Les nanoparticules d'or modulent l'activité CYP3A4 et la toxicité cellulaire dans le carcinome hépatocellulaire humain : influence de la taille, chimie de surface et couronne protéique

Résumé

Nous avons étudié comment des nanoparticules d'or (AuNP) de 40 et 80 nm fonctionnalisées avec de la polyéthylèneimine branchée cationique (BPEI), de l'acide lipoïque anionique (LA) ou du polyéthylène glycol neutre (PEG) interagissent avec la lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire humain (CHC) C3A, en présence et en l'absence d'une couronne protéique de plasma humain (PC). Les AuNP nues, sauf les LA-AuNP de 80 nm, étaient cytotoxiques pour les cellules C3A, mais la PC atténuait significativement ces effets. L'absorption cellulaire dépendante du temps augmentait pour les BPEI-AuNP de 40 nm, tandis que la PC réduisait l'absorption des PEG-AuNP de 80 nm. Les BPEI-AuNP suscitaient des réponses de stress oxydatif/nitrosatif biphasiques, tandis que les PEG-AuNP agissaient comme un puissant antioxydant. Toutes les AuNP nues inhibaient l'activité CYP3A4 indépendamment de la taille ou de la charge de surface, mais la PC restaurait l'activité sauf pour les PEG-AuNP. Les PEG-AuNP de 40 nm induisaient des changements d'expression génique affectant principalement l'β-oxydation des acides gras mitochondriaux et, dans une moindre mesure, les transporteurs d'efflux/absorption hépatiques. Ces résultats approfondissent notre compréhension des interactions AuNP-cellules et leurs fondements moléculaires dans le CHC, offrant des perspectives pour des stratégies thérapeutiques améliorées.

Contexte

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) reste l'un des cancers les plus prévalents dans le monde et la cause de mortalité par cancer à la croissance la plus rapide aux États-Unis [1, 2]. Les options curatives actuelles — transplantation hépatique ou résection chirurgicale — sont limitées aux maladies de stade précoce, tandis que les tumeurs avancées reposent sur la chimiothérapie ou la radiothérapie, toutes deux souffrant de faible sélectivité et de toxicité systémique significative [3, 4]. Les thérapies de silencement génique, particulièrement l'interférence par ARN (ARNi), promettent une spécificité plus élevée, mais une délivrance efficace nécessite des vecteurs qui pénètrent les cellules cibles en toute sécurité. Bien que les vecteurs viraux offrent une efficacité de transduction élevée, les plateformes non virales telles que les nanoparticules (NP) sont préférées pour leur profil de sécurité et leurs propriétés physicochimiques ajustables [5-8]. Les nanoparticules d'or (AuNP) sont particulièrement attractives en raison de leur modification de surface aisée et de leurs caractéristiques optiques, permettant la délivrance ciblée de charges thérapeutiques [11, 12]. Cependant, en entrant dans la circulation sanguine, les AuNP acquièrent une couronne protéique (PC) qui altère leur chimie de surface et par conséquent leur destin biologique, incluant l'absorption cellulaire et la toxicité [13-17]. Comprendre comment la taille des NP, la charge de surface et la PC modulent les réponses cellulaires dans les cellules CHC est essentiel pour concevoir des nanomédecines sûres et efficaces.

Méthodes

Synthèse des nanoparticules d'or

Les AuNP de 40 et 80 nm étaient fabriquées sur mesure par nanoComposix (San Diego, CA). La fonctionnalisation avec BPEI, LA ou PEG était réalisée via chimie EDC, conjugaison d'acide dihydrolipoïque, ou PEGylation thiol-méthoxy, respectivement. La taille, l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta étaient confirmés par diffusion dynamique de la lumière (DLS), microscopie électronique à transmission (TEM) et spectroscopie UV-Vis. Les AuNP étaient purifiées par filtration tangentielle (TFF) et stérilisées par filtration.

Préparation de la couronne protéique

Le plasma humain (n=5) de Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) était mélangé avec les AuNP à 55 % (v/v) et incubé à 37 °C, 250 tr/min pendant 1 h. Les protéines faiblement liées étaient éliminées par lavages répétés au PBS (20 000 × g, 20 min). Les AuNP revêtues de PC résultantes étaient resuspendues dans PBS et ensuite diluées dans le milieu de culture cellulaire.

Caractérisation physicochimique des AuNP

Les diamètres hydrodynamiques (D_H), PDI et potentiel zêta des AuNP nues et revêtues de PC étaient mesurés dans l'eau DI, PBS et EMEM complet (10 % FBS) à 25 °C et 37 °C (0 et 24 h). Les spectres d'absorption optique étaient enregistrés à température ambiante.

Microscopie électronique à transmission

La morphologie des AuNP était évaluée par TEM (Tecnai G2 Spirit BioTWIN, 120 kV). Les échantillons étaient déposés sur des grilles de cuivre 200 mailles et séchés à l'air.

Culture cellulaire et mesure de viabilité

Les cellules C3A (ATCC CRL-10741) étaient cultivées en EMEM + 10 % FBS, ensemencées à 8 × 10⁴ cellules/puits (plaques 96 puits), et laissées adhérentes pendant 48 h avant le dosage. La viabilité était mesurée en utilisant l'essai alamarBlue® après 24 h d'exposition à des concentrations d'AuNP variant de 0 à 250 µg/cm².

Mesure de l'absorption cellulaire par ICP-MS

Les cellules étaient traitées avec 1,56 µg/cm² d'AuNP pendant 0,5-24 h. Après une étape de gravure pour éliminer les particules liées en surface, les cellules étaient digérées dans l'eau régale, et l'or intracellulaire était quantifié par ICP-MS. L'absorption était exprimée en AuNP par cellule.

Mesures de stress oxydatif/nitrosatif

La production de ROS/RNS était quantifiée en utilisant un kit d'essai ROS/SO total (Enzo Life Sciences) à 1, 3 et 24 h suivant l'exposition aux BPEI- et PEG-AuNP de 40 nm jusqu'à 125 µg/cm².

Activité du cytochrome P450 3A4

L'activité CYP3A4 était évaluée avec l'essai P450-Glo™ (Promega) après 24 h d'exposition aux concentrations LC₅₀ de chaque type d'AuNP. La luminescence était normalisée aux témoins véhicule.

Profilage d'expression génique

Donnant les effets prononcés des PEG-AuNP de 40 nm, les cellules C3A étaient exposées à sa LC₅₀ (129,5 µg/cm²) pendant 24 h. L'ARN total (RIN ≥ 7,8) était isolé, rétro-transcrit, et analysé par les réseaux PCR Human Molecular Toxicology Pathway Finder et Human Drug Transporters RT² Profiler™ (Qiagen). Les gènes différemment exprimés (|changement de pli| > 2, p < 0,05) étaient validés par qRT-PCR pour neuf gènes représentatifs.

Analyse statistique

Les valeurs LC₅₀ étaient ajustées en utilisant une équation de Hill à pente variable dans GraphPad Prism. L'ANOVA à un sens (SAS 9.4) suivie du test HSD de Tukey évaluait la signification (p < 0,05).

Résultats et discussion

Caractérisation physicochimique des AuNP nues et revêtues de PC

Comme montré dans la Figure 1, la TEM confirmait des AuNP monodisperses avec des tailles correspondant aux 40 et 80 nm nominaux. La formation de PC induisait une augmentation modeste de D_H et un décalage vers le rouge du pic plasmon UV-Vis, indiquant l'adsorption de protéines. Dans l'EMEM complet, D_H et PDI restaient stables pendant 24 h, sauf pour les PC-BPEI-AuNP, qui affichaient une diminution transitoire de PDI, suggérant une stabilité colloïdale améliorée. Les potentiels zêta se déplaçaient vers des valeurs neutres lors du revêtement PC, reflétant le masquage des charges de surface par les protéines.

Micrographies électroniques à transmission de (a) AuNP nues dans l'eau DI et (b) PC-AuNP dans PBS à 0 h, 25 °C. Spectres UV-Vis et distributions DLS en encart. Flèches indiquent la formation de PC. PC : couronne protéique de plasma humain ; BPEI : polyéthylèneimine branchée ; LA : acide lipoïque ; PEG : polyéthylène glycol.

Cytotoxicité des AuNP

Les valeurs LC₅₀ pour les AuNP nues variaient de 127,3 à 205,5 µg/cm² (Figure 2a). Tous les BPEI-, LA- et PEG-AuNP de 40 nm, ainsi que les BPEI-AuNP de 80 nm, étaient cytotoxiques, alors que les LA-AuNP de 80 nm ne montraient pas de toxicité significative. La PC réduisait nettement la cytotoxicité à travers la plupart des types d'AuNP, à l'exception des BPEI-AuNP de 80 nm, qui retenaient 51 % de viabilité à 250 µg/cm² (Figure 2b). Ces résultats s'alignent avec les travaux antérieurs montrant l'atténuation de la toxicité des AuNP médiatisée par PC dans les hépatocytes primaires et d'autres lignées cellulaires [7-9].

Viabilité C3A et valeurs LC₅₀ pour (a) AuNP nues et (b) AuNP revêtues de PC. Données représentent moyenne ± É.T. (n = 3). PC : couronne protéique de plasma humain ; ND : non déterminé ; BPEI : polyéthylèneimine branchée ; LA : acide lipoïque ; PEG : polyéthylène glycol ; LC₅₀ : concentration médiane létale.

Absorption intracellulaire des AuNP

Les analyses d'absorption dépendantes du temps (Figure 3) révélaient que les BPEI-AuNP de 40 nm s'accumulaient rapidement, culminant à 6 h avant de décliner. En contraste, la PC atténuait l'absorption des BPEI- et LA-AuNP de 40 et 80 nm mais améliorait l'internalisation des PEG-AuNP de 80 nm. Ces tendances sont cohérentes avec la littérature indiquant que la PC peut soit entraver soit promouvoir l'entrée des NP selon la taille des NP, la chimie de surface et le type cellulaire [8, 9, 33].

Absorption cellulaire dépendante du temps des (a) BPEI-, (b) LA-, et (c) PEG-AuNP de 40 nm, et (d) BPEI-, (e) LA-, et (f) PEG-AuNP de 80 nm en l'absence et présence de PC. Données représentent moyenne ± É.T. (n = 3). Lettres indiquent différences significatives (HSD de Tukey, p < 0,05). PC : couronne protéique de plasma humain.

Mesures de stress oxydatif et nitrosatif

Les deux types d'AuNP induisaient ROS/RNS de manière dépendante du temps et de la concentration (p < 0,0001). Les hautes concentrations de BPEI-AuNP de 40 nm produisaient une réponse biphasique : un effet antioxydant initial à 1 h, suivi par un pic pro-oxydant prononcé à 3 h et au-delà. En contraste, les PEG-AuNP de 40 nm supprimaient constamment la production de ROS/RNS (changement de pli < 0,5) à tous les points temporels, suggérant un rôle antioxydant protecteur (Figure 4).

Production de ROS/RNS dépendante du temps et de la concentration dans les cellules C3A exposées aux (a) BPEI-AuNP de 40 nm et (b) PEG-AuNP de 40 nm jusqu'à 24 h. Données représentent moyenne ± É.T. (n = 3). Différences significatives marquées par astérisques (HSD de Tukey, p < 0,05).

Mesure de l'activité CYP3A4

Toutes les AuNP nues (40 et 80 nm BPEI, LA et PEG) inhibaient l'activité CYP3A4 à 20-31 % des niveaux témoins aux concentrations LC₅₀ (Figure 5). Les concentrations non toxiques de LA- et PEG-AuNP de 80 nm supprimaient aussi l'activité (~30 %). La PC restaurait largement l'activité CYP3A4 pour toutes les AuNP sauf pour les PEG-AuNP, qui retenaient 63 % et 46 % d'activité pour les particules de 40 et 80 nm, respectivement. Ces résultats corroborent les rapports antérieurs d'inhibition de CYP3A4 médiatisée par AuNP via interaction directe avec l'enzyme ou blocage de la poche de substrat [7, 25].

Effet inhibiteur des AuNP sur l'activité CYP3A4 dans les cellules C3A après 24 h d'exposition aux BPEI-, LA- et PEG-AuNP de 40 et 80 nm, avec et sans PC. Valeurs représentent moyenne ± É.T. (n = 3). PC : couronne protéique de plasma humain.

Profilage d'expression génique axé sur les voies de toxicité des PEG-AuNP de 40 nm

L'analyse de réseau génique a identifié 212 gènes différemment exprimés (186 sous-régulés, 26 sur-régulés) à la LC₅₀ des PEG-AuNP de 40 nm (Figure 6). Notamment, 12,3 % de ces gènes impliquaient l'β-oxydation des acides gras mitochondriaux, avec des enzymes clés (ACAD11, ACAD9, ACADM, ACADS, ACAA1, ACAA2, DECR1, ECHS1, EHHADH, HADHA) marquément supprimées (changement de pli 2-18). La sous-régulation des enzymes d'β-oxydation indique une production altérée de NADH/FADH₂, compromettant le cycle de Krebs et la synthèse d'ATP, une signature de dysfonction mitochondriale observée dans les hépatocytes traités aux AuNP [7-9].

Gènes représentatifs impliqués dans (a) l'β-oxydation des acides gras mitochondriaux, (b) l'apoptose, (c) les réponses au stress oxydatif/antioxydant, et (d) les transporteurs d'absorption/efflux hépatiques à la LC₅₀ des PEG-AuNP de 40 nm. Changement de pli < -2 ou > 2, p < 0,05.

Les gènes d'apoptose (CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A/B, TNFSF10) étaient sur-régulés, alors que les gènes anti-apoptotiques (AKT1, BCL2, MCL1, XIAP) étaient sous-régulés, cohérent avec la cytotoxicité dose-dépendante observée. Les points de contrôle de dommage et réparation de l'ADN (CHEK1/2, ERCC1/2/3, LIG4) montraient une régulation mixte, suggérant une intégrité génomique altérée. Les protéines de choc thermique (HSPA1A/B) étaient sur-régulées, tandis que les sous-familles HSP40/90/60 étaient sous-régulées, reflétant une réponse au stress complexe. Les gènes antioxydants (GPX1/2/4, PRDX1/2/6, SOD1, CAT) étaient induits, alors que les gènes pro-oxydants (TXNIP, PPP1R15B) étaient supprimés, s'alignant avec le phénotype antioxydant des PEG-AuNP.

Profilage d'expression génique des transporteurs d'absorption et d'efflux de médicaments

Représentation schématique des mécanismes clés par lesquels les PEG-AuNP de 40 nm modulent l'activité CYP3A4, l'β-oxydation mitochondriale et l'expression des transporteurs de médicaments dans les cellules CHC. Barres vertes (inhibition) et triangles roses (induction) indiquent la direction du changement.

La validation PCR en temps réel de neuf gènes sélectionnés a confirmé les résultats du réseau, renforçant la fiabilité des données transcriptionnelles.

Conclusions

Cette étude démontre que la chimie de surface des AuNP et la présence d'une couronne protéique de plasma humain dictent critique leur cytotoxicité, absorption cellulaire, profil de stress oxydatif, inhibition de CYP3A4 et changements d'expression génique dans les cellules CHC C3A. Les BPEI- et LA-AuNP nues étaient hautement cytotoxiques, alors que les PEG-AuNP présentaient des propriétés antioxydantes mais supprimaient encore l'activité CYP3A4. La PC atténuait largement la toxicité et l'inhibition de CYP3A4, sauf pour les PEG-AuNP, qui retenaient des effets significatifs. L'analyse d'expression génique des PEG-AuNP de 40 nm a révélé une sous-régulation prédominante des enzymes d'β-oxydation des acides gras mitochondriaux, une sur-régulation des gènes pro-apoptotiques, et une modulation extensive des transporteurs de médicaments, fournissant un aperçu des mécanismes potentiels d'hépatotoxicité et d'interactions médicament-nanoparticules. Ces résultats soulignent l'importance de considérer la formation de couronne protéique et la fonctionnalisation de surface lors de la conception de thérapeutiques basées sur AuNP pour le CHC.

Abréviations

ANOVA:

Analyse de variance à un sens

AuNP:

Nanoparticules d'or nues : sans PC

BPEI:

Polyéthylèneimine branchée

CYP:

Cytochrome P450

D_H:

Diamètres hydrodynamiques

DLS:

Diffusion dynamique de la lumière

EDTA:

Acide éthylènediaminetétraacétique

EMEM:

Milieu essentiel minimum d'Eagle

HCC:

Carcinome hépatocellulaire humain

HPTC:

Cellules tubulaires proximales rénales humaines

HSD:

Différence significative honnête de Tukey

HUVEC:

Cellules de veine ombilicale humaine

ICP-MS:

Spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif

LA:

Acide lipoïque anionique

LC₅₀:

Concentration médiane létale

MDR:

Résistance multidrogues

NP:

Nanoparticules

PBS:

Tampon phosphate salin

PC:

Couronne protéique de plasma humain

PDI:

Indice de polydispersité

PEG:

Polyéthylène glycol neutre

RNAi:

Interférence par ARN

RNS:

Espèces réactives de l'azote

ROS:

Espèces réactives de l'oxygène

SO:

Superoxyde

TEM:

Microscopie électronique à transmission

TFF:

Filtration tangentielle

Nanoposonde double mode IRM/Fluorescence cRGD-Gd-Cy5.5 pour l'imagerie ciblée des tumeurs positives à l'intégrine αvβ3 Hémostase hépatique rapide par fibres de colle médicale électrofilées avec champ électrique renforcé