGylée à la surface externe. b Distribution de taille des FNQ-MSN. c Image MET des FNQ-MSN avec insert de grossissement supérieur
Libération in vitro du médicament
La libération in vitro du 5-FU et du ß-lap depuis les FNQ-MSN a été étudiée dans le PBS et l'ABS (Fig. 2). Deux tendances de libération différentes ont été observées à pH 7,4 et pH 5,0. Par exemple, 25 % de 5-FU libéré en 24 h à pH 7,4 contre ~40 % à pH 5,0 en 24 h. De même, 20 % et 30 % de ß-lap libérés à pH 7,4 et 5,0 respectivement. La cinétique de libération était identique tout au long de l'étude avec 50 % de 5-FU libéré en tampon alcalin et 80 % à pH 5,0 après 72 h. Une libération pH-réactive en conditions acides est avantageuse pour le traitement du cancer. Aucun phénomène de libération en rafale n'a été observé aux deux pH, principalement attribué à la couche DSPE-PEG qui contrôle la libération tout au long de l'étude. Une différence significative de libération a été observée entre pH 7,4 et 5,0. À pH 7,4, le PEG-b-DSPE présente une propriété de couche furtive élevée empêchant la libération du composé encapsulé. Le résultat montre que la libération s'accélère à pH 5,0, indiquant la désassemblage de la coquille protectrice autour de la MSN. Le taux de libération pH-sensible, assurant une libération maximale dans les cellules cancéreuses, peut améliorer l'efficacité antitumorale et diminuer la toxicité indésirable aux tissus normaux. Il est possible qu'en présence d'un élément pH-réactif, les FNQ-MSN entraînent le détachement de la bicouche lipidique sur la MSN, résultant en une libération accrue aux pH bas.
Figure 2. Libération in vitro du 5-FU et du ß-lap depuis les FNQ-MSN en conditions tampon pH 7,4 et 5,0. L'étude a duré 72 h, la libération quantifiée par HPLC. **p < 0,01
Sensibilité de la NQO1 au ß-lap
Comme la surexpression de NQO1 dans de nombreuses cellules cancéreuses dont les CETC est associée à un mauvais pronostic et résultat thérapeutique, les médicaments ciblant NQO1 pourraient être une stratégie potentielle [24]. La NQO1 est surexprimée de 100 à 200 fois dans le carcinome épidermoïde par rapport aux tissus normaux. L'influence du ß-lap sur l'activité enzymatique NQO1 a été étudiée dans les cellules Cal33. Comme montré, le ß-lap a inhibé l'activité NQO1 de manière concentration-dépendante (Fig. 3a). Notamment, un effet inhibiteur significatif a été observé à 20–50 µg/mL. Le potentiel inhibiteur du ß-lap sur la protéine NQO1 a été étudié par western blot (Fig. 3b). Les résultats révèlent une diminution significative de la protéine NQO1 avec l'augmentation de la concentration de ß-lap. Environ 80 % d'inhibition de NQO1 observée à 100 µg/mL. Le médicament bioactivable par NQO1 comme le ß-lap est métabolisé par NQO1 et forme un composé hydroquinone instable qui se reconvertit immédiatement en composant original en laissant 2 oxydations à un électron et consommant 2 O2−. Cela crée un cycle redox futile où 1 molécule de ß-lap génère 130 moles de superoxyde au coût de 60–70 moles de NAD(P)H. Le superoxyde (O2·−) formé se convertit en peroxyde d'hydrogène (H2O2) et cause l'apoptose et la mort cellulaire [25].
Figure 3. a Effet de l'activité concentration-dépendante du ß-lap sur l'activité NQO1 des cellules Cal33 par méthode enzymatique. b Effet sur les niveaux de protéine NQO1 par western blot avec GAPDH comme protéine de référence
Effet anticancéreux in vitro des FNQ-MSN dans les cellules CETC
L'effet anticancéreux in vitro du ß-lap dans les cellules Cal33 a été étudié par test MTT. Les résultats révèlent une diminution concentration-dépendante typique de la viabilité cellulaire (Fig. 4a). Notamment, une diminution significative observée à 50 µg/mL. Pour les expériences suivantes, 20 µg/mL a été sélectionné (en dessous de la CI50 du ß-lap). Ensuite, l'effet de potentialisation du ß-lap sur le 5-FU a été étudié à 3 concentrations (5, 10, 20 µg/mL). Comme montré, la combinaison 5-FU+ß-lap a entraîné une viabilité plus faible ; surtout, les FNQ-MSN ont présenté une viabilité significativement plus faible que chaque médicament seul ou combinaison physique (Fig. 4b). Par exemple, 5-FU et ß-lap montraient une viabilité de 35,7 % et 70,2 % ; 5-FU+ß-lap 26,5 % et FNQ-MSN 13,1 %. Les résultats montrent clairement que l'effet cytotoxique du 5-FU était significativement augmenté combiné au ß-lap. Il est notable que les FNQ-MSN étaient plus efficaces que 5-FU+ß-lap, attribué à une meilleure internalisation et libération contrôlée des thérapeutiques du système vecteur. Les résultats révèlent l'effet inhibiteur du ß-lap sur l'activité enzymatique et les niveaux de protéine NQO1 et potentialisent l'effet anticancéreux du 5-FU pour un résultat thérapeutique amélioré dans le traitement des CETC.
Figure 4. a Effet de l'activité concentration-dépendante du ß-lap sur la viabilité des cellules Cal33. b Effet cytotoxique des régimes individuels et combinés avec second agent 5-FU à 3 concentrations 5–20 µg/mL. Viabilité évaluée par MTT après 24 h. c Western blot de l'expression des protéines NQO1 et Bcl-2 après traitement individuel et combiné
Rôle des FNQ-MSN dans les voies de signalisation : analyse Western Blot
Le mécanisme de l'effet cytotoxique médié par ß-lap a été exploré par western blot. Comme montré, le ß-lap a diminué la bande protéique NQO1 par rapport au témoin ; cependant, la diminution la plus notable du niveau NQO1 a été observée dans le groupe traité par FNQ-MSN (Fig. 4c). L'augmentation de la chimiosensibilité de Cal33 induite par ß-lap via l'apoptose a été évaluée par le niveau de protéine Bcl-2. La famille Bcl-2 régule l'homéostasie cellulaire et contrôle la prolifération et la mort des cellules cancéreuses. La diminution de Bcl-2 et l'augmentation de Bax libèrent le cytochrome C dans le cytosol, initiant la cascade caspase menant à la mort cellulaire [26]. Les résultats soulignent que la combinaison 5-FU+ß-lap (FNQ-MSN) a significativement régulé à la baisse Bcl-2, indiquant l'effet anticancéreux potentialisé dans les cellules Cal33.
Analyse de l'apoptose des CETC
Suite à l'analyse de viabilité, l'effet apoptotique des médicaments individuels et combinés sur Cal33 a été évalué par cytométrie de flux après coloration annexine V/PI (Fig. 5). L'effet apoptotique du 5-FU individuel (10 µg/mL) ou ß-lap (30 µg/mL) n'a pas entraîné d'apoptose appréciable ; cependant, 5-FU+ß-lap a entraîné une augmentation dramatique de la proportion d'apoptose. Surtout, les FNQ-MSN ont induit plus de 60 % d'apoptose (précoce et tardive), signifiant l'effet thérapeutique supérieur du régime combiné à base de vecteur. L'effet apoptotique a été confirmé par coloration Hoechst 33342. Comme montré, les cellules traitées par FNQ-MSN présentent une plus grande quantité de cellules en apoptose, condensation et fragmentation nucléaires comparées au 5-FU ou ß-lap seuls (Fig. 6). Pendant l'apoptose, les cellules se rétractent sans dommage de la membrane externe et présentent condensation de chromatine avec formation accrue de corps apoptotiques.
Figure 5. Analyse par cytométrie de flux des cellules Cal33 par double coloration annexine V et PI après traitement individuel et combiné 5-FU et ß-lap. 10 000 événements enregistrés
Figure 6. Analyse de la morphologie nucléaire des cellules Cal33 après coloration Hoechst 33342 ; cellules traitées individuellement et combiné 5-FU et ß-lap. 10 000 événements enregistrés
Test vivant/mort
L'effet anticancéreux des médicaments individuels et combinés a été évalué par test vivant/mort. Les cellules traitées ont été soumises à coloration Calcein AM et bromure d'éthidium comme marqueurs respectifs de cellules vivantes et mortes (Fig. 7). Comme montré, les cellules non traitées sont colorées à 100 % en fluorescence verte. Les médicaments individuels, 5-FU (10 µg/mL) ou ß-lap (30 µg/mL) montraient de légères cellules à fluorescence rouge ; cependant, les cellules prédominantes présentaient fluorescence verte indiquant une mort cellulaire limitée. Une mort cellulaire remarquable a été observée dans les cellules cancéreuses traitées par FNQ-MSN, montrées par fluorescence rouge prédominante et moins de cellules à fluorescence verte. L'effet anticancéreux supérieur des FNQ-MSN est attribué à l'activité synergique du 5-FU et du ß-lap dans les cellules cancéreuses et à la capacité du ß-lap d'augmenter la chimiosensibilité du 5-FU.
Figure 7. Analyse vivant/mort des cellules Cal33 par double coloration Calcein AM et bromure d'éthidium après traitement individuel et combiné 5-FU et ß-lap
Efficacité antitumorale in vivo des FNQ-MSN contre le modèle xénogreffe CETC
Pour évaluer l'efficacité du régime combinatoire en modèle animal, un xénogreffe CETC a été préparé et administré avec 5 mg/kg de 5-FU et 10 mg/kg de ß-lap. Le grade pharmaceutique du ß-lap est ARQ761, actuellement en essai clinique de phase I pour tumeurs métastatiques. Le ß-lap a fixé la dose maximale tolérable chez l'homme selon études précliniques [27]. En gardant cela à l'esprit, nous avons sélectionné une dose de 10 mg/kg de ß-lap pour les études in vivo. Comme montré, aucune diminution significative du volume tumoral n'a été observée avec 5-FU et ß-lap administrés individuellement comparés au témoin non traité (Fig. 8a). Une diminution notable du volume tumoral a été observée avec le mélange physique 5-FU+ß-lap ; toutefois, le traitement combiné à base de vecteur (FNQ-MSN) a significativement retardé la croissance tumorale et prolongé la survie des souris xénogreffées. Le graphique de volume tumoral des FNQ-MSN se divise en deux parties : croissance insignifiante jusqu'au jour 9, puis augmentation significative jusqu'au jour 18, néanmoins le volume global restait多倍 plus petit que le témoin ou autres groupes. La toxicité a été évaluée par le poids corporel (Fig. 8b). Le mélange physique 5-FU+ß-lap a entraîné une toxicité sévère (>10 % perte de poids) tandis que le 5-FU seul 5 %. Comme prévu, les FNQ-MSN n'ont entraîné aucune perte de poids, indiquant l'avantage unique du système vecteur lipidique-MSN. L'effet antitumorale potentialisé des FNQ-MSN est attribué à : (1) l'effet inhibiteur du ß-lap sur l'enzyme et la protéine NQO1 augmentant la chimiosensibilité du 5-FU et l'effet synergique ; (2) la bicouche lipidique protégeant le médicament en circulation systémique et le libérant de manière contrôlée dans le tissu tumoral ; (3) la PEGylation prolongeant la circulation sanguine permettant l'accumulation préférentielle dans la tumeur via l'effet EPR [28, 29]. Les MSN PEGylées étaient principalement piégées dans le RES du foie, rate, poumon, représentant >80 % de la dose administrée. La modification PEG diminuait le taux de clairance des MSN dans les organes, démontrant que les NP PEGylées étaient plus difficiles à éliminer des organes RES indépendamment de la forme [30, 31]. Globalement, l'étude in vivo sur le modèle CETC offre une « preuve de concept » qu'une combinaison efficace 5-FU+ß-lap dans un nanovecteur stable pourrait potentialiser l'efficacité thérapeutique tout en atténuant la toxicité associée.
Figure 8. a Efficacité antitumorale in vivo des FNQ-MSN dans le modèle xénogreffe CETC. Souris porteuses de tumeurs CETC traitées avec 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap et FNQ-MSN à dose fixe 5 mg/kg 5-FU et 10 mg/kg ß-lap par voie intraveineuse 3 fois. Volume tumoral noté pour analyse d'efficacité et comparé au témoin non traité. b Analyse du poids corporel correspondant aux données de volume tumoral. *p < 0,05 et ***p < 0,001
Disponibilité des données et matériaux
Toutes les données générées ou analysées pendant cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'information supplémentaires.
Abréviations
- 5-FU :
- 5-Fluorouracile
- EPR :
- Effet de perméabilité et de rétention accrue
- FNQ-MSN :
- Nanoparticules de silice mésoporeuse chargées en 5-FU/ß-lap
- CETC :
- Carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou
- MSN :
- Nanoparticule de silice mésoporeuse
- NQO1 :
- NAD(P)H:quinone oxydoréductase 1
- ß-lap :
- ß-lapachone
Nanomatériaux
- Nanoparticules métalliques : puissants inhibiteurs de pompes d'efflux et de biofilms pour restaurer l'efficacité des antibiotiques
- Élimination efficace du plomb par hydrozincite et carbonato-hydrotalcite supportés sur aérogel de silice via transformation par précipitation
- Peptide gH625 vs acide folique : Amélioration de l'internalisation de nanoparticules magnétiques Fe₃O₄ à travers la barrière hémato-encéphalique
- Silice enrobée de titane améliorée par l'alginate de sodium : un sorbant supérieur pour l'élimination de Cu(II), Zn(II), Cd(II) et Pb(II)
- Frustules de diatomées fonctionnalisées à l'or : un nanodispositif hiérarchique pour la détection SERS sensible de biomolécules et polluants environnementaux
- Support de catalyseur anodique amélioré utilisant des nanofibres TiO₂-carbone pour piles à combustible à méthanol direct
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