Nanoparticules de sorafénib ciblées par hGC33 inhibent synergiquement l'hépatome via la suppression de la voie Wnt

Résumé

La délivrance d'inhibiteurs spécifiques aux tumeurs est un défi dans le traitement du cancer. Les nanoparticules modifiées par anticorps peuvent délivrer leurs médicaments chargés aux cellules tumorales qui surexpriment des antigènes associés aux tumeurs spécifiques. Ici, nous avons construit des nanoparticules polymères de polyéthylène glycol-b-PLGA chargées de sorafénib et modifiées avec l'anticorps hGC33 ciblant la glypican-3 (GPC3+), une protéine membranaire surexprimée dans le carcinome hépatocellulaire. Nous avons trouvé que les NPs modifiées par hGC33 (hGC33-SFB-NP) ciblaient les cellules de carcinome hépatocellulaire (CHC) GPC3+ en se liant spécifiquement à GPC3 à la surface des cellules de CHC, inhibaient la transduction du signal induite par Wnt, et inhibaient les cellules de CHC en phase G0/1 en régulant négativement l'expression de la cycline D1, atténuant ainsi la migration des cellules de CHC en inhibant la transition épithélial-mésenchymateuse. hGC33-SFB-NP a inhibé la migration, la progression du cycle et la prolifération des cellules de CHC en inhibant la voie Ras/Raf/MAPK et la voie Wnt en tandem avec les molécules GPC3, respectivement. hGC33-SFB-NP a inhibé la croissance du cancer du foie in vivo et amélioré le taux de survie des souris porteuses de tumeurs. Nous concluons que hGC33 augmente le ciblage des SFB-NP vers les cellules de CHC. hGC33-SFB-NP inhibe synergiquement la progression du CHC en bloquant la voie Wnt et la voie Ras/Raf/MAPK.

Introduction

La glypican-3 (GPC3) est un protéoglycane à sulfate d'héparane exprimé à la surface des cellules par un mécanisme impliquant des ancres glycérophosphatidylinositol [1]. Bien que GPC3 soit exprimé dans une variété de tissus pendant le développement, son expression est au moins partiellement inhibée dans la plupart des tissus adultes par la méthylation de l'ADN dans la région promoteur [2]. Cependant, la protéine GPC3 est surexprimée chez environ 70 % des patients atteints de carcinome hépatocellulaire (CHC) [3, 4] et stimule la transduction du signal Wnt classique [5] par interaction avec le ligand Wnt, ce qui favorise la liaison Wnt/frizzled pour promouvoir la croissance du CHC [6]. L'activation de la voie de signalisation Wnt classique est l'un des événements les plus fréquents associés à la transformation maligne du CHC [7, 8]. Basé sur la capacité de GPC3 à augmenter la signalisation Wnt, nous avons émis l'hypothèse que la surexpression de GPC3 favorise la croissance du CHC en stimulant la voie Wnt classique.

L'anticorps monoclonal thérapeutique qui reconnaît un épitope dans la portion C-terminale de GPC3 (524–563) (hGC33), qui reconnaît l'épitope C-terminal de GPC3 (524–563), inhibe la croissance tumorale dans des xénogreffes sous-cutanées de HepG2 et Huh-7 chez la souris [9, 10]. hGC33 a été humanisé par transplantation de région de décision complémentaire, et son effet anticancéreux est aussi efficace que hGC33 pour la xénotransplantation de HepG2, et hGC33 a été utilisé dans des essais cliniques [11]. Ces résultats suggèrent que hGC33 a une activité antitumorale importante, et le traitement anti-GPC3 inhibera directement la prolifération et/ou la survie des cellules de CHC en bloquant la voie Wnt et/ou d'autres voies de signalisation.

Cependant, en raison de la pathogenèse complexe du CHC, l'efficacité du blocage de GPC3 seul est limitée [12]. Par conséquent, l'exploration du mécanisme détaillé de la pathogenèse du CHC et l'identification de biomarqueurs prometteurs pour le diagnostic et le pronostic du CHC peuvent aider à fournir des cibles thérapeutiques efficaces et à améliorer le pronostic des patients. Les anticorps anti-GPC3 ont été proposés pour augmenter la sensibilité du CHC aux agents chimiothérapeutiques [13]. L'activité antitumorale de hGC33 en combinaison avec des médicaments de chimiothérapie standard a été évaluée récemment [14]. Le sorafénib est un nouveau médicament ciblé oral contre le CHC qui peut inhiber directement la prolifération des cellules tumorales en bloquant la voie de signalisation cellulaire médiée par RAF/MEK/ERK pour freiner la croissance tumorale [15, 16]. Cependant, la distribution non ciblée du sorafénib in vivo et les signaux Wnt anormalement activés dans le CHC limitent l'efficacité du médicament et augmentent ses effets secondaires [14, 15, 16]. Wnt se lie aux récepteurs de la famille Frizzled pour activer la transduction du signal intracellulaire qui régule la prolifération cellulaire, l'apoptose et la migration cellulaire, et cause la résistance aux médicaments dans de nombreuses tumeurs, comme le CHC [17, 18, 19].

Dans les modèles de xénogreffe de HepG2, la combinaison de hGC33 et de sorafénib est plus efficace pour inhiber la croissance tumorale que le sorafénib seul [15], et la délivrance de médicaments avec des nanovecteurs polymères a reçu beaucoup d'attention dans le traitement du cancer. Les nanovecteurs chargés de médicaments anticancéreux peuvent prévenir la distribution non spécifique et la dégradation non spécifique in vivo, améliorer la biodisponibilité du médicament et le ciblage antitumorale, et simplifier l'évaluation de la pharmacocinétique et du traitement [15, 16]. Dans une variété de nanoparticules à base de polymères, les formulations à base de poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) sont considérées comme des vecteurs de médicaments idéaux et sûrs [17, 18]. À cet égard, les copolymères poly(éthylène glycol)-b-poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PEG-b-PLGA) sont basés sur des copolymères de polyéthylène glycol et PLGA, qui sont sûrs et non toxiques après hydrolyse, et ont été approuvés par la Food and Drug Administration américaine [19, 20, 21, 22]. Par conséquent, l'injection intraveineuse avec un nanovecteur de copolymère PEG-b-PLGA est une stratégie prometteuse pour obtenir une délivrance ciblée et améliorer l'efficacité. De plus, l'application de l'anticorps spécifique hGC33 contre les molécules GPC3 sur la membrane des cellules de CHC peut non seulement améliorer la délivrance du nanomédicament ciblé in vitro et in vivo [18, 19], mais aussi bloquer la voie Wnt et/ou d'autres voies de signalisation connectées avec GPC3, inhiber la prolifération et/ou la survie des cellules cancéreuses, et peut réaliser une activité antitumorale synergique.

Dans cette étude, nous avons exploré si des nanoparticules de copolymère PEG-b-PLGA modifiées par l'anticorps hGC33 peuvent faciliter la délivrance de sorafénib (hGC33-SFB-NP) au CHC in vivo et in vitro, et améliorer l'efficacité du traitement du CHC par ciblage actif du CHC pour modifier la pharmacocinétique du médicament. Selon la taille des particules, le potentiel zêta, la morphologie des particules, l'efficacité d'encapsulation du médicament, la capacité de charge du médicament et la libération du médicament in vitro, le NP ciblé a été caractérisé de manière exhaustive. La capacité de ciblage in vitro est caractérisée par l'absorption cellulaire des cellules d'hépatome HepG2. La biodistribution et l'effet thérapeutique synergique de hGC33-SFB-NP sur le CHC ont été évalués en comparant le sorafénib et les SFB-NP. Nos résultats ont démontré que hGC33-SFB-NP peut cibler les cellules de CHC GPC3+. Il peut inhiber la progression du cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et l'invasion tumorale en inhibant les voies de signalisation Wnt et Ras/Raf/MAPK et inhiber synergiquement la progression du cancer du foie.

Matériaux et méthodes

Matériaux

L'anticorps hGC33, le 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide (MTT), le 4′,6-diamidino-2-phénylindole, dihydrochlorure (DAPI), le 5,5′,6,6′-tétrachloro-1,1′,3,3′-tétraéthyl-benzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1), et le diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été obtenus de Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). Le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthyl-carbodiimide et la N-hydroxysuccinimide ont été obtenus de Qiyun Biotech (Guangzhou, Chine). Le kit de quantification de protéines par acide bicinchonique (BCA), la coumarine-6, et le kit de détection d'apoptose Annexin V-FITC/PI ont été achetés chez Beyotime Biotechnology (Shanghai, Chine). Le copolymère dibloc mal-PEG-b-PLGA (mal-PEG-b-PLGA ; 25 000–30 000 Da, PLGA, LA:GA, p/p ; PEG, 13–15 %) a été acheté chez Polyscitech (West Lafayette, IN, USA). Les kits d'anticorps PI3K (9655#), p-Akt (9916#), mTOR (9964#), famille Bcl-2 (9942#), apoptose (9915#), et anticorps secondaires chèvre anti-lapin et anti-souris ont été achetés chez Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA) ; la cycline B1 et la kinase dépendante de cycline ont été achetées chez Abcam Biological Technology (USA). Les anticorps anti-phospho-Rb, cycline D1, kinase de point de contrôle 1 (CHK1), P53, gène de sensibilité au cancer du sein 1 phosphorylé (p-BRCA1), RAD51, cytochrome C, et métalloprotéinases matricielles (MMP2 et MMP9) ont été achetés chez Abcam (USA). Tous les autres produits chimiques, réactifs et solvants de grade analytique sont obtenus auprès de fournisseurs standards et ont été utilisés sans purification supplémentaire.

Cellules et animaux

La lignée cellulaire de CHC HepG2 (obtenue de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)) a été cultivée dans le milieu DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplémenté avec 10 % de SFB (HyClone, Logan, UT, USA) et 80 U/ml de pénicilline et 80 μg/ml de streptomycine dans une atmosphère humidifiée de 5 % CO₂ à 37 °C. Des souris nues BALB/C, pesant 20–22 g (5–6 semaines) ont été fournies par Nanjing Junke Biotechnology Co., Ltd. (Chine). Les souris nues BALB/C ont été élevées dans une pièce SPF. Tous les soins et traitements des animaux ont été effectués selon les exigences de soins aux animaux de l'Université des sciences et technologies d'Anhui. Tous les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université des sciences et technologies d'Anhui (Approbation n° : 2019dw013).

Préparation des NPs

Pour préparer les NPs, le mal-PEG-b-PLGA et le SFB ou la coumarine-6 ont été pesés et dissous dans la phase organique (3:2 v/v dichlorométhane/acétone). La solution a été ajoutée goutte à goutte à une solution d'alcool polyvinylique (PVA) (5 % p/v) avec vortex continu. Le mélange a été soniqué par intermittence avec un sondeur à ultrasons (puissance de sortie 550 W, 8 fois) sur glace pour créer une émulsion eau-huile. L'émulsion a été ajoutée à une solution de PVA (1 % p/v) avec agitation magnétique. Les NPs de SFB et de coumarine-6 ont été collectées par centrifugation à 8000 tr/min pendant 30 min et lavées trois fois dans de l'eau Milli-Q.

Pour générer hGC33-NP par des liaisons thioéther formées par la réaction du maléimide avec les résidus sulfhydryles libres dans l'anticorps hGC33, l'anticorps hGC33 a été mélangé avec des NPs fonctionnalisées au maléimide à un rapport molaire de 5:1 (hGC33 : mal-PEG-b-PLGA) et incubé à 4 °C pendant 16 h avec agitation continue. hGC33 a été conjugué aux NPs par la réaction des groupes sulfhydryles sur l'anticorps hGC33 avec les groupes maléimide des chaînes PEG. Les anticorps non conjugués ont été éliminés par passage à travers des colonnes Sepharose CL-4B. La conjugaison efficace des protéines a été confirmée avec un kit BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Caractérisation des nanoparticules (NPs)

Morphologie, taille des particules, efficacité d'encapsulation (EE) et stabilité des NPs

La morphologie des NPs a été évaluée par microscopie électronique à transmission (MET, H-600 ; Hitachi, Tokyo, Japon). Les NPs sans médicament hGC33-NP et NPs sans médicament ont été enregistrées par spectrophotomètre FTIR (Thermo Nicolet, Madison, WI, USA) en utilisant du bromure de potassium. La taille moyenne des particules et le potentiel zêta des NPs ont été caractérisés avec un Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) à 20 °C. L'efficacité d'encapsulation du médicament (EE) et la teneur en charge du médicament (LC) ont été évaluées par ultrafiltration. Les échantillons ont été chargés dans un dispositif d'ultrafiltration (100 kMWCO ; Sartorius, Göttingen, Allemagne) et centrifugés à 8000 tr/min pendant 25 min à 4 °C pour éliminer le médicament libre. Le même volume de chaque échantillon a été dissous dans l'acétonitrile pour confirmer la quantité totale de médicament. La concentration a été mesurée par chromatographie liquide à haute performance. La longueur d'onde d'absorption était de 266 nm. La formule suivante a été utilisée pour calculer l'EE (%) des NPs : (poids du médicament encapsulé / poids total du médicament) × 100 %. Le LC (%) a été calculé comme (poids du médicament encapsulé / poids des NPs) × 100 %. Pour comprendre la stabilité des NPs à température ambiante, le changement de taille des NPs a été évalué par diffusion dynamique de la lumière (DDL) à des points de temps prédéterminés (0,5, 1, 2, 4, 8, 12 h, 16 h, 20 h et 24 h) à 25 °C.

Libération du médicament in vitro et test d'absorption cellulaire

Le médicament des NPs a été étudié en utilisant des sacs de dialyse avec un seuil de poids moléculaire de 10 kDa. Brièvement, 1 mL de NPs a été chargé dans un sac de dialyse (MWCO 8 000–10 000 Da ; Spectrum Labs Inc., CA, USA). Les sacs de dialyse ont été immergés dans du PBS et agités avec un agitateur magnétique à 25 °C. Les profils de libération du médicament des NPs ont été mesurés dans 100 mL de tampon phosphate salin (PBS ; pH = 7,4) à 0,2 M pendant 7 jours. La concentration du médicament dans les échantillons a été mesurée par chromatographie liquide à haute performance. Dans les études subséquentes, hGC33-coumarine 6-NP ayant la même taille de particule que hGC33-SFB-NP a été utilisé pour évaluer le ciblage de hGC33-SFB-NP. Les cellules HepG2 (GPC3+) et Li-7 (GPC3−) ont été incubées avec hGC33-coumarine 6-NP pendant 0,5, 2 ou 4 h à 37 °C en 5 % CO₂, respectivement. Les cellules co-cultivées ont été lavées et fixées avec 4 % de formaldéhyde pendant 10 min ; les noyaux cellulaires ont été colorés avec 5 μg/mL de Hoechst 33 342 pendant 15 min pour localiser les NPs intracellulaires. La microscopie confocale pour analyser les images des nanoparticules intracellulaires a été analysée par microscopie confocale (Olympus FV1000 ; Olympus Corporation, Tokyo, Japon).

Effet cellulaire in vitro

La cytotoxicité de hGC33 libre (Ac), SFB libre, hGC33-null-NP, ou hGC33-SFB-NP a été déterminée en utilisant un test MTT. Les cellules HepG2 (GPC3+) et Li-7 (GPC3−) en phase logarithmique ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 4000 cellules par puits suivie d'une incubation pendant 48 h à 37 °C en 5 % CO₂. Les cellules ont été traitées avec hGC33, SFB libre, hGC33-null-NP, ou hGC33-SFB-NP pendant 48 h à 37 °C en 5 % CO₂. Après co-culture pendant un temps défini, l'activité anti-prolifération cellulaire a été déterminée par test MTT comme décrit [20]. L'absorbance de chaque puits a été mesurée à 490 nm et la concentration inhibitrice maximale 50 (IC50) a été calculée avec SPSS 17.0.

Mesure de la capacité d'invasion cellulaire

Les cellules en phase de croissance logarithmique ont été ensemencées sur des plaques à 6 puits à une densité de 5 × 10⁴ cellules/puits, griffées avec une pointe d'aspiration, et remplacées par un milieu de culture sans sérum. La guérison de la griffure a été enregistrée à 0 h, 24 h et 48 h dans le groupe témoin et le groupe expérimental. Au même moment, le même nombre de cellules a été inoculé dans des chambres Transwell et traité avec hGC33 libre, SFB libre, hGC33-null-NP, ou hGC33-SFB-NP. Cinq cents microlitres de milieu à 10 % SFB ont été ajoutés dans la chambre inférieure. Après incubation pendant 24 h, la chambre Transwell a été retirée, et les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde, et colorées avec 0,1 % de violet de cristal. La taille de la guérison de la griffure et le nombre de cellules migrées ont été calculés pour évaluer la capacité de migration.

Détermination du cycle cellulaire

Après incubation pendant la nuit dans des plaques à 6 puits, les cellules ont été traitées avec hGC33 libre (Ac), SFB libre, hGC33-null-NP, ou hGC33-SFB-NP pendant 24 h, puis collectées et fixées avec de l'éthanol. Après coloration avec l'iodure de propidium, la cytométrie de flux a été réalisée, et le cycle cellulaire a été analysé avec modifit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME).

Western Blot

Pour évaluer le statut d'activation de la voie de signalisation et l'expression des molécules cibles, les cellules ont été incubées pendant la nuit dans des plaques à 6 puits, et hGC33 libre, SFB libre, hGC33-null-NP, ou hGC33-SFB-NP ont été appliqués pendant 24 h. Les cellules de chaque groupe de traitement ont été collectées, et la protéine a été extraite et mesurée. La concentration en protéines a été mesurée et calibrée avec un kit de protéines BCA (Biosharp, Hefei, Chine). La protéine des échantillons a été séparée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à dodécylsulfate, transférée sur une membrane PVDF, et bloquée avec du lait écrémé. Le premier anticorps (dilué 1:1000) a été incubé pendant la nuit à 4 °C, et les anticorps secondaires (1:2000) ont été incubés pendant 1 h à température ambiante. Les bandes ont été visualisées avec des substrats ECL (Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA), et les images ont été affichées par un système d'analyse d'image de gel, et β-actine a été utilisée comme contrôle.

Activité antitumorale in vivo

L'inhibition de hGC33 libre, SFB libre, hGC33-null-NP, SFB-NP, et hGC33-SFB-NP sur la croissance du CHC in vivo a été déterminée. Selon les règlements et directives sur la santé animale du comité d'éthique de l'Université d'Anhui, toutes les expériences ont été conduites chez des souris BALB/c en cages dans une pièce à température contrôlée (23 ± 2 °C) avec un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h. Une suspension de 50 μl contenant 5 × 10⁶ cellules HepG2 vivantes a été injectée sous-cutanément dans l'abdomen droit de souris BALB/c femelles de 5 semaines (20–22 g). Lorsque le volume de la tumeur a atteint environ 50 mm³, les souris ont été aléatoirement divisées en 6 groupes (10 souris par groupe). Le témoin salin normal NS (200 mg/kg NP nul dans 200 μL PBS), hGC33-null-NP (hGC33-null-NP dans 200 μL PBS, équivalent à hgc33 = 100 μg/kg/fois), hGC33 libre (hGC33 dans 200 μL PBS, 100 μg/kg/fois), SFB libre (dose SFB : 8 mg/kg/fois), SFB-NP (dose SFB : 8 mg/kg/fois), et hGC33-SFB-NP (équivalent à SFB = 8 mg/kg/fois, hGC33 = 100 μg/kg/fois) ont été injectés par voie veineuse caudale tous les 2 jours pendant 10 fois. Le poids et la taille de la tumeur des souris ont été mesurés tous les quatre jours. La formule de calcul du volume de la tumeur était volume = 0,5 × L × W², où L et W représentent la longueur et la largeur de la tumeur, respectivement. Quatre semaines après l'administration, les animaux ont été anesthésiés avec de l'éther diéthylique, et la taille et le poids de la tumeur ont été mesurés. De plus, la tumeur, le cœur, le foie, le rein, le poumon et la rate ont été prélevés, fixés avec une solution de paraformaldéhyde à 4 %, inclus dans de la paraffine, coupés en sections, et colorés avec l'hématoxyline et l'éosine pour évaluer les changements histologiques par microscopie numérique.

Analyse statistique

Les données sont présentées comme la moyenne ± écart-type (ET) et ont été évaluées par analyse de variance avec SPSS 18.0. Les comparaisons statistiques par paires ont été effectuées en utilisant un test t de Student bilatéral. Les différences étaient considérées comme statistiquement significatives pour P < 0,05.

Résultats

Caractérisation des NPs et libération du médicament in vitro

Puisque le diamètre et les propriétés de surface des NPs affectent l'absorption cellulaire, la libération du médicament et la distribution des NPs in vivo, nous avons caractérisé les NPs préparées avec les paramètres correspondants. La morphologie, la taille des particules et la distribution de taille des polymères SFB-NP, hGC33-null-NP et hGC33-SFB-NP sont résumées dans la Fig. 1. La morphologie de hGC33-SFB-NP observée par microscope électronique à transmission (Fig. 1a) montre des noyaux rigides avec des bords flous, ce qui indique que hGC33 est présent à la surface des NPs. Les tailles des particules de SFB NP, hGC33-null-NP et hGC33-SFB-NP variaient de 100 à 150 nm et avaient une distribution de taille de particule unimodale typique. Le diamètre moyen de hGC33-SFB-NP (120,2 ± 10,2 nm) était légèrement plus grand que celui de hGC33-null-NP, SFB-NP et NP nul (Fig. 1a, Tableau 1). De fins films sphériques flous avec une seule surface étaient présents à la surface de hGC33-SFB-NP et hGC33-null-NP, ce qui indiquait que l'anticorps hGC33 était présent à la surface des NPs. La taille accrue pour hGC33-SFB-NP et hGC33-null-NP confirmait l'existence du film hGC33. La synthèse de hGC33-SFB-NP a été confirmée par ¹H-RMN (Fig. 1b) avant la préparation des NPs. Les pics à 5,2 ppm et 1,58 ppm étaient attribués aux protons -CH3 de l'acide lactique ; le pic à 4,8 ppm était attribué aux -OCH2- de l'acide glycolique ; et le pic à 3,6–3,8 ppm était attribué aux protons -CH2CH2O- des unités de répétition PEG. La chimie de surface de PEG-b-PLGA et des NPs Ab-PEG-b-PLGA a également été étudiée par spectroscopie FTIR (Fig. 1c). Dans le spectre du polymère PEG-b-PLGA, une bande forte à environ 1750 cm⁻¹ provenait de l'étirement des groupes carbonyl (C=O) dans la chaîne PLGA. Une bande à 2880 cm⁻¹ était due à l'étirement d'un groupe –CH dans la chaîne PEG. Au même moment, un pic apparaissait à 2520 cm⁻¹ que nous attribuions au pic d'étirement -SH de l'anticorps hGC33. Les résultats de ¹H RMN et FTIR indiquaient que l'anticorps était greffé sur la chaîne principale des polymères PEG-b-PLGA.

Caractérisation des NPs. a Caractérisation MET des NPs, la barre d'échelle indique 100 nm ; b les spectres ¹H RMN du hGC33-PLGA-b-PEG synthétique dans CDCl3 ; c spectres FTIR de hGC33-PEG-b-PLGA et PEG-b-PLGA ; d profils de libération cumulative de SFB-NP et hGC33-SFB-NP dans PBS (pH = 7,4) à 37 °C ; e changements de taille des NPs incubées dans le milieu DMEM contenant 10 % SFB sur 14 j ; f changements de taille des NPs incubées dans PBS sur 14 j. SFB, sorafénib ; MET, microscopie électronique à transmission ; NPs, nanoparticules ; ¹H RMN, spectroscopie de résonance magnétique nucléaire ¹H ; FTIR, spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier.

Expression de GPC3 et absorption de hGC33-coumarine6-NP dans les cellules Li-7 et HepG2. Les cellules, inoculées dans la plaque de culture, ont été lavées avec PBS et incubées avec 100 μg/ml hGC33-coumarine6-NP dans DMEM pendant 2, 4 et 8 h. Les noyaux ont été colorés avec DAPI, et les cellules ont été fixées et détectées par microscopie confocale à balayage laser. GPC3 n'a pas été détecté dans les cellules Li-7, mais était hautement exprimé dans les cellules HepG2 comme détecté par immunocytochimie. La barre d'échelle indique 50 μm.

Fait intéressant, les nanoparticules hGC33-SFB-NP et SFB-NP dans le milieu DMEM contenant 10 % SFB (pH = 7,4) avaient une libération rapide du médicament jusqu'à environ 4 jours, puis une libération relativement lente et stable ; la libération cumulative de SFB de hGC33-SFB-NP et SFB-NP sur 20 jours était d'environ 77 % et 65 % respectivement (Fig. 1d). La différence peut être due à la molécule hydrophile à la surface de la matrice PEG-b-PLGA, qui peut accélérer la dégradation des nanoparticules en augmentant l'hydratation et en favorisant ainsi l'hydrolyse. Pour déterminer la stabilité des NPs préparées, les hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP et SFB-NP ont été placées dans le milieu DMEM contenant 10 % SFB (pH = 7,4) et dans PBS (pH = 7,4). Les tailles des diverses NPs sont restées stables pendant plus de 2 semaines. Le SFB a été libéré de hGC33-SFB-NP de manière soutenue et stable pendant 14 jours, mais il y a eu un changement modeste de la taille des particules dans le milieu DMEM par rapport à celui dans 10 % SFB (Fig. 1e, f). La stabilité de hGC33-SFB-NP serait appropriée pour le SFB ayant un rôle biologique soutenu.

Un grand potentiel zêta peut provoquer une forte interaction répulsive électrostatique entre NP et maintenir la stabilité du système de dispersion des NPs [23, 24]. Comme montré dans le Tableau 1, les potentiels zêta de hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP et SFB-NP sont −18,2 ± 2,2 mV, −18,5 ± 1,8 mV et −15,9 ± 2,1 mV respectivement, ce qui peut être causé par les charges négatives générées par le groupe aldéhyde, le groupe carboxyle et le groupe phosphate dans la glycoprotéine anticorps hGC33. Les NPs chargées négativement peuvent conduire à une haute stabilité de la suspension de NPs. De plus, comme la surface des cellules est chargée négativement dans les environnements physiologiques normaux, les NPs préparées repoussent les cellules à faible charge et sont moins toxiques pour les tissus et les cellules. En outre, la distribution de taille de null-NP et SFB-NP (indice de polydispersité [IPD] 0,18 et 0,19 respectivement) était légèrement mais non significativement plus petite que celle de hGC33-null-NP (IPD = 0,21) et hGC33-SFB-NP (IPD = 0,23). Ainsi, la taille des nanoparticules a une bonne uniformité. La taille des particules, la distribution de taille des particules et le potentiel zêta des NPs sont montrés dans le Tableau 1 selon les résultats de l'efficacité d'encapsulation de SFB et de la teneur en charge. L'anticorps hGC33 GPC3 non conjugué a été éliminé par ultracentrifugation, et l'efficacité de liaison de l'anticorps hGC33 aux NPs a été évaluée. L'analyse de protéines BCA a montré que l'efficacité de liaison de l'anticorps hGC33 aux NPs était de 79,5 % ± 2,9 %.

hGC33-Coumarine 6-NP cible efficacement les cellules de la lignée CHC HepG2 GPC3+

Pour savoir si l'anticorps hGC33 des nanoparticules a toujours la capacité de cibler spécifiquement GPC3, nous avons utilisé les cellules HepG2 GPC3+ et Li-7 GPC3− comme cellules cibles et hGC33-coumarine 6-NP comme nanoparticules traceuses, et incubé les différentes cellules pendant 2 h, 4 h et 8 h. Les cellules ont été lavées avec PBS 3 fois et réagies avec DAPI pour colorer le noyau. Les cellules ont été fixées et photographiées avec un microscope à fluorescence Leica (DMi8, Allemagne). Il a été trouvé que la fluorescence verte dans les cellules HepG2 était significativement plus élevée que celle dans les cellules Li-7 au même temps d'incubation (Fig. 2), indiquant que la quantité de hGC33-coumarine 6-NP entrant dans les cellules HepG2 était significativement plus élevée que dans les cellules Li-7. Les résultats ont documenté que l'anticorps hGC33 sur hGC33-Coumarine6-NP avait toujours la capacité de cibler GPC3 et de médier l'internalisation des nanoparticules. L'expression de GPC3 dans les cellules HepG2 et Li-7 a été examinée avec la fluorescence indirecte et la coloration cytchimique. Les résultats ont montré que les cellules HepG2 surexprimaient GPC3, tandis que les cellules Li-7 n'exprimaient pas GPC3 (Fig. 2).

hGC33-Null-NP inhibe la prolifération des cellules HepG2

Pour déterminer si les NPs modifiées par hGC33 (hGC33-null-NP) pouvaient inhiber la croissance du CHC, nous avons mesuré l'inhibition de la croissance cellulaire de la lignée cellulaire de CHC GPC3 positive HepG2 et de la lignée cellulaire GPC3 négative Li-7. Nous avons trouvé que tanto hGC33-null-NP que hGC33 inhibaient la croissance de la lignée cellulaire de CHC GPC3 positive HepG2 après 24 h de traitement, mais hGC33 avait un effet inhibiteur plus significatif sur les cellules HepG2 que hGC33-null-NP (Fig. 3a) ; en revanche, hGC33-null-NP et hGC33 n'affectaient pas la croissance de la lignée cellulaire GPC3 négative Li-7 (Fig. 3b). Le cours temporel représentatif de hGC33-null-NP (équivalent à 0,1 μM hgc33) et hGC33 (0,1 μM) sur la prolifération des cellules HepG2 est illustré dans la Fig. 3c. Parce que hGC33 est un peptide C-terminal qui reconnaît GPC3, hGC33 est supérieur à hGC33-null-NP pour inhiber HepG2. Les résultats suggèrent que la molécule hGC33 dans hGC33-null-NP peut avoir un effet de blocage spatial, ce qui peut affecter la capacité de liaison de hGC33 aux épitopes.

La prolifération des cellules HepG2 et Li-7 a été inhibée par hGC33, null-NP, et hGC33-null-NP. a Le test de prolifération cellulaire a été effectué sur les cellules HepG2 GPC3 positives traitées avec hGC33, null-NP ou hGC33-null-NP ; b les tests de prolifération cellulaire ont été conduits sur les cellules Li-7 GPC3 négatives traitées avec hGC33, null-NP, et hGC33-null-NP. Les cellules ont été incubées avec 0–2,5 μM hGC33, null-NP, ou hGC33-null-NP pendant 1 jour. La prolifération des cellules a été mesurée avec la méthode MTT et standardisée comme cellules non traitées. Toutes les valeurs représentent la moyenne ± ET. Comparé au groupe témoin (0 μM) sans traitement par anticorps, *P < 0,01 ; c les résultats représentatifs de la réponse des cellules HepG2 à hGC33, null-NP, et hGC33-null-NP dans le traitement hGC33 (1,0 μM).

hGC33-Null-NP inhibe le cycle cellulaire des cellules HepG2

Pour comprendre le mécanisme de l'activité moléculaire de l'anticorps hGC33 modifié sur les nanoparticules hGC33-null-NP, nous avons étudié la progression du cycle cellulaire des cellules HepG2 traitées avec hGC33-null-NP. Dans la lignée cellulaire HepG2, hGC33-null-NP et hGC33 ont significativement augmenté la proportion de cellules en phase G1 (Fig. 4a, b), indiquant que tanto hGC33-null-NP que hGC33 pouvaient induire un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. De plus, hGC33-null-NP et hGC33 pouvaient significativement réguler négativement l'expression de cycline D1 dans les cellules HepG2 (Fig. 4c, d).

hGC33-null-NP et hGC33 induisent l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et inhibent l'expression de cycline D1 dans les cellules HepG2. a Diagramme représentatif du cycle cellulaire des divers groupes traités avec hGC33-null-NP et hGC33. b Analyse du cycle cellulaire des divers groupes traités avec hGC33-null-NP et hGC33. Les cellules de CHC ont été incubées avec 0,5 μM hGC33 ou hGC33-null-NP (avec la concentration molaire de hGC33 comme référence). *P < 0,05, la phase G1 de hGC33-null-NP ou hGC33 cellules était comparée à celle des cellules à 0 h. c, d Après traitement par hGC33-null-NP ou hGC33, la cycline D1 était significativement régulée négativement dans les cellules HepG2 comparée à celle du groupe témoin.

Activation de Wnt dans les cellules HepG2, Huh-7 et Li-7

Pour comprendre l'activation du signal Wnt/β-Catenin classique dans les cellules de CHC, nous avons d'abord détecté l'expression du ligand Wnt et de la protéine récepteur crimp (frizzled, FZD ou Frz) dans diverses lignées cellulaires de CHC : HepG2 (GPC3++), Huh-7 (GPC+), et Li-7 (GPC3−). Les résultats ont montré que Wnt3a et le récepteur FZD de transduction de la voie β-Catenin étaient exprimés dans toutes les lignées cellulaires, surtout dans les cellules HepG2 et Huh-7 (Fig. 5).

Expression de Wnt3a, FZD1 et FZD3 dans les lignées cellulaires de CHC.

hGC33-Null-NP inhibe la prolifération cellulaire dépendante de la transduction du signal Wnt induite par Wnt3a

Certaines études ont montré que la partie extracellulaire de GPC3 peut être un co-récepteur de Wnt, qui favorise l'activation et la transduction du signal Wnt/β-Catenin. Par conséquent, lorsque les cellules HepG2 (GPC3+), Huh-7 (GPC3+) et Li-7 (GPC3−) ont été co-incubées avec hGC33 et hGC33-null-NP, l'activation du signal Wnt/β-catenin a été bloquée par hGC33 et hGC33-null-NP, et la prolifération des cellules HepG2 et Huh-7, mais pas Li-7, dans le milieu conditionné par Wnt3a a été inhibée. Cette prolifération des cellules Li-7 est très probablement due à l'absence de GPC3 à la surface des cellules Li-7 (Fig. 6). Nos résultats indiquent que hGC33 et hGC33-null-NP se lient spécifiquement aux molécules GPC3 sur la membrane cellulaire. hGC33 et hGC33-null-NP neutralisent partiellement l'activité mitogénique de Wnt3a et inhibent la voie de signalisation Wnt/β-catenin. Cependant, l'inhibition de la prolifération par les nanoparticules hGC33-null-NP était moindre que celle de hGC33. Peut-être que la structure spatiale des nanoparticules interfère avec hGC33-null-NP et limite la fonction de la molécule hGC33 sur les nanoparticules de sorte qu'elles ne peuvent pas bloquer complètement l'interaction entre GPC3 et Wnt3a.

Transduction du signal Wnt activée par GPC3 dans le CHC. Un milieu DMEM à 50 % Wnt3a a été additionné d'anticorps anti-Wnt3a, hGC33, ou hGC33-null-NP. Les cellules HepG2 (GPC3++), Huh-7 (GPC3+) et Li-7 (GPC3−) ont été co-incubées pendant 48 h, et la prolifération cellulaire a été mesurée par test MTT. Les données étaient exprimées comme moyenne ± ET (*P < 0,01).

hGC33-Null-NP inhibe la transduction du signal induite par Wnt3a dans les cellules HepG2 et Huh-7

Pour comprendre l'effet de hGC33-null-NP sur la signalisation Wnt/β-catenin dans les cellules de CHC, nous avons extrait les protéines des cellules HepG2 et Huh-7 traitées avec hGC33 ou hGC33-null-NP. Les résultats du Western blot ont montré qu'après traitement par hGC33-null-NP, les niveaux de pYAP et pβ-catenin étaient augmentés, mais les niveaux de YAP et β-catenin étaient diminués. De plus, les niveaux de cycline D1, CD44, VEGF et c-MYC dans le groupe hGC33-null-NP étaient plus bas que ceux du groupe témoin, mais le niveau était moindre qu'avec le traitement par hGC33. Des effets similaires ont été observés dans les cellules HepG2 et Huh-7, comme montré dans la Fig. 7.

Inhibition de la signalisation β-catenin induite par Wnt3a par hGC33-null-NP ou hGC33. a Comparé au groupe témoin, la voie de signalisation Wnt/β-catenin dans les cellules HepG2 et Huh-7 traitées avec hGC33-null-NP ou hGC33 était inhibée, et les niveaux de β-catenin et YAP étaient diminués, tandis que les molécules β-catenin phosphorylé et YAP phosphorylé augmentées étaient instables et dégradées dans le cytoplasme. La β-catenin diminuée était difficile à maintenir dans le noyau et à conduire l'expression de Cycline D1, CD44, VEGF et c-MYC, ce qui a entraîné la diminution des niveaux de protéines cycline D1, CD44, VEGF et c-myc. b Le motif de mécanisme de la voie de signalisation Wnt/β-catenin inhibée par hGC33-null-NP ou hGC33.

hGC33-SFB-NP ou hGC33 atténue la migration des cellules de CHC en inhibant la transition épithélial-mésenchymateuse (TEM)

Le CHC est l'un des cancers les plus mortels au monde, et son incidence augmente régulièrement. Le sorafénib est le seul traitement standard approuvé pour les patients atteints de CHC avancé, car il a été montré qu'il améliore le taux de survie de ces patients. Cependant, les observations cliniques et précliniques suggèrent que la thérapie au sorafénib a une efficacité limitée en raison du développement rapide de la résistance aux médicaments. Par conséquent, élucider le mécanisme de résistance d'échappement au sorafénib est un point majeur dans la recherche sur le CHC. Ces dernières années, de plus en plus d'attention a été portée au rôle de la transition épithélial-mésenchymateuse (TEM) dans la progression du CHC et le développement de la résistance aux médicaments. La TEM fait référence à la transformation de cellules épithéliales en cellules mésenchymateuses, ce qui confère aux cellules la capacité de métastaser et d'envahir, incluant l'acquisition de caractéristiques de cellules souches, la réduction de l'apoptose et du vieillissement, la promotion de l'immunosuppression, et la participation à l'occurrence et au développement du cancer. La perte d'expression de l'E-cadhérine est considérée comme une étape clé dans la carcinogenèse et la TEM. La TEM est un processus de reprogrammation moléculaire et cellulaire multi-étapes du développement que les cellules cancéreuses utilisent pour atteindre l'agressivité. Cela se fait principalement par la régulation négative de l'expression de l'E-cadhérine, la kératine, la mucine, ZO-1 (protéine de jonction serrée) ; la régulation positive de l'expression de la vimentine, l'actine lisse alpha (α-SMA), la fibronectine FN, les MMPs (matrice de dégradation), la N-cadhérine, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, collagène type I et type II pour atteindre l'invasion, la métastase et l'anti-apoptose caractéristiques de la tumeur TEM. Les changements de ces expressions de protéines impliquent principalement l'activation des voies de signalisation Wnt/β-catenin et Ras/Raf/MAPK.

Nos expériences ont montré que l'anticorps hGC33 à la surface du vecteur NP peut inhiber la transduction du signal β-catenin induite par Wnt3a, et puis réguler négativement l'expression de β-cathénine, CD44, facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), cycline D1 et c-MYC. De plus, hGC33-SFB-NP inhibe l'activation de la voie de signalisation Ras/Raf/MAPK et inhibe la prolifération et l'apoptose des cellules de CHC. hGC33 et SFB ont un effet synergique, inhibant la TEM et diminuant la migration des cellules de CHC (Fig. 8).

Effet de hGC33-SFB-NP sur l'inhibition de la TEM. a Comparé au groupe témoin, le groupe de traitement hGC33-SFB-NP avait moins de migration cellulaire. Les photographies ont été prises sous un microscope optique (grossissement, ×200). La valeur d'erreur représente l'écart-type de trois expériences indépendantes. *Comparé au groupe témoin, p < 0,01. b Comparé au groupe témoin, les protéines liées à la TEM snail, vimentine et MMP-2 dans les CHC traitées avec hGC33-SFB-NP diminuaient, tandis que l'E-cadhérine augmentait. c Mécanisme moléculaire de la TEM. TEM, transition épithélial-mésenchymateuse ; MMP-2, métalloprotéinase matricielle-2 ; SFB, sorafénib ; NP, nanoparticule.

hGC33-SFB-NP inhibe la croissance du carcinome hépatocellulaire in vivo et améliore le taux de survie des souris porteuses de tumeurs

Pour évaluer l'activité antitumorale de hGC33-SFB-NP in vivo, les cellules HepG2 et Huh-7 ont été inoculées sous-cutanément dans l'abdomen droit et le côté dorsal de souris nues BALB/c femelles, respectivement. Lorsque la croissance de la xénogreffe tumorale a atteint environ 30 mm³, les souris ont été aléatoirement divisées en groupes pour évaluer davantage l'inhibition de chaque groupe (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, hGC33 libre, SFB libre, et groupe témoin) sur l'effet CHC (n = 5 par groupe). On peut voir sur la Fig. 9a, b que hGC33-SFB-NP ralentissait significativement la croissance tumorale chez les souris comparé au témoin PBS et aux autres traitements. Comparé au témoin PBS, hGC33-null-NP, SFB-NP, hGC33 libre et SFB libre avaient aussi une certaine inhibition du CHC, ce qui est dû au fait que hGC33 libre et SFB libre inhibent directement la voie Wnt et Ras/Raf/MAPK respectivement. De telles voies peuvent inhiber la prolifération des cellules de CHC dans une certaine mesure. Bien que le hGC33 modifié par nanoparticules (hGC33-null-NP) soit connecté à la surface nano par des liaisons chimiques, cela n'a pas affecté le ciblage de hGC33 des molécules GPC3 et l'inhibition de l'activité Wnt. Le SFB chargé par nanoparticules (SFB-NP), après avoir été endocytosé par les cellules, a été dégradé pour libérer le SFB du copolymère pour inhiber la croissance du CHC. En tout, l'effet inhibiteur de hGC33-SFB-NP sur les greffes de cellules HepG2 était, comme prévu, plus important que sur les greffes de cellules Huh-7, probablement parce que HepG2 exprime les molécules GPC3.

L'effet de hGC33-SFB-NP sur la xénogreffe de CHC chez les souris nues et les changements de poids des souris. Les cellules de cancer du foie ont été inoculées sous-cutanément sur le dos de chaque souris nue (n = 10). Après 10 jours, les souris porteuses de tumeurs ont été traitées avec PBS (témoin), hGC33 libre, SFB libre, hGC33-null-NP, SFB-NP et hGC33-SFB-NP. La taille de la tumeur (a, b) et le poids corporel (c, d) des souris ont été surveillés à des points de temps désignés.

Le poids corporel des souris nues dans chaque groupe de traitement a également été mesuré, comme montré dans la Fig. 9c, d. Le poids corporel du groupe témoin diminuait progressivement. Le poids des souris dans les groupes de traitement hGC33 libre, SFB libre, SFB-NP et hGC33-null-NP diminuait aussi progressivement et pas significativement moins que dans le groupe témoin. Cependant, le poids des souris nues portant des cellules HepG2 et Huh-7 traitées avec hGC33-SFB-NP ne diminuait que légèrement, et le poids restait relativement stable pendant le cycle de traitement. Ces résultats soutiennent que le nouveau nanomédicament hGC33-SFB-NP n'a pas de toxicité significative chez les souris nues, et le SFB chargé sur le nanovecteur et le hGC33 modifié en surface peuvent produire un effet antitumorale additif ou même synergique.

Discussion

Pour examiner la pertinence de hGC33-SFB-NP pour la thérapie ciblée du CHC, nous avons testé les conjugués modèles pour leur capacité à se lier à la glypican-3 humaine sur les cellules de CHC in vitro ; à inhiber la prolifération, la migration et la transduction du signal Wnt/β-catenin des cellules de CHC glypican-3 positives ; et inhiber le CHC qui surexprime la glypican-3 in vivo.

Pour lier de manière covalente l'anticorps hGC33 spécifique de GPC3 avec les nanoparticules mal-PEG-b-PLGA, nous avons réticulé le groupe sulfhydryle libre dans le segment Fc de hGC33 avec le PEG-b-PLGA fonctionnalisé au maléimide (mal-PEG-b-PLGA) en formant des liaisons thioéther stables. La conjugaison est une condition préalable au ciblage du CHC GPC3 positif. Une série d'expériences, incluant les changements de diamètre des nanoparticules et de potentiel zêta détectés par lentille et l'absorption intracellulaire de hGC33-SFB-NP, a vérifié le ciblage de hGC33-SFB-NP vers les cellules HepG2 (GPC3+). Ces résultats indiquaient que l'activité de liaison de l'anticorps hGC33 n'était pas altérée par la conjugaison.

Nous avons directement détecté l'effet phagocytaire des cellules HepG2 GPC3+ et Li-7 GPC3− sur les NPs PEG-b-PLGA modifiées en surface par hGC33 par microscopie confocale. Après que les cellules HepG2 et Li-7 ont été co-cultivées avec hGC33-coumarine 6-NP, l'intensité du signal vert dans les cellules HepG2 était significativement plus élevée que dans les cellules Li-7, indiquant qu'il y avait plus de nanoparticules dans les cellules HepG2. Cette découverte est cohérente avec l'anticorps hGC33 modifié à la surface des NPs PEG-b-PLGA se liant spécifiquement à la glypican-3 à la surface des cellules de CHC et étant internalisé. L'efficacité de l'internalisation des NPs modifiées par hGC33 dépend du niveau d'expression de l'antigène GPC3 à la surface cellulaire.

Nous avons utilisé le test MTT standard pour mesurer l'efficacité de l'inhibition de la prolifération des cellules d'hépatome. Tanto hGC33-null-NP que hGC33 inhibaient la croissance de la lignée cellulaire de CHC GPC3 positive HepG2, mais hGC33-null-NP et hGC33 n'affectaient pas la prolifération des cellules Li-7 GPC3 négatives (Fig. 3b). Au niveau animal, hGC33-null-NP ou hGC33 seul inhibait la croissance des xénogreffes de Huh-7 et HepG2 dans une certaine mesure, tandis que hGC33-SFB-NP causait l'arrêt de la croissance des xénogreffes d'hépatome Huh-7 et HepG2 chez les souris. La découverte que hGC33-null-NP inhibait significativement les cellules d'hépatome GPC3 positives a montré que l'effet inhibiteur des NPs PEG-b-PLGA modifiées en surface par hGC33 sur la prolifération des cellules de CHC dépend de l'expression de l'antigène GPC3 à la surface cellulaire.

GPC3 régule de nombreuses voies dans la pathogenèse du CHC, incluant la signalisation Wnt et YAP [25, 26, 27]. GPC3 interagit avec le ligand Wnt et peut être un co-récepteur pour Wnt et faciliter la liaison Wnt/Frizzled pour la croissance du CHC [28, 29]. Nous avons examiné davantage l'effet du nanomédicament modifié en surface par hGC33 sur la voie de signalisation Wnt dans les cellules d'hépatome. Comme hGC33 libre, le nanomédicament modifié en surface par hGC33 inhibait la prolifération des cellules d'hépatome non seulement en bloquant la transduction du signal induite par Wnt dans les cellules HepG2 et Huh-7 exprimant GPC3, mais aussi en inhibant la transduction du signal β-catenin et YAP induite par Wnt3a. Des études antérieures ont montré que l'expression de YAP est régulée par β-catenin au niveau transcriptionnel du CHC [30, 31]. Dans cette étude, hGC33 libre et le nanomédicament modifié en surface par hGC33 inhibaient l'activité YAP induite par Wnt3a, indiquant que Yap/TAZ libéré du complexe β-catenin peut aussi initier la transduction de la signalisation Wnt classique [32, 2]. Ces résultats indiquent que Wnt typique et YAP communiquent par une variété de mécanismes. Comparé à hGC33-null-NP et hGC33, hGC33-SFB-NP avait une capacité anti-prolifération et anti-migration plus forte in vitro et in vivo. Ainsi, hGC33 détermine non seulement la spécificité des cellules de CHC, mais augmente aussi l'effet inhibiteur de SFB sur la prolifération et la migration des cellules de CHC en bloquant les signaux clés liés à la croissance tumorale, tels que les voies de signalisation Wnt/β-catenin et Wnt/YAP.

Conclusion

L'anticorps hGC33 contre la glypican-3, une protéine membranaire surexprimée sur les cellules de carcinome hépatocellulaire, a augmenté la liaison des nanoparticules polymères de polyéthylène glycol-b-PLGA chargées de sorafénib (hGC33-SFB-NP) à la glypican-3 sur les cellules cancéreuses. L'administration des nanoparticules modifiées par anticorps a inhibé synergiquement la transduction du signal induite par Wnt et la voie de signalisation Ras/Raf/MAPK ; les cellules de carcinome hépatocellulaire ont été arrêtées en phase G0/1 par la régulation négative de l'expression de la cycline D1, atténuant ainsi la migration des cellules cancéreuses en inhibant la transition épithélial-mésenchymateuse. hGC33-SFB-NP a inhibé la croissance du cancer du foie in vivo et amélioré le taux de survie des souris porteuses de tumeurs.

Disponibilité des données et matériel

Oui, toutes les données ont été présentées dans le manuscrit.

Abréviations

AKT/PKB :

Protéine kinase B

c-MET :

HGFR : Récepteur du facteur de croissance des hépatocytes

EE % :

Efficacité d'encapsulation %

TEM :

Transition épithélial-mésenchymateuse

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

¹H RMN :

Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire ¹H

CHC :

Carcinome hépatocellulaire

LC % :

Charge de médicament %

MAPK :

Kinases activées par mitogènes

IPD :

Indice de polydispersité

PI3K :

Phosphoinositide 3-kinase

pRAD51 :

Phospho-RAD51

SFB :

Sorafénib

MET :

Microscopie électronique à transmission

YAP :

Protéine associée à Yes-1