Internalisation dépendante de la forme de nanostructures d'or dans les cellules de glioblastome : de la synthèse à l'interaction cellulaire

Résumé

Les nanostructures d'or (Au NS) à taille et forme contrôlées émergent comme outils polyvalents pour la nanomédecine. Cependant, le destin cellulaire de différentes géométries reste mal compris, particulièrement dans les cancers agressifs comme le glioblastome. Nous avons synthétisé cinq Au NS distincts — nanobâtonnets (NR), tétrahexaèdres (THH), bipyramides (BP), particules sphériques (SP) et une nouvelle forme dénommée nano-oreiller (NO) — par croissance à partir de germes avec tensioactifs binaires et voie de Turkevich modifiée. Toutes les particules ont été fonctionnalisées en surface avec PEG-SH et acide 11-mercaptoundécanoïque (MUA) pour conférer une charge négative et une stabilité stérique. Les essais de cytotoxicité (LIVE/DEAD) sur cellules U-87 MG de glioblastome révèlent des effets dépendants de la forme : NO présente la mortalité cellulaire la plus élevée (~20 % à 2 mg mL⁻¹) tandis que SP et BP restent largement non toxiques. La microscopie électronique à transmission montre que NO pénètre dans les cellules via endocytose médiée par récepteurs en 2 h, puis déclenche la macropinocytose, menant à une accumulation vésiculaire et au détachement cellulaire. Ces résultats démontrent que la morphologie des particules, plutôt que la taille seule, gouverne les voies d'internalisation et les issues cytotoxiques, positionnant NO comme candidat prometteur pour la thérapie photothermique ciblée et l'administration de médicaments dans le glioblastome.

Contexte

Les nanostructures d'or sont prisées pour leurs propriétés optiques et électroniques dépendantes de la forme et de la taille, permettant applications du biosensing à la thérapie photothermique. La résonance de plasmon de surface localisée (RPSL) dans le visible–proche infrarouge (NIR) fait des particules anisotropes, surtout les nanobâtonnets à fort rapport d'aspect, d'excellents agents de contraste pour l'imagerie tomodensitométrique et photoacoustique. Les nanostructures plus petites exhibent une absorption supérieure, augmentant l'efficacité photothermique. De plus, les formes anisotropes peuvent s'auto-assembler en superstructures générant des champs électromagnétiques intenses, avantageux pour la diffusion Raman amplifiée en surface et l'administration ciblée de médicaments.

La croissance à partir de germes, souvent complétée par des ions argent et mélanges de tensioactifs (ex. CTAB avec acide oléique ou DDAB), est devenue la méthode privilégiée pour adapter les Au NS, permettant un contrôle précis du rapport d'aspect et de la croissance des facettes. Malgré les avancées de synthèse, les études systématiques sur l'interaction de différentes géométries avec les cellules — particulièrement le glioblastome, tumeur cérébrale hautement proliférative et invasive — sont limitées. Comprendre ces interactions est essentiel pour concevoir des nanomédecines ciblant sélectivement les cellules cancéreuses tout en minimisant les effets hors cible.

Le glioblastome multiforme (GBM) reste la tumeur cérébrale primitive la plus létale, avec survie médiane <15 mois malgré thérapie agressive. Les cellules U-87 MG de glioblastome-astrocytome prolifèrent rapidement (temps de doublement ~32 h) et internalisent aisément les particules étrangères, les rendant idéales pour études d'internalisation. Nous présentons ici une comparaison complète de cinq formes d'Au NS, focalisant sur synthèse, fonctionnalisation de surface, cytotoxicité et mécanismes d'internalisation dans les cellules U-87 MG.

Expérimental

Matériaux

Tous les réactifs (acide oléique, nitrate d'argent, CTAB, HAuCl₄·3H₂O, acide ascorbique, NaBH₄, PEG-SH, MUA, etc.) achetés chez Sigma-Aldrich ou Merck, utilisés sans purification supplémentaire. Solutions préparées avec eau ultrapure (18,2 MΩ cm).

Synthèse des Au NS anisotropes

Particules germes (~5 nm) préparées par réduction de HAuCl₄ avec NaBH₄ dans CTAB. Pour nanobâtonnets, tétrahexaèdres et bipyramides, une solution de croissance contenant CTAB, co-tensioactif (acide oléique ou DDAB), AgNO₃ et acide ascorbique chauffée à 80 °C. Après refroidissement, solution germe et HAuCl₄ ajoutés, mélange agité à 35 °C pendant 24 h. L'ajustement du rapport acide oléique/CTAB donnait la morphologie souhaitée : faibles rapports produisaient nanobâtonnets os-seins, rapports plus élevés donnaient tétrahexaèdres allongés, et la combinaison CTAB/DDAB produisait les bipyramides. Pour la nouvelle forme nano-oreiller, une croissance en deux étapes employée : réaction initiale à partir de germe suivie d'une seconde étape de croissance utilisant la solution intermédiaire, produisant une particule tridimensionnelle irrégulière ressemblant à un oreiller (oreiller = makura en japonais).

Synthèse des Au NS sphériques

SP fabriquées par méthode de Turkevich modifiée : solution citrate de sodium 10 mM (10 mL) chauffée à 70 °C, suivie de l'addition goutte à goutte de HAuCl₄ 1,5 mM (10 mL). Le mélange devenait pourpre-rouge après ~8 min et refroidi à température ambiante avant centrifugation (14 500 tr/min, 10 min).

Fonctionnalisation de surface

Particules d'abord incubées avec PEG-SH (1 mg mL⁻¹) pendant 2 h pour remplacer CTAB et fournir stabilisation stérique. Après centrifugation, les NS PEGylées traitées avec MUA (250 µL 10 mM dans EtOH/H₂O) pendant 1 h à 55 °C, réalisant élimination complète du CTAB et charge négative de surface. Taille et potentiel zêta suivis par DLS ; XPS confirmait l'élimination du brome de surface.

Culture cellulaire et essai de viabilité

Cellules U-87 MG maintenues en EMEM supplémenté 10 % FBS, 2 mM L-glutamine, 1 % NEAA, 1 mM pyruvate de sodium, 1,25 % gentamicine. Pour cytotoxicité, cellules à 70 % confluence incubées avec Au NS à 100, 200, 500 µg mL⁻¹ et 2 mg mL⁻¹ pendant 24 h. Mortalité quantifiée par essai LIVE/DEAD (calcéine AM et éthidium homodimère-1) et coloration nucléaire Hoechst, imagées sur microscope Zeiss Axiovert 200 M. Trois puits indépendants par concentration analysés.

Étude d'internalisation temporelle (NO)

Cellules exposées à 2 mg mL⁻¹ NO pendant 2, 6, 12 et 24 h. Après incubation, cellules fixées avec 2 % paraformaldéhyde et 2,5 % glutaraldéhyde, post-fixées au tétroxyde d'osmium (± ferrocyanure de potassium), déshydratées, incluses pour coupes ultrafines (70 nm) MET. Images MET utilisées pour suivre localisation et morphologie de NO dans compartiments cellulaires.

Caractérisation

STEM champ clair et HRMET (JEOL 2100, 200 kV) évaluaient morphologie et cristallinité. Spectres UV-Vis (200–800 nm) sur Shimadzu UV-2401PC. Diffusion dynamique de la lumière et potentiel zêta sur Malvern Zetasizer Nano-ZS. XPS avec spectromètre Kratos Axis Ultra DLD (Al Kα, 1486,6 eV).

Résultats et Discussion

Synthèse et caractérisation des Au NS anisotropes

La croissance à partir de germes avec tensioactifs binaires produisait nanobâtonnets à haut rendement (~20 nm × 50 nm), tétrahexaèdres (~50 nm arête) et bipyramides (~200 nm). Les particules nano-oreiller affichaient une morphologie unique, tridimensionnelle, irrégulière, confirmée par MET à multiples orientations. L'HRMET révélait des cœurs monocristallins à facettes lisses pour NR, tandis que NO montrait surfaces déchiquetées et bande RPSL plus large, reflétant leur polydispersité. Spectres UV-Vis exhibaient pics de plasmon longitudinal et transverse distincts : NR (516, 679, 796 nm), THH (≈568 nm), BP (≈593 nm), NO (≈557 et 760 nm). SP montraient un pic unique à 520 nm.

Résultats de la fonctionnalisation de surface

Mesures DLS montraient augmentations incrémentales de taille après enrobage PEG-SH et MUA, sauf pour BP où légère diminution observée due à compactage plus serré. Potentiel zêta passait de positif (CTAB-enrobé) à négatif (MUA-enrobé), confirmant échange de ligands réussi. Spectres XPS exhibaient brome négligeable, indiquant élimination quasi-complète du CTAB. Spectres optiques restaient largement inchangés, avec seul élargissement mineur de pics pour formes anisotropes, attribuable à agrandissement de taille et rugosité de surface.

Cytotoxicité dépendante de la forme

Essais LIVE/DEAD révélaient que NO induisait la mortalité la plus élevée (~20 % à 2 mg mL⁻¹), tandis que SP et BP restaient <5 % cytotoxiques à toutes concentrations. NR, malgré leur fort rapport d'aspect et charge de surface positive, n'augmentaient pas la mortalité relative aux autres formes, suggérant que la mesure de charge de surface par potentiel zêta peut ne pas refléter fidèlement la charge locale réelle sur particules anisotropes. Globalement, la taille jouait un rôle mineur ; SP 15 nm et BP 650 nm affichaient internalisation et toxicité comparables.

Mécanismes d'internalisation des nano-oreiller

MET temporel montrait NO s'associant à la membrane plasmique après 2 h, suivi d'internalisation via endocytose médiée par récepteurs. À 12 h, vésicules contenant NO indiquaient basculement vers macropinocytose, probablement dû à l'agrégation et l'adsorption de protéines. NO se localisait préférentiellement à la périphérie des endosomes, s'alignant avec la membrane vésiculaire, et traficait vers la région périnucléaire. À 24 h, accumulation vésiculaire extensive corrélée avec changements morphologiques : cellules perdaient filopodes, devenaient arrondies, se détachaient du substrat, indiquant disruption cytosquelettique et apoptose.

Discussion

Ces résultats soulignent l'influence critique de la morphologie des particules sur les voies d'internalisation cellulaire. Si les formes anisotropes peuvent améliorer les propriétés optiques et photothermiques, leur géométrie irrégulière peut aussi augmenter la formation de couronne protéique, favorisant macropinocytose et cytotoxicité. Les particules nano-oreiller, par leur structure en oreiller, réalisaient une internalisation efficace et mortalité cellulaire significative, en faisant des candidats attractifs pour thérapie du glioblastome. Futures études devraient explorer biodistribution in vivo et efficacité thérapeutique, ainsi que fonctionnalisation avec ligands ciblant pour améliorer la sélectivité.

Conclusions

Nous avons synthétisé cinq nanostructures d'or de formes et tailles distinctes, uniformément fonctionnalisées avec PEG-SH et MUA pour donner des particules stables, chargées négativement. La forme, plutôt que la taille seule, dictait l'internalisation cellulaire et la cytotoxicité dans les cellules U-87 MG de glioblastome. La nouvelle forme nano-oreiller démontrait une internalisation supérieure, menant à mortalité cellulaire significative via endocytose médiée par récepteurs puis macropinocytose. Ces résultats positionnent nano-oreiller comme plateforme prometteuse pour thérapie photothermique combinée et administration de médicaments dans les tumeurs cérébrales agressives.

Abréviations

AgNO₃

Nitrate d'argent

Au

Or

BF

Champ clair

BP

Bipyramides

CTAB

Bromure de cétyltriméthylammonium

DDAB

Bromure de didécyldiméthylammonium

DLS

Diffusion dynamique de la lumière

EMEM

Milieu minimal essentiel d'Eagle

EthD-1

Éthidium homodimère-1

GBM

Glioblastome multiforme

HAuCl₄

Acide chloroaurique

HRMET

Microscopie électronique à transmission haute résolution

IR

Infrarouge

RPSL

Résonance de plasmon de surface localisée

MUA

Acide 11-mercaptoundécanoïque

Na-citrate

Citrate de sodium dihydraté

NO

nano-oreiller

NR

Nanobâtonnets

NS

Nanostructure

OA

Acide oléique

PEG-SH

O-[2-(3-mercaptopropionylamino)éthyl]-O-éthylpolyéthylène glycol

STEM

Microscopie électronique à transmission à balayage

MET

Microscopie électronique à transmission

THH

Tétrahexaèdres

UV-Vis

Spectroscopie ultraviolette-visible

XPS

Spectroscopie photoélectronique X