Le miR-326 exosomal des macrophages M1 supprime la progression du carcinome hépatocellulaire en modulant la signalisation NF-κB

Résumé

Des preuves accumulées ont montré que les microARN (miR) dérivés d'exosomes de macrophages M1 peuvent réguler la progression du carcinome hépatocellulaire (CHC). Cependant, l'effet du miR-326 dérivé d'exosomes de macrophages M1 sur le CHC n'a pas été rapporté. Par conséquent, l'objectif de cette étude était d'explorer le mécanisme du miR-326 exosomal des macrophages M1 dans la régulation de la progression des cellules de CHC. La RT-qPCR a détecté l'expression du miR-326 dans les lignées cellulaires de CHC. L'expression du miR-326 dans le CHC a été modifiée par transfection, et l'effet du miR-326 sur l'expression de CD206 et NF-κB, la prolifération cellulaire, la formation de colonies, la migration, l'apoptose et l'invasion a été détecté. Ensuite, des exosomes ont été isolés à partir de macrophages M1. La RT-qPCR a identifié l'expression du miR-326 dans les exosomes dérivés de macrophages M1. L'expression du miR-326 dans les exosomes dérivés de macrophages M1 a été modifiée par transfection. Les exosomes dérivés de macrophages M1 ont été co-cultivés avec des cellules de CHC pour déterminer leurs effets sur la progression biologique des cellules de CHC. Finalement, des expériences in vivo ont été réalisées pour vérifier les résultats in vitro. Le miR-326 était diminué dans les cellules de CHC et enrichi dans les exosomes dérivés de macrophages M1. La surexpression du miR-326 inhibait la prolifération, la formation de colonies, la migration, l'invasion, et l'expression de CD206 et NF-κB des cellules de CHC, et favorisait l'apoptose, tout en inhibant la croissance des tumeurs CHC in vivo, tandis que la sous-expression du miR-326 montrait des effets opposés. Les exosomes dérivés de macrophages M1 inhibaient la prolifération, la formation de colonies, la migration, l'invasion, et l'expression de CD206 et NF-κB des cellules de CHC et augmentaient l'apoptose, tandis que la surexpression du miR-326 renforçait l'effet des exosomes dérivés de macrophages M1 sur les cellules de CHC. Il est révélé que le miR-326 exosomal dérivé de macrophages M1 supprime la prolifération, la migration et l'invasion ainsi que favorise l'apoptose du CHC en régulant négativement l'expression de NF-κB.

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le cinquième cancer le plus courant dans le monde et le cancer primitif du foie le plus fréquent [1]. Selon les données du Registre national du cancer de Chine, le taux de mortalité du cancer primitif du foie est le troisième, tandis que l'incidence est la quatrième parmi les maladies malignes courantes [2]. Les principaux facteurs de risque du CHC sont l'infection chronique par le virus de l'hépatite C et le virus de l'hépatite B, les aliments contaminés par l'aflatoxine, l'obésité, le tabagisme, la consommation excessive d'alcool et le diabète de type 2 [3]. La chimioembolisation transartérielle est un traitement établi pour le CHC au stade intermédiaire, qui améliore la survie de la majorité des patients atteints de CHC aux stades intermédiaires ou avancés [4]. Actuellement, le diagnostic du CHC dépend principalement des biomarqueurs sériques et des techniques d'imagerie [5]. Le taux de survie à 5 ans lié au CHC n'est que d'environ 60 %, et l'incidence augmente d'année en année ces dernières années [6]. Étant donné cela, la recherche de cibles thérapeutiques précises est une priorité dans le traitement du CHC.

Les macrophages sont des cellules effectrices et des régulateurs majeurs du système immunitaire, exercent d'énormes fonctions sur le remodelage et la réparation des tissus, et effectuent des fonctions métaboliques d'orchestration dans presque tous les tissus in vivo [7]. Il est révélé que les macrophages M1 exercent des effets favorisant la tumeur et augmentent la motilité des cellules de CHC [8]. L'exosome est une vésicule discoïde d'un diamètre de 40–150 nm [9]. Selon Xu et al., les microARN (miARN) exosomaux ont des fonctions sur la prolifération, l'invasivité, la métastase et la résistance aux médicaments du CHC via la modulation de l'expression génique dans les cellules cibles [10]. Une étude a démontré que les exosomes contenant le miR-326 pourraient être une cible clinique potentielle dans la sclérose en plaques [11]. Les miARN peuvent agir soit comme oncogènes, soit comme inhibiteurs de tumeur en modulant l'expression d'un grand nombre de gènes codant pour des protéines par dégradation de l'ARNm et blocage de la traduction dans une séquence spécifique [12]. Une étude a discuté que le miR-326 supprime la croissance des cellules de CHC en perturbant la progression du cycle cellulaire et en augmentant l'apoptose, en plus de supprimer l'invasion cellulaire via la diminution du phénotype de transition épithélial-mésenchymateux [13]. Une autre étude a rapporté que le miR-326 pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour le traitement des patients atteints de CHC [14]. Par conséquent, cette étude actuelle a discuté le mécanisme du miR-326 exosomal régulant l'invasion et la migration des cellules de CHC.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

Tous les expériences sur les animaux étaient conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire par les Comités internationaux. Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique pour l'expérimentation animale du Troisième Hôpital de l'Université de Jilin.

Induction et identification des macrophages

La lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 (Institut de zoologie de Kunming, CAS, Kunming, Chine) a été cultivée dans un milieu RPMI 1640 (Gibco, CA, USA ; Thermo Fisher Scientific, MA, USA) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (SFB) inactivé par la chaleur. Les cellules THP-1 ont été traitées avec 150 ng/mL de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA ; P8139, Sigma-Aldrich, SF, CA, USA) et incubées dans le milieu RPMI pendant 24 h pour obtenir des macrophages M0. Ensuite, la morphologie cellulaire avant et après l'induction a été observée par coloration de Wright. Les cellules THP-1 et les macrophages induits ont été resuspendus dans 5 μL de PBS, déposés sur une lame de verre, colorés par la solution de colorant de Wright et mélangés avec la solution tampon à 1:2. Colorés pendant 10 min et rincés à l'eau courante, les cellules ont été observées au microscope. De plus, les marqueurs des macrophages M0 (CD68 et CD206) ont été mesurés par réaction de polymérisation en chaîne par transcription inverse quantitative (RT-qPCR). Ensuite, les macrophages ont été induits en macrophages M1 par incubation avec 20 ng/mL d'interféron (IFN)-γ (#285-IF ; R&D Systems, MN, USA) et 10 pg/mL de LPS (#8630 ; Sigma-Aldrich) pendant 18 h. Les marqueurs des macrophages M1 (IDO1 et IL-12 p35) ont été examinés par RT-qPCR [15].

Extraction des exosomes

Les exosomes ont été extraits par un kit de séparation d'exosomes (ExoEasy Maxi Kit, Qiagen, Hilden, Allemagne). Le surnageant de macrophages a été recueilli dans un tube de centrifugation de 15 mL dans des conditions aseptiques et filtré par un film filtrant de 0,8 μm. Le surnageant cellulaire de chaque groupe a été additionné de tampon XBP (1:1) puis centrifugé avec une colonne d'affinité par membrane exoEasy à 500 g. Les cellules ont été supplémentées avec 10 mL de tampon XWP et centrifugées à 3000–5000 g. La colonne d'affinité par membrane exoEasy a été incubée avec 400 μL de tampon d'élution XE et centrifugée à 500 g. Le tampon d'élution a été transféré dans la colonne d'affinité par membrane exoEasy et centrifugé à 500 g. Le tampon d'élution a été stocké pendant 24 h à 4 °C puis utilisé pour l'identification. Le reste a été stocké à −80 °C.

Observation par MET et analyse de suivi des nanoparticules (NTA)

Les exosomes obtenus ci-dessus ont été déposés sur une grille de cuivre à membrane de carbone et additionnés d'acide phosphotungstique à 2 %. L'échantillon a été observé sous un MET, et l'image optimale a été collectée et analysée.

Les impuretés et particules dans le PBS ont été éliminées par un filtre microporeux de 0,22 μm. Selon la densité des particules des exosomes, le PBS filtré a été dilué à la concentration appropriée et détecté à l'aide d'un détecteur de nanoparticules Nanosight NS300 (Malvern, Westborough, MA, USA).

Après identification, les exosomes dérivés de macrophages transféctés avec l'inhibiteur de miR-326 et le contrôle négatif (CN) de l'inhibiteur de miR-326, le mimétique de miR-326 et le CN du mimétique de miR-326 ont été extraits par un kit de séparation d'exosomes (Invitrogen).

RT-qPCR

L'ARN total a été extrait par le réactif Trizol (Thermo Fisher), et la PCR en temps réel a été réalisée en utilisant le SYBR-Green PCR Master Mix (Roche) et le système ABI 7500 Real-Time PCR (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Les séquences des amorces sont présentées dans le Tableau 1. L'analyse quantitative a été effectuée en utilisant la méthode 2^(−ΔΔCt).

Analyse par Western Blot

La protéine totale des cellules et des exosomes a été extraite. La concentration en protéines a été déterminée par un kit d'acide bicinchonique (BCA) (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, Chine). La protéine a été additionnée de tampon d'échantillon et bouillie à 95 °C, et chaque puits a été chargé avec 30 µg. La protéine a été séparée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % (Boster Biological Technology) et transférée sur une membrane de fluorure de polyvinylidène, suivie d'un blocage dans 5 % d'albumine sérique bovine (BSA). La membrane a été incubée avec des anticorps primaires anti-CD63 (1:1000, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Ames, IA, USA), anti-CD181 (1:1000, R&D Systems), anti-GAPDH (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, USA) et avec l'anticorps secondaire (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories) marqué par la peroxydase de raifort. Les images ont été obtenues par un système d'imagerie par balayage à fluorescence infrarouge bicolore Odyssey, et les valeurs de densité des bandes ont été mesurées par le logiciel d'analyse d'image Quantity One.

Culture cellulaire et criblage

La lignée cellulaire hépatique normale HL-7702 et les lignées cellulaires de CHC humain BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 et QGY-7703 ont été sélectionnées et cultivées dans le milieu Gibco RPMI 1640 avec 10 % de SFB, pénicilline (100 U/mL) et streptomycine (100 mg/mL). L'expression du miR-326 a été détectée par RT-qPCR, et les lignées cellulaires appropriées ont été criblées.

Marquage des exosomes et absorption des exosomes

Les exosomes ont été resuspendus avec 250 μL de diluant C et doucement triturés en évitant d'endommager la membrane de l'exosome. Le colorant PKH67 (1 μL, Sigma-Aldrich) a été ajouté à 250 μL de diluant C pour atteindre 500 μL et incubé. La solution a été additionnée de 500 μL de BSA à 1 % et incubée à 37 °C pendant 1 min. Les exosomes ont été obtenus par centrifugation à 120 000 g à 4 °C pendant 2 h. Les exosomes marqués au PKH67 ont été obtenus par centrifugation à 120 000 g à 4 °C pendant 2 h. Les exosomes ont été resuspendus avec 6 mL de milieu RPMI-1640 en évitant la lumière. Ensuite, les exosomes marqués ont été co-cultivés avec des cellules de CHC pendant 12 h. Après cela, le milieu de culture a été éliminé et lavé avec du PBS pendant 3 fois, 5 min/fois, et les exosomes marqués par fluorescence qui n'avaient pas été internalisés par les cellules de CHC ont été soigneusement lavés. Les exosomes ont été fixés avec 4 % de paraformaldéhyde et colorés avec du 4′-6-diamidino-2-phénylindole. Après montage, la distribution de fluorescence a été observée par un microscope confocal laser.

Groupement et traitement des cellules

Les cellules HepG2 et SMMC-7721 ont été ensemencées dans une plaque à 12 puits à 0,5–1 × 10⁶ cellules/puits. Avec 50–60 % de confluence, les cellules ont été transféctées avec Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Les cellules HepG2 ont été réparties en groupe mimétique miR-326 (transféctées avec mimétique miR-326) et groupe CN-mimétique (transféctées avec CN mimétique miR-326). Les cellules SMMC-7721 ont été assignées en groupe inhibiteur miR-326 (transféctées avec inhibiteur miR-326) et groupe CN-inhibiteur (transféctées avec CN inhibiteur miR-326). Le mimétique miR-326, l'inhibiteur miR-326 et leurs CN ont été mélangés avec Lipofectamine 2000 pour la transfection. Les cellules HepG2 et SMMC-7721 sans aucun traitement ont été définies comme groupe témoin. Le mimétique miR-326, l'inhibiteur miR-326 et leurs CN ont été conçus et composés par Guangzhou RibBio Co., Ltd. (Guangzhou, Chine) (Tableau 1).

Co-culture d'exosomes dérivés de macrophages M1 avec des cellules de CHC

La concentration en protéines de la suspension d'exosomes dérivés de macrophages M1 a été détectée par la méthode BCA, et le volume de la suspension d'exosomes correspondant à 50 μg de protéines a été calculé. Les cellules HepG2 et SMMC-7721 ont été ensemencées dans une plaque à 12 puits à 1 × 10⁵ cellules/mL par puits. Les cellules HepG2 ont été réparties en 4 groupes : groupe témoin (cellules HepG2 non co-cultivées avec des exosomes), groupe exosomes (Exo) (cellules HepG2 co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1), groupe Exo-miR-326-mimétique (cellules HepG2 co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326), groupe Exo-CN-mimétique (cellules HepG2 co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec CN mimétique miR-326). Les cellules SMMC-7721 ont également été assignées en 4 groupes : groupe témoin (cellules SMMC-7721 non co-cultivées avec des exosomes), groupe Exo (cellules SMMC-7721 co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1), groupe Exo-miR-326-inhibiteur (cellules SMMC-7721 co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326), groupe Exo-CN-inhibiteur (cellules SMMC-7721 co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec CN inhibiteur miR-326).

Test MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide)

Les cellules ont été détachées avec de la trypsine et ensemencées sur une plaque à 96 puits avec une densité cellulaire de 4 × 10⁴ cellules par puits. Le milieu de culture a été abandonné après culture pendant 12, 24, 36, 48, 60 h respectivement. Incubées avec 500 μL de solution MTT à 0,5 g/L, les cellules ont été additionnées de 200 μL de solution de diméthylsulfoxyde, triturées et incubées. Les valeurs de densité optique (DO, 490 nm) ont été mesurées par un lecteur de microplaques.

Test de formation de colonies

Cultivées pendant 24 h et détachées avec de la trypsine, les cellules ont été ensemencées dans une petite boîte de 35 mm avec 300 cellules par boîte. La solution a été remplacée tous les 3 jours. Après 10 jours de culture, les cellules ont été fixées avec 40 g/L paraformaldéhyde et colorées avec une solution de violet de cristal à 1 g/L et séchées. Le nombre de colonies (plus de 50 cellules) a été compté au microscope.

Test Transwell

Les cellules (1 × 10⁵) ont été suspendues avec 200 μL de milieu de culture sans sérum. Les expériences ont été menées conformément aux instructions de la chambre Transwell (Corning Glass Works, Corning, N.Y., USA) (le Matrigel était nécessaire pour l'expérience d'invasion, mais pas pour l'expérience de migration). Le RPMI 1640 (10 % SFB, 600 μL) a été ajouté dans la chambre inférieure. Les chambres supérieure et inférieure étaient séparées par une membrane Transwell pré-enduite de Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Cultivées pendant 24 h, la chambre a été fixée avec 95 % d'alcool. Après coloration avec une solution de violet de cristal, les cellules ont été observées dans cinq champs visuels au microscope.

Cytométrie de flux

Cycle cellulaire : les cellules ont été détachées par trypsine. Les cellules (1 × 10⁶) ont été suspendues avec 0,5 mL de PBS et triturées en suspension unique. Mélangées avec 4,5 mL d'éthanol à 70 % pré-refroidi sur glace, les cellules ont été centrifugées à 3000 g, rincées avec 5 mL de PBS et centrifugées à nouveau à 3000 g. Suivi de cela, les cellules ont été suspendues avec 1 mL de solution de coloration PI/Triton X-100 (20 μg PI/0,1 % Triton X-100) contenant 0,2 mg de RnaseA. Le cycle cellulaire a été détecté par cytométrie de flux.

Apoptose cellulaire : cellules trypsinisées (1 × 10⁶) suspendues avec 1 mL de PBS, triturées et centrifugées à 3000 g. Les cellules ont été rincées tour à tour avec le tampon d'incubation (10 mmol/L Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl₂) et centrifugées à 3000 g. Ensuite, les cellules ont été incubées avec 100 μL de solution de marquage (FITC-Annexin V et PI ajoutés au tampon d'incubation pour atteindre 1 μg/mL), centrifugées à 3000 g, lavées une fois avec le tampon d'incubation et incubées avec une solution fluorescente (SA-FLOUS). L'apoptose cellulaire a été détectée par cytométrie de flux. La longueur d'onde de la cytométrie de flux était de 488 nm, et la fluorescence FITC a été détectée par un filtre à bande à 515 nm, tandis que le PI avec une longueur d'onde supérieure à 560 nm. Les résultats ont été analysés automatiquement par ordinateur.

Xénogreffe tumorale chez les souris nues

Quarante souris (Collège des sciences animales, Université de Jilin, Jilin, Chine) âgées de 4–6 semaines ont été réparties aléatoirement en 8 groupes, avec 5 souris par groupe. Les souris ont été nourries dans un laboratoire animal de grade exempt de pathogènes spécifiques pendant 1 semaine, et la nourriture, la litière et le biberon ont été remplacés en temps voulu. L'état de santé des souris devait être observé chaque jour. Une semaine plus tard, les cellules de CHC ont été préparées en suspension cellulaire et injectées sous-cutanément dans le cou et le dos à 0,1 mL de suspension cellulaire (1 × 10⁶). La croissance de la tumeur a été observée après 3–5 jours. Les souris nues ont été pesées tous les 4 jours, et le volume de la tumeur a été mesuré. Les souris nues ont été euthanasiées 20 jours après l'injection.

Analyse statistique

Toutes les données ont été interprétées par le logiciel SPSS 17.0 (SPSS Statistics, Chicago, IL, USA). Les données de mesure étaient indiquées comme moyenne ± écart-type. Les comparaisons entre deux groupes étaient formulées par le test t, tandis que les comparaisons entre plusieurs groupes étaient évaluées par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). Une valeur P < 0,05 indiquait une différence statistiquement significative.

Résultats

Identification des macrophages M1 et des exosomes

La coloration de Wright a été utilisée pour observer la morphologie des cellules THP-1 induites par le PMA. Il a été observé que le volume des cellules THP-1 avant induction était petit et la proportion de caryoplasme était plus élevée ; la morphologie des cellules après induction était irrégulière, le volume devenait plus grand, et la proportion de caryoplasme diminuait ; le cytoplasme était plus riche et de couleur bleu clair, avec des particules abondantes et quelques vacuoles ; le noyau était rouge pourpre et souvent incliné d'un côté, montrant que les cellules avaient les caractéristiques morphologiques typiques des macrophages (Fig. 1a).

Identification des macrophages M1 et des exosomes. a Coloration de Wright pour observer la morphologie des cellules THP-1 avant et après traitement par PMA. b Expression de CD68 et CD206 dans les cellules THP-1 et les cellules THP-1 traitées par PMA détectée par RT-qPCR ; c morphologie des macrophages et macrophages M1. d Expression de IDO1 et IL-12 p35 dans les macrophages M0 et macrophages M0 traités par LPS et IFN-γ détectée par RT-qPCR. e MET pour l'observation des exosomes. f Détection de la distribution de taille des particules des exosomes par NTA. g Bandes de protéines de CD63 et CD181. Dans le panneau b, *P < 0,05 versus cellules THP-1 ; Dans le panneau d, *P < 0,05 versus macrophages M0. Les données de mesure sont représentées comme moyenne ± écart-type (N = 3), les comparaisons entre deux groupes ont été conduites par test t.

Pour vérifier davantage l'induction réussie des macrophages, l'expression de CD68 et CD206 avant et après l'induction a été testée par RT-qPCR. Il a été manifesté que l'expression de CD68 et CD206 était élevée depuis l'induction par PMA, indiquant que le PMA a induit avec succès les cellules THP-1 en macrophages M0 (Fig. 1b). Ensuite, les macrophages M0 ont été polarisés en macrophages M1 par induction de LPS et IFN-γ. La morphologie, et l'expression des marqueurs de surface des macrophages M1 IDO1 et IL-12 p35 des macrophages ont été observées et testées. Les macrophages M0 montraient des morphologies adhérentes variées et irrégulières, montrant une forme ronde, elliptique ou fusiforme. La morphologie des macrophages stimulés par IFN-γ était démontrée avec plus de pseudopodes et de protrusions et fusiforme (Fig. 1c). La RT-qPCR a décrit (Fig. 1d) qu'après traitement par LPS et IFN-γ, les macrophages M1 montraient une augmentation de leurs marqueurs (IDO1 et IL-12p35).

Par la suite, les exosomes dérivés des macrophages ont été observés par le MET. Il a été révélé que les exosomes dérivés des macrophages étaient riches et de forme ronde ou ovale, avec une structure membranaire, une taille uniforme et moins de polluants (Fig. 1e). La NTA a montré que les exosomes avec un pic centralisé de la courbe MODE et une linéaire lisse avaient un diamètre plus concentré et moins d'impuretés (Fig. 1f). L'analyse par Western blot a rapporté que par rapport aux macrophages, l'expression de la protéine marqueur spécifique CD63 et CD181 était augmentée dans les exosomes dérivés des macrophages (Fig. 1g). Ces résultats indiquent que nous avons induit avec succès les monocytes à se différencier en macrophages et les avons polarisés en macrophages M1.

Les exosomes dérivés de macrophages M1 délivrent le miR-326 aux cellules de CHC et affectent l'expression du miR-326 dans les cellules de CHC

Pour vérifier si les exosomes dérivés de macrophages M1 transportaient le miR-326 vers les cellules de CHC, les cellules HepG2 et SMMC-7721 ont été co-cultivées avec des exosomes. Il a pu être reconnu qu'un grand nombre d'exosomes étaient assimilés par les cellules HepG2 et SMMC-7721 après 4 h de transfection sous le microscope à fluorescence (Fig. 2a, b).

Les exosomes dérivés de macrophages M1 délivrent le miR-326 aux cellules de CHC et affectent l'expression du miR-326 dans les cellules de CHC. a Absorption des exosomes dérivés de macrophages M1 par les cellules HepG2. b Absorption des exosomes dérivés de macrophages M1 par les cellules SMMC-7721. c Comparaison de l'expression du miR-326 des exosomes de macrophages dans chaque groupe avant et après induction par IFN-γ et LPS. d Expression du miR-326 dans les lignées cellulaires de CHC (BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703) et la lignée cellulaire d'hépatocyte normal humain HL-7702 détectée par RT-qPCR. e La RT-qPCR a détecté l'effet du mimétique miR-326 sur l'expression du miR-326 dans les cellules HepG2. f La RT-qPCR a détecté l'effet de l'inhibiteur miR-326 sur l'expression du miR-326 dans les cellules SMMC-7721. g La RT-qPCR a détecté les effets des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 sur l'expression du miR-326 dans les cellules HepG2. h La RT-qPCR a détecté les effets des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 sur l'expression du miR-326 dans les cellules SMMC-7721. Dans le panneau c, *P < 0,05 versus le macrophage M0 ; Dans le panneau d, *P < 0,05 versus cellules HL-7702 ; Dans le panneau e, *P < 0,05 versus le groupe CN-mimétique ; Dans le panneau f, *P < 0,05 versus le groupe CN-inhibiteur ; Dans le panneau g, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-mimétique ; Dans le panneau h, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-inhibiteur. Les données de mesure sont représentées comme moyenne ± écart-type (N = 3), les comparaisons entre plusieurs groupes ont été conduites par analyse de variance unidirectionnelle.

Par la suite, le mimétique/inhibiteur miR-326 a été transfécté dans les macrophages et l'expression du miR-326 dans leurs exosomes a été vérifiée avant et après transfection. Il a été affiché que par rapport aux exosomes des macrophages M0, l'expression du miR-326 était augmentée dans les exosomes dérivés de macrophages M1. Une expression élevée du miR-326 a été observée dans les exosomes dérivés de macrophages M1 avec traitement par mimétique miR-326. L'expression du miR-326 a diminué dans les exosomes dérivés de macrophages M1 avec traitement par inhibiteur miR-326 (Fig. 2c).

Ensuite, l'expression du miR-326 dans les lignées cellulaires de CHC a été testée. Comme manifesté, l'expression du miR-326 était diminuée dans les cellules BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 et QGY-7703 comparées aux cellules HL-7702, parmi lesquelles les cellules HepG2 manifestaient l'expression la plus faible, tandis que les cellules SMMC-7721 avaient l'expression la plus élevée (Fig. 2d).

Suivi de cela, le mimétique miR-326 et l'inhibiteur miR-326 ont été transféctés dans les cellules HepG2 et SSMC-7721 respectivement, et leurs effets sur l'expression du miR-326 ont été examinés. Le mimétique miR-326 a élevé l'expression du miR-326 dans les cellules HepG2, tandis que l'inhibiteur miR-326 a réduit l'expression du miR-326 dans les cellules SSMC-7721 (Fig. 2e, f).

Ensuite, les exosomes des macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 et inhibiteur miR-326 ont été co-cultivés avec les cellules HepG2 et SSMC-7721 respectivement. Il a été souligné que la co-culture avec des exosomes augmentait l'expression du miR-326 dans les cellules de CHC, les exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 augmentaient davantage l'expression du miR-326 dans les cellules HepG2, tandis que les exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 dégradaient l'expression du miR-326 dans les cellules SSMC-7721 (Fig. 2g, h). Il est suggéré que les exosomes dérivés de macrophages M1 délivrent le miR-326 aux cellules de CHC et affectent l'expression du miR-326 dans les cellules de CHC.

Le miR-326 exosomal dérivé de macrophages M1 réduit la prolifération cellulaire et la capacité de formation de colonies dans les cellules de CHC

En explorant l'effet du miR-326 exosomal sur la prolifération des cellules de CHC, les tests MTT et de formation de colonies ont été conduits pour examiner la prolifération des cellules de CHC. Il a été suggéré que dans les cellules HepG2, la restauration du miR-326 altérait la prolifération cellulaire et la capacité de formation de colonies (Fig. 3a, e, f). Les exosomes dérivés de macrophages M1 empêchaient les cellules HepG2 de proliférer et de former des colonies. Les exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 altéraient davantage la prolifération cellulaire et la capacité de formation de colonies (Fig. 3c, i, j).

Le miR-326 exosomal de macrophage M1 inhibe la prolifération cellulaire et la formation de colonies dans les cellules de CHC. a Le test MTT a détecté l'effet de la transfection du mimétique miR-326 sur la prolifération des cellules HepG2. b Le test MTT a détecté l'effet de la transfection de l'inhibiteur miR-326 sur la prolifération des cellules SMMC-7721. c Le test MTT a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 sur la prolifération des cellules HepG2. d Le test MTT a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 sur la prolifération des cellules SMMC-7721. e Le test de formation de colonies a détecté l'effet de la transfection du mimétique miR-326 sur la capacité de formation de colonies des cellules HepG2. f Nombre de colonies des cellules HepG2. g Le test de formation de colonies a détecté l'effet de la transfection de l'inhibiteur miR-326 sur la capacité de formation de colonies des cellules SMMC-7721. h Nombre de colonies des cellules SMMC-7721. i Le test de formation de colonies a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 sur la capacité de formation de colonies des cellules HepG2. j Nombre de colonies des cellules HepG2 traitées avec des exosomes. k Le test de formation de colonies a détecté l'effet de la co-culture d'exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 sur la capacité de formation de colonies des cellules SMMC-7721. l Nombre de colonies des cellules SMMC-7721 traitées avec des exosomes. Dans les panneaux a et f, *P < 0,05 versus le groupe CN-mimétique ; Dans les panneaux b et h, *P < 0,05 versus le groupe CN-inhibiteur ; Dans les panneaux c et j, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-mimétique ; Dans les panneaux d et l, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-inhibiteur. Les données de mesure sont représentées comme moyenne ± écart-type (N = 3), les comparaisons entre plusieurs groupes ont été conduites par analyse de variance unidirectionnelle.

Dans les cellules SMMC-7721, la réduction du miR-326 augmentait la prolifération cellulaire et la capacité de formation de colonies (Fig. 3b, g, h). Dans les cellules SMMC-7721 traitées avec des exosomes dérivés de macrophages M1, la prolifération cellulaire et la capacité de formation de colonies étaient diminuées. Les exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 encourageaient davantage la prolifération cellulaire et la capacité de formation de colonies (Fig. 3d, k, l). Il est suggéré que le miR-326 dérivé d'exosomes de macrophages M1 entrave la prolifération des cellules de CHC.

Le miR-326 exosomal dérivé de macrophages M1 supprime la migration et l'invasion des cellules de CHC

Ensuite, l'effet du miR-326 exosomal sur l'invasion et la migration des cellules de CHC a été examiné. Il a été démontré que dans les cellules HepG2, la restauration du miR-326 limitait l'invasion et la migration (Fig. 4a–c). Les exosomes dérivés de macrophages M1 perturbaient les cellules HepG2 à envahir et migrer. L'invasion et la migration étaient davantage dégradées lorsque les cellules HepG2 étaient co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 (Fig. 4g–i).

Le miR-326 exosomal de macrophage M1 inhibe la migration et l'invasion des cellules de CHC. a Le test Transwell a détecté l'effet de la transfection du mimétique miR-326 sur l'invasion des cellules HepG2. b Le test Transwell a détecté l'effet de la transfection du mimétique miR-326 sur la migration des cellules HepG2. c Le nombre d'invasion et de migration des cellules HepG2. d Le test Transwell a détecté l'effet de la transfection de l'inhibiteur miR-326 sur l'invasion des cellules SMMC-7721. e Le test Transwell a détecté l'effet de la transfection de l'inhibiteur miR-326 sur la migration des cellules SMMC-7721. f Le nombre d'invasion et de migration des cellules SMMC-7721. g Le test Transwell a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 sur l'invasion des cellules HepG2. h Le test Transwell a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 sur la migration des cellules HepG2. i Le nombre d'invasion et de migration des cellules HepG2 co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1. j Le test Transwell a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 sur l'invasion des cellules SMMC-7721. k Le test Transwell a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 sur la migration des cellules SMMC-7721. l Le nombre d'invasion et de migration des cellules SMMC-7721 co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1. Dans le panneau c, *P < 0,05 versus le groupe CN-mimétique ; Dans le panneau f, *P < 0,05 versus le groupe CN-inhibiteur ; Dans le panneau i, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-mimétique ; Dans le panneau l, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-inhibiteur. Les données de mesure sont représentées comme moyenne ± écart-type (N = 3), les comparaisons entre plusieurs groupes ont été conduites par analyse de variance unidirectionnelle.

La réduction du miR-326 a entraîné des augmentations de l'invasion et de la migration des cellules SMMC-7721 (Fig. 4d–f). Lorsque traitées avec des exosomes dérivés de macrophages M1, les cellules SMMC-7721 présentaient une invasion et une migration diminuées. Cependant, l'invasion et la migration des cellules SMMC-7721 étaient stimulées lors de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 (Fig. 4j–l). Il est implicité que le miR-326 dérivé d'exosomes de macrophages M1 entrave l'invasion et la migration des cellules de CHC.

Le miR-326 exosomal dérivé de macrophages M1 favorise l'apoptose des cellules de CHC

Lors de l'examen de l'effet du miR-326 exosomal sur le cycle cellulaire et l'apoptose des cellules de CHC, la coloration simple au PI et la double coloration Annexin V-FITC/PI ont été appliquées. Il a été illustré que la surexpression du miR-326 augmentait les cellules arrêtées en phase G0/G1, réduisait les cellules arrêtées en phases S et G2/M et augmentait l'apoptose dans les cellules HepG2 (Fig. 5a–d). La co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 augmentait les cellules arrêtées en phase G0/G1, réduisait les cellules arrêtées en phases S et G2/M et augmentait l'apoptose cellulaire des cellules HepG2. La co-culture avec des exosomes de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 renforçait davantage ces effets (Fig. 5i–l).

Le miR-326 exosomal de macrophage M1 favorise l'apoptose des cellules de CHC. a, b La cytométrie de flux a détecté l'effet de la transfection du mimétique miR-326 sur le cycle cellulaire des cellules HepG2 ; c, d la cytométrie de flux a détecté l'effet de la transfection du mimétique miR-326 sur l'apoptose des cellules HepG2 ; e, f la cytométrie de flux a détecté l'effet de la transfection de l'inhibiteur miR-326 sur le cycle cellulaire des cellules SMMC-7721 ; g, h la cytométrie de flux a détecté l'effet de la transfection de l'inhibiteur miR-326 sur l'apoptose des cellules SMMC-7721 ; i, j la cytométrie de flux a détecté les effets de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 sur le cycle cellulaire des cellules HepG2 ; k, l la cytométrie de flux a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 sur l'apoptose des cellules HepG2 ; m, n la cytométrie de flux a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 sur le cycle cellulaire des cellules SMMC-7721 ; o, p la cytométrie de flux a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 sur l'apoptose des cellules SMMC-7721. Dans les panneaux b et d, *P < 0,05 versus le groupe CN-mimétique ; Dans les panneaux f et h, *P < 0,05 versus le groupe CN-inhibiteur ; Dans les panneaux j et l, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-mimétique ; Dans les panneaux n et p, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-inhibiteur. Les données de mesure sont représentées comme moyenne ± écart-type (N = 3), les comparaisons entre plusieurs groupes ont été conduites par analyse de variance unidirectionnelle.

Dans les cellules SMMC-7721, la sous-régulation du miR-326 réduisait les cellules arrêtées en phase G0/G1, augmentait les cellules arrêtées en phases S et G2/M, et diminuait l'apoptose cellulaire (Fig. 5e–h). Les exosomes dérivés de macrophages M1 non transféctés augmentaient les cellules arrêtées en phase G0/G1, réduisaient les cellules arrêtées en phases S et G2/M, et augmentaient l'apoptose cellulaire. Les exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 dégradaient les cellules arrêtées en phase G0/G1, augmentaient les cellules arrêtées en phases S et G2/M, et diminuaient l'apoptose cellulaire (Fig. 5m–p). En bref, il est résumé que le miR-326 dérivé d'exosomes de macrophages M1 arrête le cycle cellulaire en phase G0/G1 et induit l'apoptose cellulaire dans le CHC.

Le miR-326 exosomal dérivé de macrophages M1 diminue l'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules de CHC

Ensuite, le mécanisme potentiel du miR-326 dérivé d'exosomes de macrophages M1 dans la progression biologique des cellules de CHC a été exploré. NF-κB est le lien clé entre l'inflammation et le cancer. De nombreuses protéines régulatrices et miARN pourraient inhiber la signalisation NF-κB excessivement activée pour supprimer le cancer [16]. Un tel effet bénéfique peut inclure la polarisation des macrophages M2 en macrophages M1. L'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules HepG2 et SMMC-7721 a été testée par RT-qPCR. Il a été suggéré que la restauration du miR-326 diminuait l'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules HepG2, tandis que la réduction du miR-326 augmentait l'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules SMMC-7721 (Fig. 6a, b). De plus, la co-culture avec des exosomes de macrophages M1 réduisait significativement l'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules HepG2, tandis que la co-culture avec des exosomes de macrophages M1 surexprimant le miR-326 diminuait davantage l'expression de CD206 et NF-κB. Traitées avec des exosomes dérivés de macrophages M1 non transféctés, l'expression de CD206 et NF-κB était diminuée dans les cellules SMMC-7721. Co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326, les cellules SMMC-7721 étaient caractérisées par une expression accrue de CD206 et NF-κB (Fig. 6c, d). Il a été conclu que le miR-326 des exosomes de macrophages M1 jouait un rôle de suppresseur de tumeur en inhibant NF-κB dans les cellules de CHC.

Le miR-326 exosomal de macrophage M1 diminue l'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules de CHC. a La RT-qPCR a détecté l'effet de la transfection du mimétique miR-326 sur l'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules HepG2 ; b La RT-qPCR a détecté l'effet de la transfection de l'inhibiteur miR-326 sur l'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules SMMC-7721. c La RT-qPCR a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 sur l'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules HepG2 ; d La RT-qPCR a détecté l'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 sur l'expression de CD206 et NF-κB dans les cellules SMMC-7721. Dans le panneau a, *P < 0,05 versus le groupe CN-mimétique ; Dans le panneau b, *P < 0,05 versus le groupe CN-inhibiteur ; Dans le panneau c, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-mimétique ; Dans le panneau d, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-inhibiteur. Les données de mesure sont représentées comme moyenne ± écart-type (N = 3), les comparaisons entre plusieurs groupes ont été conduites par analyse de variance unidirectionnelle.

Le miR-326 des exosomes de macrophages M1 inhibe la croissance tumorale du CHC in vivo

Finalement, les résultats in vivo ont été validés par des xénogreffes tumorales. Comme affiché, la surexpression du miR-326 diminuait le volume et le poids des tumeurs dans les cellules HepG2 (Fig. 7a–c). Chez les souris greffées avec des cellules HepG2 co-cultivées avec des exosomes, le traitement avec des exosomes de macrophages M1 réduisait significativement le volume et le poids des tumeurs des cellules HepG2, tandis que le traitement avec des macrophages M1 surexprimant le miR-326 réduisait davantage le volume et le poids des tumeurs des cellules HepG2 (Fig. 7g–i).

Le miR-326 exosomal de macrophage M1 réduit le volume et le poids de la tumeur CHC in vivo. a–c L'effet de la transfection du mimétique miR-326 sur le volume de la tumeur et la tumeur des souris nues xénogreffées avec des cellules HepG2. d–f L'effet de la transfection de l'inhibiteur miR-326 sur le volume de la tumeur et les tumeurs des souris nues xénogreffées avec des cellules SMMC-7721. g–i L'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec mimétique miR-326 sur le volume de la tumeur et la tumeur des souris nues xénogreffées avec des cellules HepG2. j–l L'effet de la co-culture avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326 sur le volume de la tumeur et la tumeur des souris nues xénogreffées avec des cellules SMMC-7721. Dans les panneaux b et c, *P < 0,05 versus le groupe CN-mimétique ; Dans les panneaux e et f, *P < 0,05 versus le groupe CN-inhibiteur ; Dans les panneaux h et i, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-mimétique ; Dans les panneaux k et l, *P < 0,05 versus le groupe témoin, #P < 0,05 versus le groupe Exo-CN-inhibiteur. Les données de mesure sont représentées comme moyenne ± écart-type (n = 5), les comparaisons entre plusieurs groupes ont été conduites par analyse de variance unidirectionnelle.

Dans les cellules SMMC-7721, la suppression du miR-326 augmentait le volume et le poids des tumeurs (Fig. 7d–f). Les exosomes dérivés de macrophages M1 non transféctés empêchaient la croissance tumorale en volume et en poids des cellules SMMC-7721. Co-cultivées avec des exosomes dérivés de macrophages M1 transféctés avec inhibiteur miR-326, les cellules SMMC-7721 étaient injectées dans les souris et causaient des augmentations du volume et du poids des tumeurs (Fig. 7j–l). En résumé, le miR-326 dérivé d'exosomes de macrophages M1 déprime la croissance tumorale du CHC in vivo.

Discussion

Le CHC est un cancer courant caractérisé par une morbidité et une mortalité élevées, un diagnostic et un traitement précoces difficiles, un pronostic médiocre et un taux de survie à 5 ans faible [17]. Récemment, une étude a souligné que le lncRNA cox-2 faiblement exprimé diminue la capacité des macrophages M1 à supprimer la croissance des cellules de CHC, l'invasivité, l'angiogenèse, la migration et à favoriser l'apoptose [18]. Hu et al. ont discuté que le miR-326 est évidemment dégradé dans les tissus et lignées cellulaires de CHC, tandis que le miR-326 sous-régulé est connecté au stade TNM, à la métastase ganglionnaire et à la différenciation des patients atteints de CHC [14]. Il est coutumièrement considéré que les exosomes dérivés de cellules de CHC peuvent former un environnement fertile pour faciliter la croissance, l'invasivité et la métastase des cellules de CHC ainsi que le développement de la résistance aux médicaments [19]. L'étude actuelle a été conçue pour explorer le mécanisme du miR-326 exosomal dans la régulation de l'invasion et de la migration des cellules de CHC.

Nos résultats ont indiqué que l'expression du miR-326 diminuait dans les cellules de CHC mais augmentait dans les exosomes. Une étude récente a souligné que l'expression du miR-326 est diminuée dans les tissus de CHC [20]. Une autre étude a présenté que l'expression du miR-326 est notablement réduite dans les lignées cellulaires et tissus de CHC et sa sous-régulation prédit un pronostic défavorable dans le CHC [13]. Il est rapporté que le miR-326 joue un rôle de suppression de tumeur et est grandement déprimé dans les cellules de CHC [21]. Toutes ces preuves susmentionnées sont en accord avec nos résultats. Une étude a prétendu que par rapport aux contrôles, l'expression du miR-326 est augmentée dans les exosomes dérivés de Tconv observés chez des patients atteints de sclérose en plaques rémittente-récurrente [11].

D'autres résultats émergent de nos données : le miR-326 exosomal hautement exprimé réduisait la prolifération cellulaire, la formation de colonies, la migration et l'invasion ainsi que favorisait l'apoptose des cellules de CHC in vitro et réduisait le volume et le poids de la tumeur CHC in vivo. Il a été suggéré précédemment que la croissance des cellules de CHC peut être supprimée via la surexpression du miR-326, et la capacité de migration et d'invasion des cellules de CHC est markedly atténuée par l'élévation du miR-326 [21]. Il est rapporté que l'expression surexprimée du miR-326 supprime la croissance des cellules de CHC et l'invasivité ainsi que stimule l'apoptose cellulaire in vitro [14]. En plus de cela, une étude antérieure a vérifié que la surexpression du miR-326 diminuait la croissance tumorale in vivo [13]. Une étude a révélé que le miR-326 exprimé de manière ectopique atténue markedly la croissance cellulaire, et supprime la migration et l'invasivité cellulaire dans les lignées cellulaires de cancer du poumon non à petites cellules [22]. De plus, il a été trouvé que le miR-326 diminue les gènes profibrotiques comme MMP-9, impliquant sa fonction répressive dans la prolifération des cellules cancéreuses [23]. Aussi, il est présenté que le miR-326 réprime l'expression de la protéine Bcl-2 et élève l'expression de Bax afin d'affecter l'apoptose [24]. Similaire à nos résultats, il y a certains miARN interagissant avec les exosomes pour jouer un rôle dans le développement du CHC. Il est affiché que le miR-638 exosomal hautement exprimé peut réprimer la prolifération des cellules de CHC, impliquant l'impact potentiel sur la carcinogenèse [25]. Une autre étude prouve également que le miR-451a exosomal dérivé de cellules de CHC supprime l'angiogenèse tumorale via la perturbation des fonctions endothéliales comme l'apoptose, la formation de tubes, la migration et la perméabilité [26]. Une recherche antérieure confirme généralement que lorsqu'elles sont traitées avec la surexpression d'exosomes miR-744, la prolifération des cellules de CHC est dramatiquement supprimée [27].

Conclusion

Pour conclure brièvement, notre étude fournit des preuves que le miR-326 exosomal dérivé de macrophages M1 supprime la prolifération, la migration et l'invasion ainsi que favorise l'apoptose des cellules de CHC, fournissant un nouvel aperçu dans une nouvelle thérapie ciblée pour le CHC. En raison de la taille d'échantillon limitée et des recherches connues limitées, le mécanisme exact du miR-326 n'est pas pleinement élucidé, et par conséquent, d'autres études à grande échelle sont nécessaires pour illustrer le mécanisme sous-jacent.

Abréviations

CHC :

Carcinome hépatocellulaire

miARN :

MicroARN

SFB :

Sérum fœtal bovin

M/CSF :

Facteur stimulant les colonies de macrophages

PBS :

Tampon phosphate salin

DMEM :

Milieu de Dulbecco modifié Eagle

PPAR :

Récepteur activateur de prolifération des peroxysomes

MET :

Microscope électronique à transmission

NTA :

Analyse de suivi des nanoparticules

CN :

Contrôle négatif

RT-qPCR :

Réaction de polymérisation en chaîne par transcription inverse quantitative

BCA :

Acide bicinchonique

BSA :

Albumine sérique bovine

Exo :

Exosomes

ANOVA :

Analyse de variance unidirectionnelle