Effet antitumoral des nanoparticules de silice mésoporeuse ciblées anti-VEGFR2 marquées au 131I dans le cancer anaplasique de la thyroïde

Contexte

Le cancer anaplasique de la thyroïde (ATC) ne représente qu'environ 2 % de tous les cancers de la thyroïde; cependant, il s'agit d'un type de tumeur localement agressif qui présente un taux élevé de métastases à distance. Généralement, la survie médiane des patients atteints d'ATC est d'environ 6 mois, avec seulement 20 % des patients survivant 1 an après le diagnostic en raison d'une catastrophe vasculaire et d'un collapsus des voies respiratoires causés par une maladie régionale agressive envahissant les tissus du cou et les ganglions lymphatiques et/ou les métastases pulmonaires [1 , 2]. Iode radioactif-131 ( ¹³¹ I) joue un rôle important dans le diagnostic et le traitement des métastases du cancer différencié de la thyroïde (CDT) [3,4,5]. Cependant, le ¹³¹ conventionnel La modalité de traitement I n'est pas appropriée pour l'ATC en raison de sa caractéristique de non-concentration d'iode [6].

L'angiogenèse est un facteur majeur contribuant à la survie, la croissance, la migration et la métastase des cellules cancéreuses. Le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) est une cytokine régulatrice cruciale dans l'angiogenèse et joue un rôle important dans le développement de l'ATC. Le rôle bien établi du VEGF dans l'angiogenèse signifie que des ligands radiomarqués, tels que le bevacizumab, qui cible le récepteur du VEGF (VEGFR), ont été développés avec succès pour la détection précoce et sensible des lésions en utilisant la tomographie par émission de positons (TEP) et la tomodensitométrie à émission monophotonique ( SPECT) techniques d'imagerie. Le VEGFR-2 exerce la plupart des fonctions du VEGF dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins et est responsable de la prolifération via l'activation de la voie de la protéine kinase activée par les mitogènes, la migration des vaisseaux endothéliaux et la promotion de l'angiogenèse et de la croissance vasculaire [7, 8 ]. L'expression du VEGF est régulée positivement dans les cellules ATC d'origine épithéliale par rapport à celle du tissu thyroïdien normal [9,10,11]. Des stratégies anti-VEGF ont été développées pour inhiber la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins et priver les tumeurs de l'oxygène et des nutriments nécessaires. Plusieurs études précliniques ont développé des médicaments ciblant le VEGFR2 dans l'ATC avec différents degrés de succès [12,13,14,15]. Cependant, l'un des défis majeurs liés à ces médicaments anticancéreux est leur faible biodisponibilité et leur administration inefficace au site cible. De nombreux médicaments anticancéreux sont hydrophobes et nécessitent des systèmes d'administration de médicaments biocompatibles pour améliorer leur biodisponibilité et faciliter l'administration intraveineuse.

Des nanoparticules, y compris des nanoparticules à base de métal, de polymère et de lipide, peuvent être utilisées pour combiner un agent thérapeutique avec un agent d'imagerie. Des ligands/motifs de ciblage, tels que des peptides, des anticorps, des radionucléides ou des fragments d'anticorps, peuvent être attachés aux nanoparticules pour améliorer leur efficacité thérapeutique. Pour le traitement du cancer, les nanoparticules pourraient s'accumuler dans la zone tumorale via un effet de perméabilité et de rétention amélioré, avec une capacité à délivrer des agents thérapeutiques de manière plus localisée. Pendant de nombreuses années, en sciences des matériaux et en ingénierie, la silice a été considérée comme un matériau polyvalent et relativement sûr en raison de la variété des modifications physiques et chimiques disponibles qu'elle offre, ainsi que de sa bonne biocompatibilité [16]. La Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis reconnaît la silice comme « généralement sans danger » [17, 18]. Parmi les différents matériaux à base de silice, les nanoparticules de silice mésoporeuses (MSN) se distinguent comme une classe de nanomatériaux avec de nombreux avantages distinctifs, tels que leur nature non toxique, une bonne perméabilité de surface, une surface spécifique élevée, des structures de pores accordables, une excellente stabilité physico-chimique, et des surfaces chimiquement modifiables, qui en font toutes des hôtes potentiels pour divers agents chimiques et/ou médicaments thérapeutiques [19]. De même, il a été démontré que les nanomatériaux de carbone mésoporeux sont d'excellents nanosupports dans l'administration de médicaments [20,21,22]. Ces dernières années, les efforts dans le domaine des MSN se sont concentrés sur la combinaison des capacités thérapeutiques et d'imagerie. Le marquage des nanoparticules avec des sondes d'imagerie est un outil précieux pour permettre leur suivi in ​​vitro et in vivo. Actuellement, les modalités de traitement ciblées représentent une stratégie encourageante pour le traitement ATC [23, 24].

Inspirés par le rôle central de la thérapie ciblée et de l'imagerie moléculaire contre le VEGFR dans la recherche sur le cancer et les avantages offerts par les MSN, dans cette étude, nous avons développé une nanoplateforme anti-VEGFR2 ciblant potentiellement le théranostic basée sur l'ingénierie de surface des MSN pour une imagerie SPECT non invasive simultanée et un ¹³¹ amélioré in vivo Je effet thérapeutique. Nous avons cherché à déterminer si ¹³¹ Les MSN anti-VEGFR2 marqués au I auraient une efficacité antitumorale dans un modèle de souris nude porteuses de tumeurs ATC, suivies d'études approfondies in vivo, in vitro et ex vivo.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), la Trypsine-EDTA à 0,25 % et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été achetés auprès de Gibco (CA, USA). Les antibiotiques (pénicilline G, streptomycine et nystatine) ont été achetés auprès de Dingguo Biotechnology Co. Ltd. (Pékin, Chine). Bromure d'hexadécyltriméthylammonium (CTAB), orthosilicate de tétraéthyle (TEOS), 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES), diméthylsulfoxyde (DMSO), chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC), N -hydroxysuccinimide (NHS) et l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Allemagne). Na ¹³¹ J'ai été acheté chez Atomic Hitech (Pékin, Chine). Les anticorps anti-VEGFR2 ont été achetés auprès d'Abcam Co. Ltd. (Royaume-Uni).

Caractérisations

Les nanoparticules ont été dispersées dans de l'éthanol, formant une suspension, déposées sur une grille de cuivre recouverte de carbone et séchées pendant au moins 24 h. La morphologie des nanoparticules a été déterminée par microscopie électronique à transmission (MET) (JEOL-100CXII, Japon) à une tension d'accélération de 200 kV. Les potentiels zêta et les diamètres hydrodynamiques des échantillons ont été mesurés par diffusion dynamique de la lumière (DLS) à l'aide d'un Zetasizer (Nano ZS90, Royaume-Uni). Les distributions de la taille des pores et les surfaces des MSN ont été caractérisées par les analyses de Brunauer-Emmett-Teller (BET) et Barrett-Joyner-Halenda (BJH) (ASAP2020M, États-Unis).

Culture cellulaire

La lignée cellulaire humaine ATC FRO [25] (achetée au Cell Resource Center, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Beijing Medical College à Pékin, République populaire de Chine) a été cultivée à 37 °C dans un incubateur humidifié avec un mélange de 5% de CO₂ et 95 % d'air et additionné de 10 % de FBS et de 1 % de pénicilline-streptomycine. Le milieu a été remplacé tous les deux jours et les cellules ont été passées à la trypsine après avoir atteint la confluence. Les cellules ont été précultivées jusqu'à ce qu'une confluence d'environ 80 % soit atteinte avant chaque expérience.

Préparation et modification de surface de nanoparticules de silice

Synthèse des MSN et Amination

Les MSN ont été synthétisés comme indiqué précédemment [26]. En bref, 50 mg de CTAB ont été ajoutés à un mélange de 25 mL d'eau, 5 mL d'éthanol et 100 μL de solution de NaOH 2 M dans un ballon à fond rond sous agitation continue à 70 °C. Ensuite, 200 μL de TEOS ont été ajoutés au mélange et mis à réagir pendant 1 h. La solution réactionnelle a ensuite été centrifugée et lavée avec de l'éthanol cinq fois à 10 000 tr/min. Ensuite, les produits ont été remis en suspension dans 10 mL d'éthanol. Après retrait de la matrice CTAB, le produit a ensuite été remis en suspension dans 5 mL de DMSO et 100 μL d'APTES, qui ont été ajoutés goutte à goutte dans le mélange résultant pour modifier la surface de la silice par amination. Après une nuit d'agitation, les précipités ont été séparés par centrifugation, lavés à l'éthanol cinq fois, puis les MSNs-NH₂ ont été obtenus.

Synthèse de BSA-MSNs-Anti-VEGFR2

Cinq milligrammes de sérum albumine bovine (BSA) et 50 μL d'anticorps anti-VEGFR2 ont été ajoutés au produit ci-dessus (MSNs-NH₂ , 50 mg) et mis à réagir sous agitation pendant 2 h. Le mélange a été lavé à l'eau cinq fois, après quoi 1,1 mg de NHS et 1,6 mg d'EDC ont été ajoutés au mélange et agités pendant une nuit à température ambiante dans 5 ml d'eau. Les précipités ont été séparés par centrifugation, lavés à l'eau cinq fois, ce qui a permis d'obtenir avec succès les BSA-MSNs-anti-VEGFR2.

¹³¹ I Radiomarquage de nanoparticules

Les nanoparticules produites ont été radiomarquées au ¹³¹ J'utilise la méthode Chloramine-T (notée ¹³¹ I-BSA-MSN et ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, respectivement) [27]. Brièvement, environ 100 μg de BSA-MSN ou BSA-MSN-anti-VEGFR2 ont été dilués avec 100 μL de tampon phosphate (PB), et 74 MBq ¹³¹ J'ai été ajouté. Ensuite, de la chloramine-T (100 μL ; 5 mg/mL dans du PB) a été ajoutée au mélange. Après 60 s d'agitation et d'incubation, la réaction a été arrêtée en ajoutant 100 μL de métabisulfite de sodium (5 mg/mL dans PB). Le tube de centrifugation a été utilisé pour séparer les BSA-MSN marqués et les BSA-MSN-anti-VEGFR2 des composés de faible poids moléculaire. Le taux de marquage et la pureté radiochimique du ¹³¹ Les nanoparticules marquées ont été déterminées par chromatographie sur couche mince.

Captation cellulaire in vitro :étude de microscopie confocale

Dans un premier temps, les MSN-anti-VEGFR2 et les MSN ont été marqués au FITC [28]. En bref, MSNs-NH₂ (100 mg) ont été ajoutés à 1 ml de solution d'alcool FITC (1 mg/ml), avec repos pendant 4 h sous agitation. Les MSN marqués FITC (FITC-MSN) ont été obtenus par centrifugation et séchés sous vide. FITC-MSNs-anti-VEGFR2 pourrait également être obtenu en utilisant la même méthode.

Les cellules FRO ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits pendant la nuit, puis 5 × 10 ⁵ les cellules par puits ont été incubées avec FITC-MSN et FITC-MSN-anti-VEGFR2 pendant 1 et 6 h à 37 °C, respectivement. Les cellules ont été lavées trois fois avec du tampon phosphate salin (PBS) puis fixées avec de l'éthanol à 70 % pendant 20 min. De plus, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et les noyaux ont été colorés au 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 45 min puis fixés au paraformaldéhyde (4 % en PBS). Les images de microscopie confocale ont été acquises à l'aide d'une microscopie confocale à balayage laser (CLSM) (Zeiss LSM 510, États-Unis).

Capture cellulaire dépendante du temps

Pour mesurer l'absorption cellulaire d'iode-131 en fonction du temps des nanoparticules, 1 × 10 ⁵ les cellules par puits ont été cultivées avec 3,7 MBq/mL de Na ¹³¹ libre Moi, ¹³¹ I-BSA-MSN, ou ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, respectivement. Les cellules ont ensuite été lavées aussi rapidement que possible avec 1 mL de solution tampon saline équilibrée de Hanks (HBSS), détachées avec de la trypsine et remises en suspension dans 1 mL de HBSS pendant 1, 2, 3, 5, 7 et 9 h. La radioactivité a été mesurée à l'aide d'un compteur (LKB gamma 1261, Australie). Toutes les expériences ont été réalisées trois fois pour obtenir des données exactes.

Modèle animal

Des souris nude Balb/c (femelles, âgées d'environ 4 semaines, pesant de 15 à 20 g) ont été achetées au Centre de recherche expérimentale sur les animaux de Pékin du Peking Union Medical College et maintenues dans des conditions spécifiques sans agent pathogène, avec une humidité relative (30 à 70 %) et un environnement à température contrôlée (20–24 °C) au Laboratory Animal Center, Tianjin Medical University, China. Toutes les procédures de manipulation des animaux étaient conformes à un protocole approuvé par le comité d'éthique de l'hôpital général de l'université médicale de Tianjin. Les xénogreffes tumorales FRO ont été induites par injection sous-cutanée de 5 × 10 ⁶ Cellules FRO dans 50 μL de PBS dans l'épaule droite des souris.

Imagerie In Vivo

Lorsque les souris nude porteuses de tumeurs ont été nourries pendant 1 à 2 semaines et que le volume de la tumeur avait atteint environ 10 mm de diamètre, les souris ont été réparties au hasard en trois groupes (Na ¹³¹ Moi, ¹³¹ I-BSA-MSN et ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2). Chaque groupe a reçu 7,4 MBq ¹³¹ I par injection intratumorale pour évaluer la localisation organique de ¹³¹ Nanoparticules marquées I. L'imagerie scintigraphique a été réalisée à 1, 2, 3, 7, 14 et 21 jours après l'injection de médicament respective. Des souris nudes ont été anesthésiées avec de l'hydrate de chloral à 4 % (150 μL) avant chaque balayage, placées en position couchée, puis imagées à l'aide d'un scanner SPECT/CT (Discovery NM/CT 670, États-Unis). Pour éviter l'exposition du tissu thyroïdien à des radiations et à une imagerie indésirables, du perchlorate de sodium (0,05 mg/mL) a été ajouté à l'eau de boisson pour toutes les souris 1 jour avant l'expérience et maintenu pendant 1 semaine.

Distribution des tissus

A 24 et 72 h après injection intratumorale de 7,4 MBq ¹³¹ Nanoparticules marquées I, les souris de chaque groupe (n = 3/groupe) ont été sacrifiés par dislocation cervicale, et les tissus du cœur, de la rate, des reins, du foie, des intestins, des poumons et des tumeurs ont été prélevés et pesés. La radioactivité dans divers organes a été mesurée à l'aide d'un compteur γ (LKB gamma 1261, Australie), et la radioactivité a été exprimée en pourcentage de dose injectée par gramme de tissu (%ID/g).

In Vivo ¹³¹ I Thérapie

Semblable à l'imagerie in vivo, les souris des trois groupes ont reçu une injection intratumorale d'une dose de 74 MBq (50 μL) de ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, ¹³¹ I-BSA-MSN et Na ¹³¹ I, respectivement, lorsque le volume tumoral avait atteint environ 10 mm de diamètre. Le même volume de solution saline normale a été administré en tant que groupe témoin. Le volume tumoral a été estimé à l'aide de la formule suivante :volume = 4π/3 (1/2 longueur × 1/2 largeur × 1/2 hauteur) [15, 29]. Le volume tumoral et le poids corporel des animaux ont été mesurés tous les 3 jours. Les souris étaient euthanasiées si elles perdaient plus de 20 % de leur poids corporel ou devenaient moribondes.

Examen histologique

Une fois l'expérience terminée, les souris ont été sacrifiées et la tumeur et les tissus normaux des quatre groupes, y compris le cœur, le foie, la rate, les reins et les poumons, ont été isolés pour étudier leur histopathologie. En bref, des coupes de paraffine de 5 mm d'épaisseur ont été déparaffinées en utilisant deux incubations au xylène (pendant 30 minutes chacune à 56 °C) puis réhydratées dans de l'éthanol. Les coupes ont ensuite été trempées pendant une nuit dans du saccharose à 10 % dans de l'eau distillée. Ensuite, les coupes ont été lavées dans du PBS 0,1 M, pH 7,4, incubées dans du peroxyde d'hydrogène à 1,2 % dans du méthanol pendant 30 min et rincées dans du PBS 0,1 M, pH 7,4, pendant 15 min. Les lames des tumeurs ont ensuite été incubées en chambre humide pendant une nuit, à température ambiante, avec des anticorps anti-VEGFR2 dilution 1:100. Après avoir été lavées trois fois avec du PBS, les lames ont été incubées avec le système de détection DAKO-REALTM En-Vision™ pendant 60 min, puis visualisées à l'aide de diaminobenzidine et contre-colorées avec de l'hématoxyline de Mayer. Toutes les images ont été acquises à l'aide d'un microscope Olympus.

Analyse statistique

Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne  ±  écart-type (SD) et l'analyse statistique a été réalisée à l'aide de SPSS (Statistical Package for Social Sciences) 12.0 pour Windows (SPSS, Chicago, IL, USA). L'analyse des données a été réalisée à l'aide des courbes de Kaplan-Meier et du test du log-rank. Tous les tests statistiques étaient bilatéraux et un P la valeur < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Les caractéristiques des nanoparticules

Les caractéristiques des nanoparticules ont été analysées et déterminées par MET et DLS (Fig. 1a–c). L'image MET a démontré que les MSN avaient une morphologie sphérique uniforme, et l'image DLS a montré que les MSN étaient uniformes avec une taille de 108 ± 5,9 nm. La modification de la BSA et/ou le ciblage anti-VEGFR2 n'ont pas modifié la morphologie des nanoparticules et n'ont entraîné qu'une légère tendance à l'agrégation en solution par rapport aux MSN non modifiés, ce qui peut avoir été causé par l'augmentation de la surface des nanocomplexes. Le diamètre du BSA-MSNs-anti-VEGFR2 a légèrement augmenté à 163 ± 4,6 nm, et le potentiel zêta moyen des MSN était de − 23,91 mV, qui est passé à 28,45 mV pour le BSA-MSN-anti-VEGFR2. Le changement du potentiel zêta et l'augmentation de la taille après modification de la surface suggèrent l'ajout réussi de BSA et d'anti-VEGFR2 à la surface des MSN à chaque étape (tableau 1). La caractérisation texturale des MSN a été confirmée par l'isotherme d'adsorption-désorption d'azote. Les MSN ont une structure mésoporeuse bien définie avec une superficie de 630,2 m ² /g, et un diamètre moyen des pores de 2,8 nm (Fig. 1d). La stabilité des nanoparticules BSA-MSNs-anti-VEGFR2 a été surveillée pendant plusieurs semaines, et aucune agrégation évidente n'a été observée. La proportion de ¹³¹ I étiquetage était d'environ 50-75%.

Les caractéristiques des nanoparticules. Caractérisations des MSN (a ), BSA-MSN (b ), BSA-MSNs-anti-VEGFR2 (c ), et l'isotherme d'adsorption-désorption d'azote et les courbes de distribution de la taille des pores de Barrett-Joyner-Halenda (BJH) des MSN (d ). Les images de microscopie électronique à transmission montrent que toutes avaient une morphologie régulière (sphérique uniforme). Les images de diffusion dynamique de la lumière montrent que toutes étaient uniformes, avec des tailles moyennes de 108 nm, 139 nm et 163 nm, respectivement. Les analyses BET et BJH ont démontré des isothermes typiques de type IV, compatibles avec une structure mésoporeuse

Capture de nanoparticules construites

La liaison des BSA-MSN et BSA-MSN-anti-VEGFR2 aux cellules cibles de la lignée cellulaire ATC humaine FRO a été testée en utilisant la microscopie confocale (Fig. 2). L'immunofluorescence a montré que les MSN ciblés et non ciblés pouvaient se lier efficacement aux cellules FRO. Après 1h d'incubation avec les BSA-MSNs ou BSA-MSNs-anti-VEGFR2, une fluorescence visible était présente dans les cellules, et qui s'est maintenue et renforcée après 6h d'incubation. Par rapport aux BSA-MSN-anti-VEGFR2, les BSA-MSN pourraient également se lier aux cellules, mais nous avons constaté que la rétention des cellules tumorales était minime et que le signal de fluorescence verte était faible. Ce résultat suggère que la capacité de ciblage des nanoparticules a été améliorée via une modification avec l'anticorps anti-VEGFR2.

Absorption de nanoparticules construites. Les images au microscope confocal à balayage laser ont montré une internalisation cellulaire de différentes formulations à 1 et 6 h pour les BSA-MSN et BSA-MSN-anti-VEGFR2. Le signal fluorescent à 1 h était augmenté à 6 h pour les deux groupes. De plus, la fluorescence verte de liaison dans le groupe ciblé anti-VEGFR2 était plus forte que celle du groupe non ciblé aux deux moments

Capture cellulaire dépendante du temps

Afin de déterminer l'absorption d'iode radioactif de Na ¹³¹ Moi, ¹³¹ I-BSA-MSN et ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 au fil du temps, ¹³¹ Des mesures d'activité chronométrées ont été obtenues dans des cellules FRO. Comme le montre la figure 3a, le ¹³¹ L'absorption dans cette lignée cellulaire a atteint son niveau maximal après 3 h d'incubation avec ¹³¹ I-BSA-MSN et après 5 h avec ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2. De plus, l'absorption d'iode radioactif de ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 était supérieur à celui de ¹³¹ I-BSA-MSN.

Absorption cellulaire et distribution tissulaire dépendantes du temps. un Les données sur l'absorption cellulaire dépendante du temps sont présentées comme la moyenne  ± SD de trois groupes. b Comparaison des données sur la biodistribution de ¹³¹ I dans la tumeur et les principaux organes de souris porteuses de tumeurs ATC à 24 et 72 h après injection intratumorale de Na ¹³¹ Moi, ¹³¹ I-BSA-MSN et ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2. La radioactivité du tissu tumoral du groupe ciblé anti-VEGFR2 à 24 et 72 h après l'injection intratumorale (32,2 ± 2,8 % ID/g et 23,0 ± 1,8 % ID/g, respectivement) était significativement plus élevée que celle du groupe non ciblé (26,1 ± 2,5% ID/g et 12,3 ± 1,2% ID/g, respectivement) (tous les P < 0,05). Les données sont également présentées comme la moyenne  ± SD pour les trois groupes

Distribution des tissus

La distribution tissulaire de ¹³¹ I chez la souris nude a été mesuré à l'aide d'un γ compteur à 24 et 72 h après l'injection intratumorale avec les médicaments respectifs (Fig. 3b). Les résultats ont révélé que les trois groupes présentaient une accumulation similaire de rayonnement dans les tissus normaux à 24 et 72 h. La radioactivité pour tous les groupes diminuait progressivement avec le temps et s'accumulait principalement dans la tumeur. De plus, l'accumulation dans le tissu tumoral 24 et 72 h après l'injection dans les deux groupes avec ¹³¹ Les nanoparticules marquées I étaient beaucoup plus élevées que celles du Na ¹³¹ I groupe, qui était de 11,6 ± 0,9% ID/g à 24 h et a diminué considérablement à 2,1 ± 0,08% ID/g en 72 h. Cependant, la concentration dans la tumeur du groupe ciblé anti-VEGFR2 à 24 et 72 h après l'injection était de 32,2 ± 2,8 % ID/g et de 23,0 ± 1,8 % ID/g, respectivement, ce qui était significativement plus élevé que celui des non- groupe ciblé (26,1 ± 2,5% ID/g et 12,3 ± 1,2% ID/g, respectivement, tous les P < 0,05).

Imagerie In Vivo

Pour déterminer le ¹³¹ Je capte et distribue des nanoparticules et observe le temps de séjour de ¹³¹ I dans le tissu tumoral in vivo, des images SPECT/CT représentatives de souris FRO porteuses de tumeurs ont été acquises à différents moments après l'injection intratumorale des médicaments respectifs (Fig. 4a). Les résultats ont montré que l'accumulation radioactive dans le Na ¹³¹ Le groupe I a été rapidement excrété de la tumeur 2 jours après l'injection et n'a pas été observé 3 jours après l'injection. En revanche, les deux groupes avec ¹³¹ Les nanoparticules marquées au I présentaient une clairance sanguine plus lente et une accumulation plus élevée dans le tissu tumoral, même 2 semaines après l'injection, en particulier dans le groupe cible anti-VEGFR2. Notamment, à 3 semaines après l'injection, la radioactivité dans le groupe ciblé était manifestement plus forte que celle dans le groupe non ciblé.

Imagerie in vivo, in vivo ¹³¹ I thérapie et analyse de survie. un Images SPECT/CT fusionnées et en trois dimensions de souris porteuses de tumeurs ATC obtenues à différents moments après injection intratumorale avec les médicaments respectifs. L'accumulation radioactive dans le Na ¹³¹ Le groupe I n'a pas été vu 3 jours après l'injection, mais était évident même 3 semaines après l'injection dans le groupe cible anti-VEGFR2. Volume tumoral (b ), poids corporel (c ) et les courbes de survie de Kaplan-Meier (d ) dans les modèles de xénogreffe FRO ATC (n = 6/groupe). La croissance tumorale et la perte de poids corporel dans le groupe ciblé ont été significativement inhibées par rapport à celles du groupe non ciblé, Na ¹³¹ I, ou groupe salin, respectivement. Les données sont présentées comme la moyenne  ± SD de trois groupes et tous étaient P  0,05. De plus, la durée de survie médiane dans le groupe ciblé (41 jours) a été significativement prolongée par rapport à celle du groupe non ciblé (34 jours) ou Na ¹³¹ Je (25 jours) groupe (tous les P  0.01)

In Vivo ¹³¹ I Thérapie

La figure 4b montre le volume tumoral moyen au fil du temps dans les quatre groupes. Le volume tumoral avant injection a été utilisé comme référence initiale. Sauf dans le ¹³¹ Groupe I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, les tumeurs se sont progressivement développées dans tous les groupes, notamment dans le Na ¹³¹ I et groupes salins. Au jour 24, le volume tumoral moyen dans le Na ¹³¹ I et les groupes salin était de 296,6 ± 24,2% et 278,3 ± 19,3%, respectivement, contre 198,7 ± 13,2% dans le ¹³¹ Groupe I-BSA-MSNs au jour 30. Fait intéressant, nous avons observé que le volume dans le groupe cible anti-VEGFR2 a diminué lentement après le jour 9 après l'injection et a presque diminué jusqu'à la référence initiale à la fin de l'observation.

La figure 4c montre les changements dans le poids corporel des quatre groupes. Le poids corporel a progressivement diminué dans le Na ¹³¹ I et groupes salins pendant la période d'observation. Cependant, les deux autres groupes n'ont perdu du poids qu'au cours de la première semaine, qui a été repris plus tard, en particulier pour le groupe cible anti-VEGFR2.

Analyse de survie

Dans cette étude, nous avons utilisé la probabilité de survie comme autre mesure pour évaluer les effets thérapeutiques de ¹³¹ Nanoparticules marquées I. La figure 4d montre les courbes de survie de Kaplan-Meier après des traitements avec une solution saline, Na ¹³¹ Moi, ¹³¹ I-BSA-MSN, ou ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 dans le modèle de souris nude porteuses de tumeurs ATC. Les tumeurs ont progressé rapidement dans la solution saline et Na ¹³¹ I groupes, et le temps de survie médian était de 27 et 25 jours, respectivement. L'analyse avec un test de log-rank a révélé que le temps de survie médian dans le ¹³¹ Le groupe I-BSA-MSNs (34 jours) a été significativement prolongé par rapport à celui du groupe Na ¹³¹ Je groupe (P  0,001). De plus, nous avons constaté que le traitement dans le groupe ciblé anti-VEGFR2 (durée de survie médiane, 41 jours) entraînait des résultats de survie significativement meilleurs que ceux du groupe non ciblé (P < 0,01).

Analyse histopathologique

Évaluer l'effet antitumoral de ¹³¹ Des nanoparticules marquées à l'I et testent la toxicité potentielle des MSN chez la souris, les principaux organes et tumeurs ont été collectés pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine après radiothérapie. Aucun changement pathologique significatif dans les organes vitaux n'a été observé chez les souris porteuses de tumeurs après traitement avec ¹³¹ Nanoparticules marquées I (Fig. 5a). Cela indiquait qu'aucune toxicité systémique apparente ne s'était produite au cours de la période d'observation. De plus, les tumeurs traitées avec ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 a montré une dégénérescence et une nécrose massive des cellules tumorales, ce qui était plus évident que dans le ¹³¹ Groupe I-BSA-MSNs. Cependant, la tumeur traitée avec Na ¹³¹ I ou le groupe salin était rempli de cellules tumorales viables. L'analyse immunohistochimique de la tumeur a révélé une expression visible de VEGFR (Fig. 5b).

Analyse histopathologique. un Analyse histopathologique des principaux organes de souris porteuses de tumeurs FRO ATC après traitement par ¹³¹ Nanoparticules marquées I. Aucun changement pathologique significatif dans le cœur, le foie, les poumons et les reins n'a été observé. b Examens pathologiques (coloration H&E) et analyse immunohistochimique des tumeurs chez la souris. Gros fragments de dégénérescence et nécrose des cellules tumorales dans le groupe ciblé anti-VEGFR2 et petits morceaux de nécrose de faible densité dans le ¹³¹ Le groupe I-BSA-MSN s'affiche. En revanche, seules des cellules tumorales viables ont été observées dans le Na ¹³¹ I et groupes salins. La microphotographie d'une analyse immunohistochimique a montré une expression visible de VEGFR. Bar = 200 μm

Discussion

Le pronostic de l'ATC reste sombre et il n'existe pas à ce jour d'options thérapeutiques efficaces [1, 2, 6]. La thérapie moléculaire ciblée, en tant que nouvelle thérapie, a amélioré la morbidité et la mortalité de nombreux cancers [23, 24]. VEGFR is crucial to microvascular formation, which facilitates the growth of most malignancies, and allows continued tumor expansion [9, 10]. In this study, we evaluated the efficacies of Na ¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSNs, and ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 for the treatment of ATC in tumor-bearing nude mouse models. The results demonstrated that both anti-VEGFR2 targeted and non-targeted nanoparticles labeled with ¹³¹ I were effective in delaying the tumor growth of ATC and that the ¹³¹ I-labeling anti-VEGFR2 targeted MSNs was the most effective agent to inhibit the tumor growth in nude mice and prolonging median survival. This treatment modality might represent a novel therapeutic option for ATC.

VEGFR targeting with nanoparticles is rarely reported in the literature. Goel S et al. [19] confirmed that VEGFR targeting using VEGF₁₂₁ conjugated, anti-VEGFR therapeutics-loaded MSNs represented a major advance for angiogenesis imaging and inhibition in human glioblastoma. A study performed by Gule indicated that inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) and VEGFR2 in ATC using vandetanib causes significant tumor growth inhibition in vivo in an orthotopic xenograft model [15]. In the present study, using confocal microscopy, we found that both targeted and non-targeted nanoparticles could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells, and further confirmed that the targeting ability of the nanoparticles was enhanced via modification with the anti-VEGFR2 antibody, which result was consistent with that of the time-dependent cellular uptake experiment. Additionally, after intratumoral injection with the respective drugs, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I in the tumor-bearing nude mice at 24 and 72 h for the different groups. The radioactivity for all groups was mostly accumulated in the tumor and gradually decreased with time. Moreover, we found that the radioactivity in anti-VEGFR2 targeted group could be retained for longer time in the tumor in comparison with non-targeted group, which was also consistent with the results observed by confocal microscopy.

SPECT/CT is a powerful tool to provide both structural and functional imaging information for diseases, and can monitor the metabolism of radioactive drugs at different times post injection [30,31,32]. In the present study, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I using SPECT/CT. The results showed that radioactive accumulation in the Na ¹³¹ I group was not seen at 3 day post-injection. However, higher accumulation in the tumor tissue was observed at 2 weeks post-injection for the two groups with ¹³¹ I-labeled nanoparticles, and at 3 weeks the radioactive signal in the anti-VEGFR2 targeted group was apparently stronger than that in the non-targeted group. We hypothesized that the passive tumor targeting of MSNs, which relies on unpredictable tumor extravasation and enhanced permeability retention effect, and positive targeting linked with anti-VEGFR-2, associated with VEGFR2 overexpression in ATC, played a key role in enhancing the retention of the nanoparticles in the tumors. This finding revealed that anti-VEGFR2 modification prolonged the retention time of ¹³¹ I in the tumor tissue compared with that of free Na ¹³¹ I and ¹³¹ I-BSA-MSN, which was also similar to the tissue biodistribution of ¹³¹ I measured by γ counter.

In the present study, we monitored the body weight change of nude mice after intratumoral injection with a single dose of 2 mCi ¹³¹ I, which showed that the body weight in the ¹³¹ I-labeled nanoparticle groups gradually increased at 1 week post-injection, especially for the anti-VEGFR2 targeted group. Similarly, we also observed the changes in tumor volume and found that the tumors in the Na ¹³¹ I or saline group grew rapidly, while the volume in ¹³¹ I-BSA-MSNs group increased slowly. Interestingly, the tumors in anti-VEGFR2 targeted group gradually decreased after 1 week post-injection, which was contrary to the body weight change. These results indicated that the anti-VEGFR2 modification could effectively inhibit the increase in tumor volume and thereby enhanced the efficiency of ¹³¹ I therapy. We considered that the tumor necrosis was caused by the beta rays emitted from ¹³¹ I, which resulted in tumor shrinkage and indirectly led to an increase in body weight. This effect, we speculated, began to appear mainly 1 week after injection of ¹³¹ I.

Our findings indicated that the treatment mediated by intratumorally injected ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 resulted in significant tumor growth delay, which was confirmed increased structural damage and massive necrosis in tumor tissue compared with that in the ¹³¹ I-BSA-MSNs group. Significantly, this higher antitumor activity was achieved without causing apparent systemic toxic effects, as indicated by the lack of significant pathological changes in the vital organs observed in tumor-bearing nude mice. Although further studies are needed to document both the acute and chronic toxicological effects, ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 exhibited several properties that made them a promising candidate for minimally invasive therapy for ATC.

In our pre-experiment, injection into the tail vein was performed and the results showed that the radioactivity was mainly distributed in the phagocytosis system. Intratumoral injection was used in some studies [29, 33, 34], and the operation is more convenient. Therefore, we used intratumoral injection as the injection method and also achieved better results. MSNs offer a promising approach to overcome the insolubility issue and deliver large payloads of hydrophobic small molecule drugs. Currently, we are investigating the potential for loading targeted anti-cancer drugs using MSNs. We will provide the results in the future publication.

Conclusions

In the present study, we successfully synthesized BSA-MSNs-anti-VEGFR2, with uniform spherical morphology, and which were radiolabeled with ¹³¹ I using the Chloramine-T method. The results showed that both targeted and non-targeted MSNs could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells. The radioactivity in ATC tumor-bearing nude mouse model was mostly accumulated in the tumor and could be retained a longer time in the ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 group. Additionally, the tissue distribution of ¹³¹ I could be also imaged and validated using SPECT/CT. Moreover, tumor growth in the ATC tumor-bearing nude mouse model was significantly inhibited by the anti-VEGFR2 targeted MSNs compared with that achieved using non-targeted MSNs and the ¹³¹ I treatment with anti-VEGFR2 targeting MSNs significantly prolonged the survival of ATC tumor-bearing mice. Our data supported the view that such an approach may represent a more effective means to treat ATC.

Abréviations

APTES:

Aminopropyltriethoxysilane

ATC:

anaplastic thyroid cancer

BSA:

Sérum albumine bovine

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

CTAB :

Hexadecyltrimethylammonium bromide

DAPI:

4,6-Diamidino-2-phenylindole

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM :

Dulbecco’s modified Eagle medium

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

EDC :

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride

FBS :

Sérum fœtal bovin

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

HBSS:

Hanks’ balanced salt solution

MSNs:

Mesoporous silica nanoparticles

NHS:

N -hydroxysuccinimide

PBS :

Phosphate buffer saline

TEM :

Microscope électronique à transmission

TEOS :

Orthosilicate de tétraéthyle

VEGFR:

Vascular endothelial growth factor receptor