Étude des ESP et de l'arrêt du cycle cellulaire dans les effets génotoxiques des nanostructures cœur or/enveloppe argent

Résumé

Pour comprendre la génotoxicité induite dans le foie par les nanoparticules d'argent (AgNPs) et les ions argent, une nanostructure cœur nanobâtonnet or/enveloppe argent (Au@Ag NR) conçue et des cellules hépatiques humaines HepaRG humanisées ont été utilisées dans cette étude. L'implication du stress oxydatif et de l'arrêt du cycle cellulaire dans les dommages à l'ADN et aux chromosomes induits par 0,4-20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR a été étudiée par test de comète, essai γ-H2AX et test des micronoyaux. De plus, la distribution des Au@Ag NR a été analysée. Nos résultats ont démontré que tanto les Ag⁺ que les Au@Ag NR ont entraîné une clivage de l'ADN et des dommages chromosomiques (clastogénicité) dans les cellules HepaRG et que les Au@Ag NR retenus dans le noyau peuvent libérer davantage d'Ag⁺, aggravant les dommages, qui sont principalement causés par l'arrêt du cycle cellulaire et la formation d'ESP. Les résultats révèlent la corrélation entre l'accumulation intracellulaire, la libération d'ions Ag⁺ et la génotoxicité potentielle des AgNPs.

Introduction

Les nanoparticules d'argent (AgNPs), de 1 à 100 nm de taille, peuvent exhiber un large spectre de propriétés antimicrobiennes en pénétrant les agents pathogènes et en inactivant le groupe sulfhydryle interne de leurs enzymes métaboliques [1]. Elles ont démontré des effets bactériostatiques et bactéricides puissants sur Escherichia Coli, Neisseria gonorrhoeae et Chlamydia trachomatis, et sont largement employées comme revêtements médicaux, produits ménagers [2] ainsi que pansements pour plaies [3]. Des preuves convaincantes montrent que les nanoparticules sont capables d'entrer dans le noyau et d'interférer avec le processus de synthèse et de transcription de l'ADN [4]. Dans notre étude précédente, nous avons rapporté qu'une dose unique intraveineuse de 5 mg/kg d'AgNPs pouvait introduire une rupture chromosomique remarquable dans les cellules de moelle osseuse de rats Sprague-Dawley [5]. Une injection intrapéritonéale unique de 10 mg/kg ou plus d'AgNPs a induit à la fois des dommages à l'ADN et aux chromosomes [6]. Flower et al. [7] ont suggéré que les AgNPs à des doses de 50 et 100 μg mL⁻¹ pouvaient déclencher des dommages à l'ADN dans les cinq minutes suivant l'administration, soulignant la génotoxicité de l'argent (Ag) libéré rapidement. Considérant le risque d'exposition excessive, l'étude de la nanogénotoxicologie ou les dommages à l'ADN et le potentiel cancérigène des nanomatériaux conçus a reçu beaucoup d'attention [8].

Les mécanismes majeurs pour les blessures génétiques induites par les AgNPs sont considérés comme la surproduction d'espèces réactives de l'oxygène, l'inflammation, et la perturbation du cycle cellulaire [9, 10]. Comme suggéré dans des études précédentes, les AgNPs pourraient soit interagir directement avec l'ADN via des dommages oxydatifs [11] et interférer dans l'interphase au niveau de l'ADN et la mitose au niveau chromosomique, soit interagir avec la nucléoprotéine et l'appareil du fuseau mitotique pour perturber les points de contrôle du cycle cellulaire [12]. Cependant, si la génotoxicité induite par les AgNPs est partiellement attribuable aux nanoparticules [13, 14] ou complètement aux ions Ag⁺ libérés n'est toujours pas clair [15, 16].

L'étude de la génotoxicité des AgNPs est difficile en raison de la libération instable et ininterrompue de l'argent dans les tissus, entraînant des difficultés à localiser les AgNPs et à différencier le nanocœur de l'Ag. Notre groupe a récemment développé une nanostructure cœur nanobâtonnet or/enveloppe argent (Au@Ag NR) pour étudier la toxicité induite par les nanoparticules [17]. Le cœur d'or des Au@Ag NR est physiologiquement inerte dans le tissu et pourrait être utilisé comme standard interne pour surveiller la libération d'ions Ag⁺ de la tige en surveillant le changement du rapport Ag/Au, mesuré par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) [18]. Par cette méthode, les différentes origines des toxicités peuvent être identifiées. Des études précédentes ont montré que les ions Ag⁺ libérés de l'enveloppe des Au@Ag NR ont entraîné des dommages oxydatifs rénaux et ont finalement conduit à des changements morphologiques et à une altération de la fonction de filtration du glomérule [19]. Jiang et al. [20] ont suggéré que l'activité spécifique aux particules et la libération intracellulaire d'ions argent par les Au@Ag NR contribuent à la réponse toxique des cellules de la granulosa. Nous avons également adopté les Au@Ag NR comme modèle pour étudier le potentiel de génotoxicité in vivo des AgNPs et démontré que la clastogénicité, et non la mutagénicité, est la forme primaire de génotoxicité induite par tanto l'enveloppe Ag que les ions Ag⁺ libérés, tandis qu'il n'y avait pas de différence dans leurs modèles de toxicité [21].

Le foie est l'un des organes majeurs sujets à l'accumulation d'AgNPs et est reconnu comme un organe/cible/tissu pour la génotoxicité induite par les AgNPs. Notre étude précédente a montré qu'une certaine quantité d'argent (8,26 ± 3,90 μg/g) et d'or (80,07 ± 64,72 μg/g) restait dans les foies de rats SD huit semaines après l'administration intraveineuse d'une dose d'Au@Ag NR [21]. Dans cette étude, nous avons tenté d'identifier les rôles de l'arrêt du cycle cellulaire et du stress oxydatif réactif sur les dommages aux chromosomes et à l'ADN induits par les AgNPs en utilisant les Au@Ag NR dans les cellules HepaRG dérivées d'hépatome humain. Des essais de génotoxicité, y compris le test de comète, l'essai γ-H2AX et le test des micronoyaux, ont été réalisés en parallèle avec un piégeur de radicaux oxydatifs pour sonder la contribution des espèces réactives de l'oxygène (ESP) dans les dommages à l'ADN/chromosomes, tandis que l'apoptose cellulaire, le cycle cellulaire et les protéines associées ont été déterminés pour explorer les mécanismes par lesquels les AgNPs interrompent la synthèse et la réplication de l'ADN. De plus, l'accumulation et la distribution intracellulaires des Au@Ag NR ont été étudiées en combinant la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) et la microscopie électronique à transmission (MET) pour différencier le rôle des nanoparticules et des ions Ag libérés.

Matériaux et méthodes

Culture cellulaire et traitement

La lignée cellulaire d'hépatome humain HepaRG (Thermo Fisher Scientific) a été utilisée dans cette étude. Les cellules ont été cultivées dans le RPMI 1640 contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS, origine Australie, Gibco) et 1 % de solution pénicilline-streptomycine-glutamine (Gibco) dans une atmosphère humidifiée de 5 % CO₂ à 37 °C. Les cellules ont été traitées avec des concentrations croissantes d'Au@Ag NR pendant 24 h ou 72 h, respectivement, et les concentrations ont été déterminées conformément à l'IC₅₀ estimé par essai de viabilité cellulaire. Pour étudier le rôle des ESP dans la génotoxicité, 1 mM de N-Acétyl-L-cystéine (NAC, Sigma-Aldrich) a été appliqué pendant 1 h avant le traitement avec les Au@Ag NR.

Essai de viabilité/croissance cellulaire ATP

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 5 × 10³/puits. Après 24 h d'incubation, le milieu a été aspiré et les cellules ont été exposées à différentes concentrations d'Au@Ag NR pendant 24 h ou 48 h, respectivement. Un large spectre de concentrations a été préparé, et quatre puits par traitement ont été effectués dans une période de traitement. La cytotoxicité des Au@Ag NR a été examinée par essai d'adénosine triphosphate (ATP) (CellTiter-Glo® 2.0 Assay, Promega), qui mesure l'activité métabolique cellulaire en quantifiant la quantité d'ATP, un paramètre métabolique important dans les cellules viables. Les signaux luminescents, qui reflètent les quantités de cellules viables, ont été détectés en utilisant le lecteur de plaques VICTOR Multilabel (2030-0050, PerkinElmer), et les valeurs IC₅₀ ont été estimées comme la concentration d'Au@Ag NR pour une viabilité demi-maximale par Prism 7 (GraphPad Prism 7, CA, USA). Le ratio de viabilité est calculé en utilisant l'équation suivante :

$${\text{Viabilité}}\,{\text{Ratio}}\,\left( \% \right) = {\text{RLU}}_{{{\text{sample}}}} /{\text{RLU}}_{{{\text{vehicle}}}} \times {1}00\%$$

où RLU est l'unité de lumière relative représentée comme la valeur moyenne de quatre puits, RLU_vehicle représentait les cellules non traitées avec les nanobâtonnets, et RLU_sample représentait les cellules qui ont été traitées avec différentes concentrations d'Au@Ag NR.

Détermination de la concentration d'argent et d'or dans les cellules

Les échantillons cellulaires ont été digérés dans l'acide nitrique en utilisant le système de digestion par micro-ondes. Après la digestion, les échantillons ont été préparés avec un mélange contenant 1 % d'acide nitrique et d'acide chlorhydrique. Les quantités d'Ag et d'Au dans les solutions ont été déterminées par ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer). L'analyse MET a été utilisée pour déterminer la présence de NR Au et Au@Ag NR dans la cellule. Les échantillons cellulaires ont été fixés dans un mélange de 2,5 % de glutaraldéhyde et 2 % de paraformaldéhyde pendant 2 h à 4 °C. Les culots cellulaires ont été fixés et rincés trois fois dans le tampon phosphate (pH 7,4) et post-fixés dans 1 % de tétroxyde d'osmium pendant 2 h à 4 °C. Les échantillons ont été ensuite rincés dans l'eau distillée trois fois et déshydratés pendant 15 min dans différentes concentrations d'éthanol (50 %, 70 %, 90 % et 100 % d'éthanol, respectivement) l'un après l'autre. Subséquemment, l'oxyde de propylène à des dilutions 1:1 et 1:3 a été appliqué à la résine à 20-26 °C pendant 2 h. La polymérisation a été effectuée par chauffage progressif à 35 °C pendant 16 h, 45 °C pendant 8 h, 55 °C pendant 14 h et 65 °C pendant 48 h. Des sections ultrafines ont été colorées pendant 25 min avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb et analysées par un microscope électronique à transmission (H-7650, HITACHI, Japon).

Test de comète conventionnel et modifié

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits à des densités de 2 × 10⁵/puits ou 3 × 10⁵/puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. Le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) à une concentration de 200 μmol a été exposé aux cellules comme contrôle positif pendant une heure. Pour chaque échantillon, deux puits ont été préparés pour le traitement conventionnel et le traitement par la formamidopyrimidine glycosylase (Fpg). Le test de comète conventionnel a été effectué dans des conditions alcalines (pH > 13) comme décrit précédemment [21]. Pour les puits traités par Fpg, un traitement Fpg supplémentaire a été appliqué avant la procédure de dévidage de l'ADN, et les lames ont été immergées dans un tampon enzymatique (0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0,2 mg.mL⁻¹ BSA) trois fois pendant 5 min chacune. Le Fpg (New England Biolabs, Inc., UK) a été dilué à 1:50 000 avec le tampon enzymatique. Cent millilitres d'aliquotes de l'enzyme diluée ont été ajoutés à chaque gel sur les lames de microscope et incubés dans une chambre d'humidité à 37 °C pendant 30 min. Les étapes restantes étaient les mêmes que le traitement conventionnel. Les tests de comète ont été effectués en triplicat. Au moins 50 cellules par échantillon ont été notées indépendamment en utilisant le microscope à fluorescence Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokyo, Japon), tandis que Komet 6.0 (Andor Technology, Belfast, UK) a été utilisé pour analyser la valeur médiane du pourcentage d'ADN dans la queue et le moment de queue d'olive (OTM) de chaque échantillon.

Qualification des foyers γ-H2AX par cytométrie de flux et criblage à haut contenu

Pour la quantification par cytométrie de flux, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits à des densités de 2 × 10⁵/puits ou 3 × 10⁵/puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement, tandis que pour l'essai de criblage à haut contenu, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à des densités de 6 × 10³/puits ou 1 × 10⁴/puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. Comme contrôle positif, 2 μM de méthane sulfonate de méthyle (MMS, Sigma-Aldrich) a été appliqué en parallèle avec les cellules pendant une heure. Les cellules ont été rincées dans le tampon salin tamponné Tris (TBS) et fixées avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 min à température ambiante. Après lavage avec TBS, les cellules ont été incubées avec 50 μL de méthanol froid à glace pendant 30 min à −20 °C. Les cellules ont été davantage rincées dans TBS trois fois, et le réactif de blocage (TBS contenant 0,3 % Triton X-100 et 10 % de sérum de chèvre) a été appliqué pendant 1 h. L'anticorps primaire (anti-phospho-H2AX Ser139 souris, Millipore) a été dilué à 1:200 avec le réactif de blocage et incubé avec les cellules pendant la nuit à 4 °C. La plaque a été à nouveau rincée avec TBS trois fois, et l'anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris, Life Technologies), dilué avec le réactif de blocage dans un rapport 1:20, a été ajouté subséquemment. Les échantillons ont été maintenus dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 h, et 2 μg mL⁻¹ (20 μL/puits) DAPI (Invitrogen) a été ajouté à chaque puits. La fluorescence a été mesurée en utilisant une cytométrie de flux (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) ou un système d'analyse à haut contenu (Operetta CLS, PerkinElmer). Pour l'essai de cytométrie de flux, les données d'au moins 10 000 cellules par groupe ont été analysées, et les expériences ont été effectuées en triplicat ; pour l'analyse à haut contenu, 20 champs visuels dans chaque puits et au moins cinq puits dans chaque groupe ont été analysés.

Essai cytomique des micronoyaux avec blocage de la cytokinèse (CBMN-cyt)

Le CBMN-cyt a été effectué selon la procédure décrite par Fenech et al. [22]. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits à des densités de 2 × 10⁵/puits ou 3 × 10⁵/puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. 0,2 μg mL⁻¹ de Mitomycine C (MMC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Japon) a été exposé aux cellules comme contrôle positif pendant 24 h. 3 μg mL⁻¹ de cytochalasine B a été appliqué après un traitement de 24 ou 72 h pour bloquer le processus de cytokinèse, et les cellules ont été récoltées après 40 h. Les échantillons ont été colorés avec 5 % de Giemsa après hypotonie avec du KCl 0,075 mol L⁻¹ préchauffé et fixation avec un mélange 3:1 de méthanol et d'acide acétique. Trois puits par groupe ont été préparés, et au moins 1000 cellules binucléées par puits ont été examinées.

Mesure des teneurs en MDA, GSH total et SOD

Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 12 puits à des densités de 5 × 10⁵/puits ou 3 × 10⁵/puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. Subséquemment, les cellules ont été récoltées et rincées trois fois avec du tampon phosphate salin (PBS). Les quantités de malondialdéhyde (MDA) dans les homogénats cellulaires ont été déterminées en utilisant une méthode basée sur l'acide thiobarbiturique (Nanjing Jiancheng Bio-engineering Institute, Nanjing, Chine). Les quantités de glutathione total (GSH) et de superoxyde dismutase (SOD) ont été déterminées en utilisant les kits de quantification du glutathione total et d'essai SOD (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kumamoto, Japon), respectivement. Les densités optiques (O.D) de chaque puits ont été mesurées en utilisant le lecteur de plaques VICTOR Multilabel (2030-0050, PerkinElmer).

Analyse cytométrique de flux pour le cycle cellulaire

Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 6 puits à des densités de 1 × 10⁶/puits ou 5 × 10⁵/puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement, et ont été ensuite fixées avec 70 % d'éthanol à 4 °C pendant la nuit. Les échantillons ont été rincés avec PBS trois fois et colorés avec le tampon de coloration PI/Rnase (BD Biosciences) pendant 15 min à température ambiante. Les populations cellulaires sous les phases G0/G1, S et G2/M parmi 20 000 cellules ont été déterminées en utilisant des régions avec la zone FL2 versus largeur FL2. L'analyse a été faite par cytométrie de flux (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) et FlowJo (BD Bioscience), et les expériences ont été effectuées en triplicat.

Analyse cytométrique de flux de l'apoptose cellulaire

Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 6 puits à des densités de 1 × 10⁶/puits ou 5 × 10⁵/puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. Elles ont été ensuite rincées deux fois avec PBS et diluées avec 500 μL de tampon de liaison 1 × (Kit de détection d'apoptose FITC Annexin V I, BD Bioscience) pour ajuster la suspension à environ 1 × 10⁶ cellules/mL, et subséquemment 100 μL de dilution a été mélangé avec 5 µL FITC Annexin V et 5 µL PI. Les échantillons ont été colorés à température ambiante pendant 15 min, et au moins 10 000 cellules ont été analysées pour déterminer la population cellulaire sous apoptose précoce et tardive en utilisant des régions avec FL1H versus FL2H en utilisant la cytométrie de flux (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) et FlowJo (BD Bioscience). Les expériences ont été effectuées en triplicat.

Analyse par Western blot

Les cellules ont été cultivées dans un flacon de 75 cm² à des densités de 1 × 10⁷/puits et 6 × 10⁶/puits pour un traitement de 24 et 72 h, respectivement. Les cellules ont été lysées avec un tampon de lyse RIPA contenant un inhibiteur de protéase (PMSF), et la concentration des protéines a été déterminée en utilisant un kit de quantification de protéines BCA (Beyotime Biotechnology, Chine). Les concentrations des échantillons ont été ajustées en utilisant le tampon de lyse RIPA avant dénaturation par chauffage à 95 °C pendant 3 min. Les échantillons de protéines ont été séparés par électrophorèse sur gels de polyacrylamide SDS 12 % et transférés sur des membranes de nitrocellulose (Millipore). Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé pendant 30 min et incubées avec les anticorps primaires p53 (SC-137174, Santa Cruz), p21 (SC-6246, Santa Cruz) et β-actine (sc-47778, Santa Cruz) et anticorps secondaires chèvre anti-souris IgG(H+L)-HRP (SE131, solabio), respectivement. Les niveaux d'expression des protéines cibles dans les échantillons ont été visualisés en utilisant une méthode de chimiluminescence améliorée (ECL) et analysés par le système ImageJ (National Institutes of Health).

Analyses statistiques

Les données ont été présentées comme la moyenne ± SEM. Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) a été utilisée pour tester la signification statistique des différences entre le contrôle négatif et les groupes traités, suivie par le test de comparaison multiple de Dunnett en utilisant SPSS (version 22, IBM, Armonk, NY, USA), et les données ont été considérées comme statistiquement significatives à P < 0,05. Les figures ont été préparées en utilisant GraphPad Prism 7 pour Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Résultats

Caractérisation des Au NR et Au@Ag NR

Les nanobâtonnets d'or (Au NRs), les cœurs de nanobâtonnets d'or et les nanostructures enveloppe argent (Au@Ag NR) ont été conçus, préparés et caractérisés comme décrit précédemment [21]. Brièvement, les diamètres et longueurs moyens sont de 15,0 ± 2,5 nm, 66,7 ± 2,5 nm pour les Au NRs et 26,2 ± 3,0 nm, 72,7 ± 8,9 nm pour les Au@Ag NRs. L'épaisseur de l'enveloppe Ag est d'environ 5 nm. Les potentiels zêta des Au NRs et Au@Ag NRs enrobés de PDDAC dispersés dans l'eau étaient de 37,7 ± 1,6 mV et 52,5 ± 1,4 mV, respectivement. Le rapport de poids Ag/Au des Au@Ag NR préparés a été estimé à 2,3. Les résultats de caractérisation sont montrés dans Fig. 1.

Viabilité cellulaire

La cytotoxicité des Au@Ag NR envers les cellules HepaRG a été étudiée par essai de viabilité ATP (Tableau 1), et les cellules ont été exposées aux Au@Ag NR pendant 24 ou 48 h à des concentrations variant de 0,125 à 160 μg mL⁻¹. Les Au@Ag NR ont induit des effets cytotoxiques significatifs de manière à la fois temps- et dose-dépendante après une exposition de 24 et 48 h, avec un % de viabilité IC₅₀ à 20 µg mL⁻¹ et 6 µg mL⁻¹, ajustés par le logiciel GraphPad Prism 7.0, respectivement. En considérant la cytotoxicité globale, les périodes de traitement ont été ajustées à 24 h et 72 h, tandis que les concentrations appliquées ont été déterminées à 0,8 µg mL⁻¹, 4 µg mL⁻¹ et 20 µg mL⁻¹. En plus, les Au NR ont été inclus comme contrôle inerte, et la teneur en Au dans le groupe Au NR était la même que 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR, ce qui est 16 µg mL⁻¹. En contraste, 1 mM de prétraitement NAC a été adopté dans le groupe Au@Ag NR + NAC comme contrôle pour la réponse au stress oxydatif (la concentration d'Au@Ag NR est 20 µg mL⁻¹).

Distribution cellulaire des Au NR et Au@Ag NR

La distribution de la teneur en Au et Ag dans les cellules HepaRG a été analysée par ICP-MS. Comme montré dans les Tableaux 2 et 3, la teneur en Ag augmentait de manière dose-dépendante. Cependant, l'antioxydant N-Acétyl-L-cystéine (NAC) comme piégeur de radicaux libres peut restreindre l'absorption cellulaire des nanoparticules, car une teneur en Ag moindre a été observée même si la même concentration d'Au@Ag NR (20 µg mL⁻¹) a été appliquée dans ce groupe. La diminution du rapport Ag/Au de 24 à 72 h indiquait une libération continue d'Ag⁺ de l'enveloppe des Au@Ag NR. De plus, l'absorption cellulaire d'Ag est beaucoup plus importante que celle d'Au (Tableau 4). De plus, les données MET ont montré que la plupart des Au NR et Au@Ag NR étaient retenus dans les cellules sous forme d'agrégats. Les structures de nanobâtonnets étaient clairement visibles à l'intérieur des cellules soumises à l'exposition aux Au NR ou Au@Ag NR sans entrer dans le noyau (Fig. 2).

Dommages à l'ADN

Les dommages à l'ADN déclenchés par les Au@Ag NR ont été évalués par le test de comète et l'essai γH2AX (Fig. 3). Il a été observé du test de comète que 0,8 à 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR pouvaient introduire des dommages significatifs à l'ADN. Après une exposition de 24 ou 72 h aux Au@Ag NR, tanto le % d'ADN dans la queue que l'OTM des cellules augmentaient de manière à la fois temps- et concentration-dépendante. De plus, les dommages à l'ADN associés à l'induction du stress oxydatif ont été observés dans les cellules traitées avec 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR par le test de comète modifié par l'enzyme Fpg (Fig. 3a, b). Pour évaluer l'étendue de la rupture double brin qui représente une corrélation plus élevée avec la genèse du cancer, tanto les cellules positives γ-H2AX que les intensités de fluorescence moyennes dans les cellules positives γ-H2AX ont été analysées. Après une exposition de 24 h aux Au@Ag NR, aucune différence n'a été trouvée entre les groupes dans les cellules positives γ-H2AX. Cependant, le groupe 4 μg mL⁻¹ Au@Ag NR a causé une augmentation significative après un traitement de 72 h. Des augmentations significatives des intensités de fluorescence ont été observées dans tous les groupes Au@Ag NR après 72 h par rapport au contrôle véhicule (Fig. 3c-e, P < 0,05).

Dommages chromosomiques

La formation de micronoyaux est un biomarqueur significatif pour identifier les dommages chromosomiques, qui sont des dommages plus critiques au matériel génétique que la rupture de l'ADN. Le ratio de cellules binucléées contenant des micronoyaux a été noté comme montré dans Fig. 4c. Les Au@Ag NR ont augmenté la formation de micronoyaux selon un patron concentration-dépendant. Après une exposition de 24 h, les ratios de micronoyaux observés dans les cellules traitées avec 4 μg mL⁻¹ Au@Ag NR et 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR étaient de 1,133 ± 0,145 % et 1,567 ± 0,318 %, respectivement, les deux étant significativement plus élevés que ceux dans le groupe contrôle véhicule. Après une exposition de 72 h, le ratio de micronoyaux dans les cellules traitées avec 4 μg mL⁻¹ Au@Ag NR était de 1,767 ± 0,233 %, ce qui était significativement plus élevé que le groupe contrôle véhicule ; le ratio de micronoyaux dans les cellules traitées avec 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR était de 2,167 ± 0,252 %, ce qui était significativement plus élevé que ceux observés dans tanto le groupe contrôle véhicule que le groupe 16 μg mL⁻¹ Au NR (0,700 ± 0,153 %). En contraste, aucune différence n'a été trouvée entre les cellules traitées avec 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR + NAC et le contrôle véhicule, suggérant la participation des ESP dans la rupture chromosomique induite par les Au@Ag NR.

Effets des Au@Ag NR sur la formation d'ESP

Pour explorer davantage le rôle de la formation d'ESP dans les dommages à l'ADN et aux chromosomes induits par les Au@Ag NR, les niveaux de MDA, GSH et SOD ont été estimés. Une augmentation significative de la formation de MDA (P < 0,05) a été observée après exposition à 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR pour tanto 24 que 72 h (Fig. 5a). De plus, les niveaux de GSH et SOD dans les cellules exposées aux Au@Ag NR ont montré une réduction significative (P < 0,05) de manière temps- et concentration-dépendante. Ces résultats suggèrent un déséquilibre entre l'oxydation et l'anti-oxydation, généré par l'exposition aux Au@Ag NR (Fig. 5b, c).

Effets des Au@Ag NR sur le cycle cellulaire et l'apoptose

Après une exposition de 72 h aux Au@Ag NR, l'augmentation du nombre de cellules en phase G2/M a été observée dans les groupes 4 μg mL⁻¹ Au@Ag NR, 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR et Au@Ag NR + NAC, avec des proportions de 32,63 % ± 1,77 %, 32,267 % ± 2,17 % et 32,967 % ± 4,25 %, respectivement (Fig. 6a, b), qui étaient significativement plus grandes que celles dans le groupe contrôle véhicule (22,37 % ± 0,92 %). Pendant ce temps, l'apoptose cellulaire induite par les Au@Ag NR pouvait être observée après une exposition de 72 h, et le taux d'apoptose tardive des cellules traitées avec 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR et 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR + NAC était de 78,90 ± 1,19 % et 70,20 ± 4,50 %, respectivement (Fig. 6c, d). Les Au@Ag NR ont induit plus d'apoptose tardive que d'apoptose précoce, et le traitement par NAC pouvait atténuer le taux d'apoptose tardive déclenché par les Au@Ag NR.

Les niveaux d'expression de p21 et p53 ont été détectés par Western blot, et un patron similaire a été observé. Les niveaux d'expression de p53 et p21 dans les cellules traitées avec 4 μg mL⁻¹ et 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR étaient nettement augmentés (P < 0,05) et étaient significativement diminués dans les cellules traitées avec tanto 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR que NAC (P < 0,05, comparé au groupe 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR, Fig. 6e-h). Il est connu que la protéine p53 est une molécule centrale médiant l'activation du point de contrôle G2/M en réponse aux dommages à l'ADN, et p21 est reconnu comme un inhibiteur du cycle cellulaire dépendant de p53. Ainsi, les Au@Ag NR pourraient interférer avec la réplication de l'ADN et entraver la réparation de l'ADN par l'arrêt du cycle cellulaire.

Discussion

Actuellement, les rôles des Ag⁺ libérés et des AgNPs dans la génération de génotoxicité sont loin d'être clairs. Des études précédentes de notre groupe [21] et d'autres [13] ont démontré que tandis que les Ag⁺ sont la source majeure pour introduire les toxicités, les nanoparticules pourraient aussi être hautement toxiques. Par exemple, les AgNPs pourraient contribuer à la génotoxicité en induisant la formation de radicaux hydroxyles [13]. De plus, des dommages chromosomiques plus sévères, stress oxydatif et apoptose ont été introduits par les AgNPs comparé aux Ag⁺ seuls [23], suggérant que différentes voies pourraient être impliquées. Nous avons employé les Au@Ag NR comme matériau modèle pour comprendre les formes et distributions des AgNPs dans les cellules, et les quantités d'Ag et d'Au intracellulaires ont été déterminées par ICP-MS. Le rapport de poids Ag/Au des Au@Ag NR préparés a été estimé à 2,3. Cependant, après une exposition de 24 h, il a fortement augmenté à 16,5 dans les cellules traitées avec les Au@Ag NR, suggérant qu'une grande quantité d'Ag a été libérée de l'enveloppe des Au@Ag NR dans cette période. Lorsque la période d'exposition des Au@Ag NR a été étendue à 72 h, le rapport de poids Au/Ag a diminué à 1,7, indiquant que les Ag⁺ ont été libérés de la cellule et que le nanobâtonnet était la forme majeure des Au@Ag NR dans la cellule à ce stade. Par conséquent, on pourrait déduire qu'une fois que les Au@Ag NR entrent dans la cellule, les Ag⁺ se dissolvent rapidement de leur enveloppe dans les 24 h et sont libérés progressivement dans l'environnement extracellulaire, tandis que les Au@Ag NR eux-mêmes sont retenus dans la cellule pendant une période plus longue.

Le stress oxydatif est considéré comme l'un des mécanismes toxicologiques les plus importants des nanoparticules [24]. La N-acétylcystéine (NAC) est un thiol, un agent mucolytique et précurseur de la L-cystéine qui réduit le glutathione. La NAC est aussi une source de groupes sulfhydryles dans les cellules et exerce l'activité de piégeur d'ESP en interagissant avec OH^· et H₂O₂ [25]. Dans cette étude, les niveaux de GSH et SOD étaient significativement diminués après exposition aux Au@Ag NR, tandis que le niveau de MDA augmentait de manière concentration- et temps-dépendante, indiquant que les Au@Ag NR introduisaient le stress oxydatif dans les cellules.

Les potentiels des Ag et Au@Ag NR à interférer avec le matériel génétique ont été davantage étudiés par une série d'essais de génotoxicité. Il est notable que la co-culture de NAC avec les Au@Ag NR pourrait améliorer la formation d'ESP, ce qui à son tour soutient la participation du stress oxydatif dans la génotoxicité déclenchée par les Au@Ag NR. Dans cette étude, les essais de comète et γ-H2AX ont été effectués pour confirmer que les Au@Ag NR pouvaient interagir avec l'ADN et induire certains dommages à l'ADN, et l'endonucléase de réparation Fpg a été incluse dans le test de comète pour identifier les dommages oxydatifs à l'ADN [26]. Le Fgp pouvait reconnaître les pyrimidines oxydées et éliminer les purines oxydées, par exemple, 8-hydroguanine, de manière à créer des sites apuriniques ou apyrimidiniques qui pouvaient introduire des brèches dans les brins d'ADN. La rupture d'ADN induite par le stress oxydatif pouvait être déterminée subséquemment par un autre test de comète [27]. La rupture d'ADN supplémentaire détectée par le Fpg additionnel dans le test de comète suggérait que les Au@Ag NR pouvaient causer des dommages à l'ADN. Mei et al. [28] ont observé que les AgNPs de 5 nm induisaient des dommages à l'ADN spécifiques aux lésions oxydatives en employant les endonucléases hOGG1, EndoIII et Fpg dans le test de comète. Li et al. [29] ont également suggéré que tanto les AgNPs enrobés de PVP que de silice (15-100 nm et 10-80 nm, respectivement) pouvaient entraîner une augmentation significative de la rupture d'ADN dans les hépatocytes de souris en présence de hOGG1 et EndoIII. La formation de foyers γ-H2AX, qui représente une réponse cellulaire précoce au stress génotoxique, est le biomarqueur le plus sensible et spécifique pour détecter les ruptures double brin [30]. Comme démontré dans cette étude, les foyers γ-H2AX dans les cellules exposées aux Au@Ag NR étaient nettement augmentés après 24 h, et une augmentation supplémentaire pouvait être observée après 72 h. La réduction dans le groupe 20 µg mL⁻¹ pourrait être due à la cytotoxicité pour les cellules HepaRG à concentration plus élevée. Des résultats similaires ont été observés pour les AgNPs avec différents enrobages [31, 32]. De plus, nos résultats suggèrent que les Au@Ag NR pouvaient induire des dommages chromosomiques dans les cellules HepaRG, car les taux de micronoyaux étaient significativement augmentés. Cela est cohérent avec des études précédentes, où une augmentation du taux de micronoyaux induit par les AgNPs a été rapportée dans les cellules HaCaT et TK6 [33]. En contraste, l'ajout du piégeur de radicaux oxydatifs NAC pouvait inhiber la formation de micronoyaux induite par les Au@Ag NR. Ensemble, ces données suggèrent la participation du stress oxydatif dans le risque de clastogénicité introduit par les AgNPs in vitro.

Des études précédentes ont étudié l'arrêt du cycle cellulaire et la cytotoxicité induits par les AgNPs [33,34,35]. En prolongeant le temps d'exposition, l'impact des AgNPs sur le cycle cellulaire et l'apoptose pourrait être amplifié et à son tour aggraver la cytotoxicité et la génotoxicité. Habituellement, les points de contrôle du cycle cellulaire (par exemple, G2/M) étaient initiés par les cellules lors de l'expérience de dommages à l'ADN, et ce mécanisme sert à empêcher la cellule d'entrer en mitose (phase M). L'arrêt du cycle cellulaire G2/M indique qu'un pourcentage croissant de cellules est entravé en phase G2 pour la réparation de l'ADN. Les cellules expérimentant une réparation réussie de l'ADN poursuivraient vers la mitose ; cependant, pour celles avec des dommages fatals, un arrêt irréversible du cycle cellulaire G2/M et l'apoptose cellulaire auraient lieu [36]. Nous avons observé que les Au@Ag NR pouvaient arrêter la majorité des cellules HepaRG en phase G2/M, induire l'apoptose tardive et augmenter les niveaux d'expression de p53 et p21, qui sont des protéines importantes associées à la régulation des cycles cellulaires [37]. Comme p53 pouvait aussi induire l'apoptose, lorsque l'ADN ne peut pas être réparé correctement [38], la p21 pourrait indirectement participer à l'apoptose cellulaire par l'arrêt du cycle cellulaire dans une voie dépendante de p53 via la régulation à la baisse de la protéine nucléaire ICBP90 pour la réplication de l'ADN et la régulation du cycle cellulaire [39]. De plus, l'apoptose et un arrêt G2/M induits par l'activation du système p53/p21 ont été rapportés dans les cellules HepG2 après l'administration d'extraits d'ail [40]. Ainsi, on pourrait inférer que les dommages à l'ADN/chromosomes déclenchés par le stress oxydatif pourraient faciliter l'expression de p53 et p21, qui induisent subséquemment l'arrêt du cycle cellulaire. L'extension de la période d'exposition des Au@Ag NR à l'ADN/chromosomes pendant la réplication pourrait aggraver davantage la génotoxicité ou l'apoptose.

Conclusion

La génotoxicité induite par les AgNPs peut être attribuée au stress oxydatif induit par les nanoparticules ainsi que les ions libérés [41]. Cette étude a employé les Au@Ag NR comme modèle pour déterminer la distribution et le comportement de libération de l'Ag après que les nanoparticules entrent dans les cellules. En considérant les formes disparates des Au@Ag NR dans la cellule, après son exposition, les Ag⁺ se sont rapidement dissous de l'enveloppe argent. Les Ag⁺ et Au@Ag NR pouvaient introduire la cytotoxicité et la génotoxicité (clastogénicité) dans les cellules, et les Au@Ag NR retenus dans le noyau peuvent libérer davantage d'Ag⁺ pour aggraver les dommages, qui sont principalement causés par l'arrêt du cycle cellulaire et la formation d'ESP (résumé dans Fig. 7). Collectivement, ces données révèlent la corrélation entre l'accumulation intracellulaire, la libération d'Ag⁺ ainsi que la génotoxicité potentielle des AgNPs.