Évaluation de la toxicité des nanoparticules de PEG-PCCL et enquête préliminaire sur son effet anti-tumoral de charge de paclitaxel

Résumé

L'efficacité du traitement unique des médicaments chimiothérapeutiques conventionnels est désagréablement réduite par les barrières physiologiques des tumeurs. À cet égard, les nanoparticules sont devenues attrayantes pour atteindre un tel objectif médical de thérapie ciblée contre le cancer en délivrant des agents antitumoraux dans la zone nécessaire. Un nouveau médicament libérateur, le poly (éthylène glycol) carboxyl-poly (ε-caprolactone) (PEG-PCCL), a été signalé comme étant hautement hydrophile et stable, alors que sa toxicité organique est mal connue. Cette étude s'est concentrée sur les évaluations de la toxicité systémique du PEG-PCCL. La pharmacocinétique du PEG-PCCL chargé de PTX (PEG-PCCL/PTX) et son effet anti-tumoral ont été préalablement étudiés. Dans le présent travail, PEG-PCCL a été caractérisé par analyseur de taille de particules laser et microscopie électronique à transmission. La cytotoxicité a été étudiée par test MTT, test de fuite de LDH, immunofluorescence et microscopie électronique à transmission. Des tests d'hémolyse, de phlébite et de toxicité organique ont été effectués pour démontrer la biocompatibilité et la biotoxicité aiguë. Des souris porteuses de tumeurs H22 ont été utilisées pour évaluer la pharmacocinétique des micelles de PEG-PCCL/PTX et son effet anti-tumoral. Les résultats ont montré que la taille des nanosphères de PEG-PCCL était de 97 ± 2,6 nm. Le traitement au PEG-PCCL a montré une faible cytotoxicité et une bonne biocompatibilité, et n'a pas présenté de toxicité pour les organes. L'efficacité de chargement PTX était de 49,98 %. L'étude pharmacocinétique sur des souris porteuses de tumeurs H22 a révélé que le PEG-PCCL/PTX a une stabilité plus élevée et une libération plus lente que le PTX seul. Ensemble, ces résultats suggèrent que la nanosphère PEG-PCCL a peu de toxicité pour les organismes et est un candidat potentiel de véhicule médicamenteux biocompatible pour les médicaments hydrophobes.

Introduction

La tendance à la hausse de l'incidence du cancer se poursuit parallèlement à l'augmentation du vieillissement de la population au cours des dernières décennies [1]. L'efficacité de la chimiothérapie conventionnelle des cancers a été limitée car seule une petite partie de la dose totale atteint le site tumoral, dont le reste est distribué dans les tissus sains, entraînant des effets négatifs en particulier la neutropénie et la cardiomyopathie [2]. Les nanoparticules représentent une plate-forme potentielle pour l'administration de médicaments chimiothérapeutiques en raison de leurs caractéristiques physiques et chimiques uniques [3]. En conséquence, un effet secondaire réduit et une efficacité thérapeutique améliorée peuvent être obtenus. Les copolymères à base de Poly (éthylène glycol) (PEG) et de méthoxy poly(éthylène glycol) (MePEG)/poly(ɛ-caprolactone) (PCL) sont censés être des nanoparticules organiques prometteuses utilisées dans les systèmes d'administration de médicaments (DDS), et ont déjà été approuvé par la FDA. Ces nanoparticules possèdent des caractéristiques facilement contrôlées telles que la biocompatibilité, la biodégradabilité et la thermosensibilité [4]. Certains polymères diblocs et triblocs ont été étudiés dans des applications biomédicales, comme la nanosphère PCL [5], le PEG-PCL-PEG [6,7,8] et l'hydrogel PCL-PEG-PCL [9]. Les blocs PCL composent un noyau hydrophobe capsulant des médicaments hydrophobes, tandis que les blocs PEG forment une enveloppe hydrophile, ce qui donne des nanostructures micellaires noyau-enveloppe. Ces polymères diblocs et triblocs attirent considérablement l'attention en raison de caractéristiques telles qu'une structure stable, une durée prolongée dans la circulation sanguine et un ciblage passif au moyen d'un effet de perméation et de rétention amélioré [10]. Cependant, des défis controversés liés aux polymères organiques existent toujours, notamment la toxicité, les faibles charges utiles de médicaments, les fuites indésirables de médicaments et la clairance par le système réticulo-endothélial [11,12,13].

En comparaison avec les polymères mentionnés ci-dessus, le PEG-PCCL, qui est en outre modifié de manière covalente sur la caprolactone et qui a été préparé et caractérisé dans nos études précédentes [14, 15], montre une plus grande hydrophilie et une meilleure stabilité via l'effet de la liaison hydrogène. . En dehors des résultats caractéristiques physico-chimiques, peu de données ont été rapportées concernant des études de toxicité in vivo et in vitro des supports polymériques. Néanmoins, les modèles prédictifs et les méthodes standard validées nécessitent un ensemble de règles de conception impliquant le dosage de la toxicité des nanoparticules.

Compte tenu de cela, nous nous sommes concentrés ici sur l'évaluation de la toxicité aiguë in vivo et in vitro du PEG-PCCL qualitativement et quantitativement malgré ses attributs favorables de haute tolérance et de biodégradabilité in vivo. Une nanoparticule largement utilisée dans la recherche biomédicale, le polyétherimide (PEI), a été élue comme témoin positif. Le paclitaxel (PTX) est un médicament anticancéreux de première intention [16], en particulier un agent chimiothérapeutique optimisé pour le cancer de l'ovaire et le cancer du poumon non à petites cellules, et a été répertorié dans la Liste des médicaments essentiels de l'Organisation mondiale de la santé . Avec le développement de la nanotechnologie, le chargement de PTX dans les nanoparticules est considéré comme une solution potentielle pour l'administration de médicaments spécifiques à un site dans le cadre d'un traitement de coopération multidisciplinaire [17, 18]. Dans cette étude, le PEG-PCCL chargé de PTX a été utilisé pour examiner la pharmacocinétique et son effet anti-tumoral in vivo dans un modèle de souris porteuses de tumeurs hépatiques H22.

Méthodes

Matériaux, cellules et animaux

ε-caprolactone (ε-CL, Alfa Aesar, USA), poly(éthylène glycol) (PEG, Mn = 1000, Fluka, USA), hexaméthylène diisocyanate (HMDI, Aldrich, USA), Palladium sur charbon (pd/c, Sigma , USA), milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Hyclone, USA), bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium (MTT, Sigma, USA), albumine de sérum bovin (BSA , BR, BoAo Co. Ltd., Chine) ont été utilisés sans autre purification. Tous les matériaux étaient de qualité réactif analytique.

Des souris Balb/C mâles (âgées de 7 à 8 semaines, poids de 20 à 25 g) et des lapins néo-zélandais (poids de 2,5 à 3,0 kg) ont été achetés auprès des sociétés de biotechnologie de Chengdu DaShuo (Sichuan, Chine) avec le certificat de qualité n° SCXK2013– 24. Les animaux ont été maintenus dans un environnement standard exempt d'agents pathogènes spécifiques avec suffisamment de nourriture et d'eau du robinet. Les expériences ont été menées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Ministère des sciences et de la technologie de Chine, 2006). Toutes les procédures d'expérimentation animale ont été approuvées par le Comité d'éthique pour les animaux de laboratoire du Centre médical de Chine occidentale de l'Université du Sichuan.

Des cellules d'hépatocarcinome H22 de souris (H22), des cellules de rein embryonnaire humain (HEK293T) et des cellules de carcinome d'hépatome (Hep G2) ont été obtenues auprès du Département d'immunologie de la West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University. HEK293T et Hep G2 ont été cultivés dans des milieux Eagle modifiés de Dulbecco (DMEM) (Hyclone, UT, USA), supplémentés de 10 % de sérum de veau foetal (FCS) (Hyclone, UT, USA) et d'antibiotiques (pénicilline 100 U/mL et streptomycine 100 U/mL) à 37 °C dans 5 % de CO2.

Préparation de PEG-PCCL et de PEG-PCCL Micells PTX-Loaded

Les PEG-PCCL et PTX-NP ont été fournis par notre coopérateur, le professeur Liu de l'École de microélectronique et d'électronique à semi-conducteurs de l'Université des sciences et technologies électroniques de Chine. Les copolymères diblocs PEG-PCCL ont été synthétisés par la polymérisation par ouverture de cycle de ɛ-CL en présence d'homopolymère PEG avec les catalyseurs de Palladium sur charbon comme l'organigramme ci-dessous (Fig. 1). Les copolymères PEG-PCCL obtenus ont été purifiés et conservés dans des sacs hermétiques jusqu'à utilisation.

L'organigramme de la synthèse du dipolymère PEG-PCCL

Pour charger le PTX dans les nanoparticules de PEG-PCCL, la dispersion solide, une technique simple et précieuse sans solvant organique toxique [19] a été réalisée après la préparation du PEG-PCCL. Ensuite, la solution a été évaporée à 60 °C sous pression réduite. Après évaporation de l'alcool, des copolymères homogènes ont été obtenus. La PTX a été encapsulée par des supports polymères sous forme amorphe. La co-évaporation a été dissoute dans de l'eau à 65 °C pour produire une solution de PTX-NPs, qui a été filtrée avec un filtre de 0,22 nm pour obtenir une solution clarifiée et stérile. La poudre de PTX-NPs a été obtenue à partir de la solution lyophilisée d'un système de lyophilisation. L'efficacité de piégeage (EE) de la PTX a été déterminée avec la méthode de centrifugation sur minicolonne [20]. Les concentrations de PTX incorporées dans le PEG-PCCL (C_I ) ou le médicament total dans les dispersions PEG-PCCL (C_T ) ont été analysés par HPLC. EE (%) = (C_I / C_T ) × 100%.

Caractérisation

La taille des particules et le potentiel zêta du PEG-PCCL ont été mesurés avec un granulomètre laser (Malvern Nano-ZS 90). La microscopie électronique à transmission (MET, H-6009IV, Hitachi, Japon) a été utilisée pour évaluer la morphologie du PEG-PCCL. Plus précisément, la solution de nanoparticules a été placée sur une grille de cuivre recouverte de nitrocellulose, puis les échantillons ont été colorés à l'acide phosphotungstique et séchés à température ambiante.

Dosages de cytotoxicité

La cytotoxicité a été évaluée par test de fuite MTT et LDH dans Hep-G2 et HEK293T. La métabolisation du MTS a été quantifiée dans les cellules intactes selon la procédure du MTT [21]. Les suspensions cellulaires ont été préparées par trypsine/EDTA (HyClone, UT, USA). Un total de 0,4 × 10⁴ les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits (Corning, MA, USA). Les plaques ont été incubées pendant 12 h pour permettre aux cellules de se fixer à la surface en plastique des plaques de culture. Ensuite, le milieu a été retiré et 200 µl de milieu de culture frais ou de milieu contenant différentes concentrations de PEG-PCCL (de 0 à 1 mg/mL) ont été ajoutés dans les puits. Aucun FCS n'a été ajouté au milieu pendant la période d'exposition de 24 heures. Le taux de survie a été déterminé par les paramètres de cytotoxicité et a été présenté par l'équation :Taux de survie (%) = (OD_T /OD_C ) × 100. Ici, OD_T et OD_C se référer à la valeur d'absorbance (mesurée avec le lecteur du spectrophotomètre à 570 nm) des cellules traitées aux nanoparticules PEG-PCCL ou PEI et des cellules non traitées, respectivement.

La fuite de LDH dans le milieu de culture a été examinée à l'aide du kit de dosage LDH (Biotech, Chine). Toutes les mesures spectrométriques des groupes traités aux nanoparticules ont été corrigées par un contrôle acellulaire. Pour l'étude morphologique, les cellules HepG2 ont été ensemencées et exposées de la même manière que dans les tests de cytotoxicité. Les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % et ont été observées au microscope électronique à transmission (MET).

Tests d'apoptose

L'apoptose a été déterminée par double coloration à l'Annexine V-FITC et PI [22]. Brièvement, les cellules HepG2 ont été ensemencées dans des plaques 12 puits à une densité de 4 × 10⁴ cellules/puits et traités avec du PEG-PCCL (0,5 mg/mL) et du PEI (0,5 mg/mL) pendant 48 h. Ensuite, les cellules ont été lavées avec une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) trois fois, suivies d'une incubation à l'annexine V-FITC pendant 15 minutes et d'une coloration PI pendant 15 minutes supplémentaires à 4 °C dans l'obscurité. Les cellules colorées ont été observées au microscope à fluorescence (Olympus Co. Ltd., Tokyo, Japon) en 30 min.

Test d'hémocompatibilité

L'hémocompatibilité du PEG/PCCL a été évaluée selon le test d'hémolyse in vitro des globules rouges (GR) rapporté précédemment [23]. Les échantillons de sang de souris ont été collectés et les érythrocytes ont été dissous dans du PBS (solution de RBC à 2%). Du sérum physiologique, du PEI ou du PEG-PCCL à 0,5 mg/ml ont été mélangés avec la solution de GR à 2 %. Un contrôle d'hémolyse positif a été préparé en ajoutant un volume égal de suspension d'érythrocytes et d'eau distillée. Après avoir maintenu le mélange pendant 1 et 3 h à 37 °C, puis centrifugé à 2000 r/min pendant 5 min, les surnageants ont été détectés avec un lecteur de microplaques (Bio-Rad, CA, USA) à 570 nm. Le pourcentage d'hémolyse a été calculé par l'équation :hémolyse % = (OD_T –OD_NC )/(OD_PC –OD_NC ) × 100. Ici, OD_T , OD_NC , et OD_PC se référer aux valeurs d'absorbance de l'échantillon, du contrôle négatif et du contrôle positif, respectivement. De plus, l'hémolyse in vivo a été testée en comptant le nombre de globules rouges à partir de l'échantillon de sang prélevé dans la veine caudale des souris traitées avec une solution saline normale, du PEI (20 mg/kg) ou du PEG-PCCL (20 mg/kg) pendant 3 h.

Phlébite du lapin

Les veines des deux oreilles de lapins ont été utilisées pour comparer l'infiltration cellulaire inflammatoire et la dégénérescence épidermique [24, 25]. Les lapins ont été répartis au hasard en deux groupes; chacun a reçu soit 1 ml de solution saline physiologique, soit 0,5 mg/ml de PEG-PCCL via la veine auriculaire. Des lapins ont été tués par surdosage d'hydrate de chloral (4 %, Sigma, USA) 24 h après la perfusion de nanoparticules. Deux échantillons de veine auriculaire, y compris la région à 10-15 mm de l'extrémité du cathéter à la fois proximale et distale, ont été obtenus. Ces veines ont été fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 4%. Ensuite, des coupes transversales de paraffine ont été préparées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (HE). L'examen histopathologique a été réalisé en aveugle. Les résultats ont été classés selon les critères indiqués dans le tableau qui étaient basés sur ceux de Kuwahara [17] avec l'ajout de la dégénérescence épidermique.

Tests de la fonction hépatorénale

Après 7 jours d'administration de PEG-PCCL (0,5 mL, 20 mg/kg) sur des souris, les échantillons de sang ont été extraits du plexus veineux orbitaire (2 mL) et immédiatement centrifugés à 1 300 g, 4 °C. Le surnageant a été retiré. Ensuite, les paramètres biochimiques sériques [26], y compris l'aspartate aminotransférase (AST), l'alanine aminotransférase (ALT), la phosphatase alcaline (ALP), le bilirubi, la créatinine, l'acide urique et l'albumine ont été évalués à l'aide d'un analyseur automatique biochimique animal (Dri-Chem 3000 , Fuji Photo, Tokyo, Japon), qui sont des indicateurs indirects de la fonction hépatique et rénale.

Examen histopathologique

Les modifications histopathologiques des poumons, du foie et des reins ont été examinées par coloration H&E à 24 h, 48 h et 7 jours après l'injection de PEG-PCCL, de solution PEI ou de sérum physiologique (0,5 mL, 20 mg/kg) via des souris. veine de la queue. Ces organes ont été obtenus après sacrifice d'animaux. Une coupe d'histopathologie et une coloration H&E ont été réalisées comme décrit ailleurs [26]. Les changements histopathologiques ont été observés au microscope optique et ont été enregistrés avec un assortiment de caméras (Leica, Co. Ltd., Allemagne).

Concentration sanguine

La concentration sanguine de PTX a été calculée en utilisant un spectrophotomètre (LAMBDA 950, PerkinElmer, Chine). Des échantillons de sang ont été prélevés sur des souris en orbite à 0,08, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 6, 12, 24 h après le traitement. Le surnageant (100 μL) a été collecté après centrifugation à 1 300 g pendant 10 min. La concentration de PTX dans chaque échantillon de sang a été déterminée avec un spectrophotomètre à 760 nm.

Modèles et traitement des tumeurs de la souris

Suspension cellulaire H22 (0,25 mL, 4 × 10⁶ cellules/souris) a été injecté par voie intrapéritonéale à des souris Balb/C au jour 0. Lorsque l'ascite s'est formée (au jour 3 ~ 5), les souris porteuses de tumeurs ont été divisées au hasard en trois groupes (n = 5) et le traitement a été initié. Les souris ont reçu une injection de solution saline normale, PEG-PCCL/PTX (20 mg/kg) ou PTX (10 mg/kg) par voie intrapéritonéale à un volume de 0,5 mL aux jours 3 et 10 pour évaluer l'efficacité anti-tumorale. Le périmètre abdominal (PA) a été mesuré chaque jour afin de calculer le pourcentage accru de PA (IPAP) selon la formulation suivante :IPAP = (P _n − P ₀ )/P _n . Au jour 10, les souris survivantes ont été sacrifiées par dislocation cervicale, et les ascites ont été recueillies et pesées. Le temps de survie des souris a été observé jusqu'au jour 20. Des souris porteuses de tumeurs ont été exécutées au point final avec des signes de détresse, notamment une fréquence respiratoire élevée, des poils ébouriffés, une posture voûtée, une activité réduite et une formation progressive d'ascite [27]. L'activité anti-tumorale a été évaluée de manière exhaustive par les jours de survie, le périmètre abdominal et le volume d'ascite. Les souris ont été nourries dans des conditions de laboratoire standard.

Analyse statistique

L'analyse statistique a été réalisée avec SPSS 19.0 (IBM, NY, USA). Chaque traitement expérimental a été répété indépendamment pendant au moins trois fois. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD). L'analyse de la variance (ANOVA) a été utilisée pour l'analyse statistique. Le grade de chaque découverte de phlébite a été analysé par le test de somme des rangs de Wilcoxon. Le test de Dunnett a été utilisé pour comparer les interventions individuelles. La signification statistique a été indiquée à P < 0,05.

Résultats

Morphologie, diamètre et potentiel zêta du PEG-PCCL

Les résultats de l'analyseur granulométrique laser ont montré que le diamètre moyen du PEG-PCCL était de 97 ± 2,6 nm. Les résultats MET du PEG-PCCL (Fig. 2) ont révélé que le PEG-PCCL était de forme sphérique et uniforme dans la solution. Le potentiel zêta moyen du PEG-PCCL était de − 18,4 mV. La méthode de centrifugation sur mini-colonne a montré que le % EE était de 55,98 %.

La particularité du PEG-PCCL :l'image MET. Les barres d'échelle étaient de 100 nm

Cytotoxicité

La cytotoxicité du PEG-PCCL a été évaluée en comparant au PEI, un véhicule nanométrique typique, dans les lignées cellulaires HEK293T et Hep-G2. Dans la plage de concentration (de 0 à 1 mg/mL) de PEG-PCCL ou de PEI, la viabilité des cellules HEK293T (Fig. 3a) et des cellules tumorales (Hep-G2) (Fig. 3b) a diminué selon une concentration dépendante manière. Les cellules embryonnaires semblaient plus sensibles à la concentration de 0,25 mg/mL, tandis que les cellules tumorales étaient supérieures à 1 mg/mL. Par rapport au PEI, le PEG-PCCL a montré moins de cytotoxicité, en particulier à des concentrations plus élevées, c'est-à-dire 0,75 et 1 mg/mL (P = 0,023). Le test LDH a montré que le taux de mortalité dans les cellules embryonnaires et les cellules tumorales augmentait avec le temps d'exposition; (i) il était de 19 et 42 % à 24 et 48 h respectivement à 0,5 mg/mL de PEG-PCCL (Fig. 3c) inférieur à celui du PEI. (ii) Les cellules tumorales ont montré un taux de mortalité légèrement inférieur (32 %) au moment de 48 h lorsque les cellules ont été exposées au PEG-PCCL par rapport au PEI (P = 0,037) (Fig. 3d).

La cytotoxicité du PEG-PCCL par rapport au PEI. un , b Le test MTT a montré le taux de survie de 293 T et la concentration de HepG2 de manière dépendante par rapport au groupe témoin négatif (PEI). c , d Dosage de fuite de LDH de 293 T et HepG2 exposant au PEG-PCCL et au PEI après 48 h. *P < 0,05 par rapport au groupe de l'Î.-P.-É.

SEM

Les images au microscope électronique des cellules Hep-G2 intactes et des cellules traitées avec des nanoparticules de PEG-PCCL ont été montrées sur la Fig. 4. Dans les cellules Hep-G2 intactes, il y avait des microvillosités abondantes (Mv) à chaque surface, et le noyau (N) était situé plus vers les bases que la partie apicale. De nombreuses mitochondries (Mt), le complexe de Golgi (Go) et le réticulum endoplasmique rugueux (RER) ont été distribués dans le cytoplasme. Dans les cellules traitées au PEG-PCCL, les vésicules pinocytotiques étaient nettement augmentées. Aucun changement histopathologique significatif n'a été observé et les organites ronds N et cytoplasmiques, y compris Mt, RER et Go, étaient intacts.

Micrographies électroniques. un , b Cellules HepG2 normales. c , d Cellules traitées avec des nanoparticules PEG-PCCL par SEM (microscope électronique à balayage). La flèche noire pointe vers les vésicules pinocytotiques

Apoptose

Une diminution significative de la viabilité cellulaire peut être corrélée aux caractéristiques de la taille des particules, de la chimie de surface et de la concentration [28], ce qui a suscité notre intérêt pour les mécanismes sous-jacents à la mort cellulaire observée dans les cellules HepG2. Pour déterminer si la mort cellulaire était attribuée à l'apoptose ou à la nécrose, les cellules HepG2 ont été traitées avec du PEI ou du PEG-PCCL pour la co-coloration à l'Annexine V et PI. Comme observé au microscope à fluorescence (Fig. 5), les cellules traitées avec le PEI ou le PEG-PCCL ont montré une apoptose plus précoce que le groupe témoin à blanc, comme indiqué par la fluorescence verte colorée par l'annexine V. Les cellules traitées au PEI ont présenté une apoptose plus puissante que celles de PEG-PCCL, ce qui était conforme au résultat précédent du test MTT.

Le colorant FITC-Annexine V représentait l'apoptose cellulaire. Des cellules HepG2 incubées avec des nanoparticules à une concentration de 0,5 mg/mL pendant 48 h, puis co-colorées avec de l'iodure de propidium (rouge) et de l'annexine V (vert) ont été imagées à × 40

Biocompatibilité

Hémolyse

Comme les nanoparticules biocompatibles sont conçues à des fins d'applications endovasculaires, les enquêtes sur l'hémocompatibilité et la cytotoxicité endothéliale sont nécessaires. Un test in vitro a montré que, pendant les 3 h d'observation, l'hémolyse augmentait avec le temps, dans laquelle le PEG-PCCL présentait un rapport d'hémolyse inférieur à celui du sérum physiologique (Fig. 6a). Le test in vivo a révélé une tendance similaire. En revanche, le PEI a provoqué une hémolyse sévère à la fois in vitro et in vivo (Fig. 6b).

Taux d'hémolyse et nombre de cellules (× 10⁹ /L) d'échantillon de sang en 3 h. In vitro (a ) in vivo (b ) *P < 0,05 versus groupe témoin négatif

Phlébite du lapin

L'examen histopathologique (Fig. 7) a montré un endothélium vasculaire intact sans nécrose des chondrocytes dans le cartilage auriculaire. Un petit œdème de la partie proximale de la veine a été observé. En ce qui concerne la perte de cellules endothéliales veineuses et l'infiltration de cellules inflammatoires, la co-infusion (Tableau 1) des groupes traités par PEG-PCCL après 12 et 24 h avait tendance à être augmentée, mais l'amélioration n'était pas statistiquement significative ( P> 0,05).

Microphotographies de la veine de l'oreille après perfusion de 24 h colorées par H&E. un , b Groupe d'infusion avec une solution saline normale. c , d Groupe d'infusion avec PEG-PCCL. Les aiguilles représentent le cartilage auriculaire. (Image de gauche × 10, image de droite × 40)

Toxicité pour les organes

Pour évaluer la toxicité aiguë du PEG-PCCL dans les principaux organes, un examen histopathologique des poumons, du foie et des reins a été réalisé après administration intraveineuse de PEG-PCCL à 0,5 mg/mL pendant 3 jours chez la souris (n = 5). Une solution saline normale et du PEI ont été utilisés comme témoins. Les résultats ont montré que le PEI provoquait une légère inflammation et une épaisseur de l'interstitium lobulaire et une caryopycnose hépatocytaire (Fig. 8). Bien que, par rapport au groupe salin normal, aucun changement histopathologique apparent n'ait été observé dans tous les organes examinés dans le groupe traité par PEG-PCCL (Fig. 7) ; la fonction hépatorénale a été examinée pour une confirmation supplémentaire de sa non-toxicité (tableau 2).

Les images microscopiques lumineuses de coloration H&E du poumon, du foie et des reins. Les images sont recueillies à partir de souris administrées par voie intraveineuse avec NS, PEI et PEG-PCCL. Les aiguilles représentent la caryopycnose des hépatocytes. (Images des colonnes de gauche, × 10 ; images des colonnes de droite × 40)

Étude pharmacocinétique

L'étude pharmacocinétique a été réalisée après injection intraveineuse de 10 mg/kg de PTX de Taxol® ou de 20 mg/kg de PEG-PCCL/PTX (PP + PTX) (rapport de charge de 50 %). Le pic de concentration plasmatique (Cmax) était de 312 ± 2,59 μg/mL (PTX) et de 283 ± 2,79 μg/Ml (PP + PTX). Le temps de concentration maximale (Tmax) et l'aire sous la courbe concentration plasmatique-temps étaient de 0,54 ± 0,20 h, 52,00 ± 4,30 μg h/mL et 4 ± 1,22 h, 282,21 ± 21,08 μg h/mL pour la PTX et les PTX-NPs , respectivement. La courbe concentration sanguine en fonction du temps a été présentée sur la figure 9.

La courbe concentration sanguine-temps. Chez la souris après administration intraveineuse de PTX ou PP + PTX. (n = 6)

Effet du PEG-PCCL/PTX sur les souris porteuses de tumeurs

Pour étudier l'effet anti-tumoral du PEG-PCCL/PTX in vivo, (i) le pourcentage accru de périmètre abdominal (IPAP) des souris porteuses de tumeurs H22 a été calculé quotidiennement (Fig. 10a). Au jour 3, l'ascite a commencé à se former et l'IPAP de chaque groupe a considérablement augmenté, dans lequel le groupe PP/PTX et le groupe PTX, par rapport au groupe NS, ont montré une augmentation plus lente avec le temps. (ii) L'ascite a été collectée au jour 10 et le volume a été mesuré (Fig. 10b). Par rapport au groupe NS, le volume d'ascite à la fois du groupe PTX et du groupe PP/PTX était significativement réduit (P = 0,0005 et P = 0,0052), où le groupe PP/PTX présentait un volume inférieur à celui du groupe PTX (P =0,0138). (iii) la survie de chaque groupe a été observée pendant 20 jours à partir du jour 0. Le groupe PP/PTX et le groupe PTX avaient une durée de vie plus longue et un taux de survie plus élevé que le groupe NS.

L'effet anti-tumoral de PP/PTX chez les souris porteuses de tumeurs H22. un Souris Balb/C (n = 5) ont reçu une injection intrapéritonéale de PP/PTX ou de PTX au jour 3. b Ascite de chaque groupe (n = 5) ont été collectés au jour 10. c La survie de chaque groupe (n = 10) a été observé quotidiennement. *P < 0,05, ***i>P < 0,01, ****P < 0.001

Discussion

De nombreux polymères, dont le PEI, ont été suggérés comme porteurs de médicaments chimiques et biopharmaceutiques pour une conjugaison appropriée. Le PEI est un polymère cationique largement étudié et a été considéré comme l'étalon-or dans les tests concernant l'efficacité de la transfection [29]. Cependant, les effets secondaires (par exemple, la cytotoxicité) empêchent l'application du PEI à des fins médicales. Pour rechercher un matériau nano-basé plus sûr et efficace, nous avons préparé avec succès un nouveau candidat pour l'administration de médicaments ; Le PEG-PCCL se caractérise par une hydrophilie élevée et une stabilité favorable en raison de l'effet de la liaison hydrogène. L'objectif principal de l'étude était d'évaluer la toxicité in vivo et in vitro du PEG-PCCL, qui ouvre une fenêtre potentiellement thérapeutique pour le traitement du cancer.

Étant donné que l'amélioration de la perméabilité et de l'effet de rétention est considérée comme des mécanismes d'administration sélective de la tumeur, les médicaments de taille nanométrique ont fait l'objet d'une attention considérable [30, 31]. Les nanoparticules de plus petit diamètre ont une meilleure immunocompatibilité [32] et moins d'absorption par le foie, un temps de circulation sanguine plus long et une biodisponibilité plus élevée [33]. Nos dipolymères sont de tailles appropriées (97 ± 2,6 nm) (Fig. 2) pour pénétrer dans et hors du vaisseau sanguin tumoral ainsi que d'échapper au système immunitaire de l'hôte, tandis que les polymères cationiques avec le potentiel zêta positif ont été signalés comme toxiques [34]. Cette toxicité du PEG-PCCL avec un potentiel zêta négatif était censée être évitée idéalement. En effet, dans les évaluations de la toxicité de la présente étude, il y avait peu de problèmes de toxicité avec le PEG-PCCL. Des résultats similaires ont également été rapportés par d'autres laboratoires [35,36,37].

Les expériences in vitro ont révélé une propriété sans toxicité pour le PEG-PCCL. Comme observé sous SEM (Fig. 4), (i) les vésicules pinocytotiques reconnues par la flèche noire indiquaient une endocytose responsable [38]. (ii) Le noyau complet et les organites intacts (Mt, RER et Go) ont montré une faible cytotoxicité et une bonne biocompatibilité du PEG-PCCL au niveau cellulaire. Dans le test MTT et le test de fuite de LDH (Fig. 3), le PEI et le PEG-PCCL ont conduit à une tendance similaire de la viabilité cellulaire d'une manière dépendante de la dose et du temps dans les cellules 293 T et les cellules HepG2, cependant, le PEG-PCCL présentait une cytotoxicité surtout à une concentration plus élevée (P < 0,05). Ces résultats suggèrent que la liaison covalente du carboxyle n'augmente pas la toxicité supplémentaire. L'hémolyse in vitro est largement acceptée comme une méthode utile et fiable pour évaluer la compatibilité sanguine des NP. Dans le test d'hémolyse in vitro, le PEG-PCCL a montré un rapport d'hémolyse inférieur à celui du sérum physiologique (Fig. 6a). Cela peut être dû au potentiel négatif du PEG-PCCL qui protège les cellules sanguines. Le test d'hémolyse in vivo a révélé une tendance similaire. En revanche, l'Î.-P.-É. présentait une hémolyse sévère. Collectivement, les nanoparticules de PEG-PCCL sont hémocompatibles car elles n'ont présenté aucun effet hémolytique, ni in vitro ni modèle in vivo (Fig. 6b).

The innoxious nature of PEG-PCCL was further proved by in vivo experiments. Since phlebitis induced by intravenously administered antineoplastic agents [24] is frequently seen in clinical practice, we tested the inflammatory reaction after PEG-PCCL injection. In the rabbit phlebitis study (Fig. 7), little inflammatory infiltration or tissue edema was observed, indicating that the new formulation of chemotherapeutic drugs captured by PEG-PCCL is biocompatible, and that co-infusion of PEG-PCCL could be a favorable candidate as intravenous drug deliverer. Meanwhile, in the H&E staining assay (Fig. 8), no obvious histopathological changes of organs were observed in PEG-PCCL nanoparticles treatment group compared to normal group. Further hepatorenal function was investigated for safety evaluation (Table 2), in which no significant differences were shown between normal saline group and PEG-PCCL group. Consequently, it is evident that PEG-PCCL is a kind of safe and non-toxic nanoparticles with potentiality to be applied in targeting intervention.

Furthermore, preliminary evaluation of drug-loaded effect in regard of pharmacokinetics and anti-tumor was carried out in H22 tumor-bearing mice. In the pharmacokinetic study (Fig. 9), Tmax of PP + PTX was 4 ± 1.22 h, which exhibited better persistence than that of PTX (0.54 ± 0.20 h). PP + PTX also performed larger area under the plasma concentration-time curve than PTX. These results showed that PEG-PCCL/PTX lasted longer than PTX alone in blood, which indicated higher stability and more delayed release of PEG-PCCL/PTX. However, the EE% of PEG-PCCL was dissatisfactory (55.98%) and sustained drug release was less than ideal (4 ± 1.22 h). Therefore, more research is needed to modify the nanoparticle to achieve a higher EE and longer drug release. For example, adjusting the proportion of PEG and PCCL can be considered [39]. Although no metastasis was seen in abdominal organs in our model, tissue distribution and concentration of PTX-NPs should be investigated in further study to find out the possible side effects. Moreover, the combination of PEG-PCCL and PTX made an improvement in life expectancy and a reduction in tumor ascites formation (Fig. 10). Notably, the anti-tumor effect was enhanced when PTX was loaded with PEG-PCCL, suggesting a possibility of a promising drug carrier. Besides, nanoparticles may be beneficial to confront anti-tumor drug resistance. Modification with folate [40] has been reported to overcome TLR4 driven chemotherapy resistance, and its co-encapsulation of anti-tumor agents [41] could be a promising option. Nanoparticle modified by additional Fe₃ O₄ [42] may be more easily guided to its targets under the applied magnetic field, which would lower chemotherapeutic drugs-induced systemic toxicity [43].

Conclusions

PEG-PCCL nanospheres showed less cytotoxicity and better biocompatibility than mature medical nanoparticles (PEI) at the therapeutical concentration. PEG-PCCL-loaded PTX revealed higher stability and slower release in tumor mice. These results suggest that PEG-PCCL is a potential candidate of biocompatible drug vehicle for hydrophobic drugs.

Croissance de nanostructures d'or pour une absorption cellulaire sélective de forme Double fonction du périphérique V/SiOx/AlOy/p++Si comme sélecteur et mémoire

Nanomatériaux