Un nouveau système analytique pour évaluer les propriétés physico-chimiques des nanoparticules d'argent dans la peau humaine

Résumé

Pour garantir l'utilisation sûre des nanoparticules d'argent (nAg) dans les cosmétiques, il est nécessaire de révéler les propriétés physiques des nAg à l'intérieur de la peau, car ces propriétés peuvent changer lors de l'absorption percutanée. Cette étude vise à établir un système analytique basé sur la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif à particule unique (sp-ICP-MS) pour déterminer les propriétés physiques des nAg dans la peau. D'abord, nous avons optimisé une méthode de prétraitement pour solubiliser les échantillons de peau et montré que la plupart des nAg étaient récupérés par traitement hydroxyde de sodium tout en restant sous forme particulaire. Pour séparer la peau en épiderme et derme, nous avons testé plusieurs conditions d'irradiation micro-ondes. L'analyse sp-ICP-MS a indiqué que 200 W pendant 30 s était optimal, assurant une séparation complète des couches cutanées sans modifier les propriétés physiques de la majorité des nAg. Enfin, nous avons évalué l'application in vivo en analysant la quantité et les propriétés physiques de l'Ag dans l'épiderme, le derme et le sang périphérique de souris après exposition cutanée aux nAg ou Ag⁺. L'analyse sp-ICP-MS a indiqué que les nAg pouvaient être absorbés et distribués dans les couches profondes sous forme ionisée, tandis que Ag⁺ était absorbé et distribué sans changement de propriétés physiques. Cette étude indique que pour comprendre complètement la réponse de la peau après exposition aux nAg, il est essentiel de considérer la distribution et la taille des particules non seulement des nAg mais aussi des Ag⁺ libérés des nAg dans la peau.

Introduction

Les avancées technologiques récentes en nanotechnologie ont accéléré le développement de nanoparticules conçues (ENP), particules <100 nm. Grâce à leurs propriétés bénéfiques (pénétration tissulaire accrue, réactions de surface) vs matériaux micro/plus gros, les ENP sont largement utilisés dans cosmétiques, aliments, médicaments. Par exemple, nanoparticules d'argent (nAg), type ENP le plus courant, incorporées dans cosmétiques pour propriétés antibactériennes (libération constante ions argent Ag⁺). Cependant, propriétés physico-chimiques uniques liées à petite taille peuvent être dangereuses. Ces particules peuvent perturber barrières impénétrables (barrière hémato-encéphalique) et induire inflammation. Certaines études rapportent que ENP peuvent pénétrer barrière cutanée. Pour déterminer sécurité utilisation continue, il est important de comprendre effets toxiques associés ENP contenant nAg en investiguant dynamique de ces particules dans tissus comme peau.

Pour garantir sécurité, indispensable comprendre risques possibles ENP : concepts intégrés "dangers" (toxicité potentielle) et "conditions d'exposition". Si dangers ENP analysés mondialement, peu d'études examinent conditions exposition ENP. En particulier, nAg et Ag⁺ peuvent changer propriétés physiques dans corps. Ex: ionisation nAg → nAg taille plus petite + libération Ag⁺. Inversement, nAg petite taille détectés épithélium intestinal rats après administration orale acétate argent. Récemment nous avons rapporté que comparé à nAg plus petits et Ag⁺, nAg plus grands plus facilement trouvés dans lait souris allaitantes exposées. Donc nAg peut changer propriétés physiques dans corps → changement cinétique. Pour comprendre risques, nécessaire évaluer propriétés physiques (taille particule) et distinguer particules/ions dans corps.

À cet égard, nous avons appliqué spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif à particule unique (sp-ICP-MS), qui introduit maximum une particule par temps de résidence dans l'analyseur. Méthode efficace déterminant taille particule par analyse intensité pic et concentration particulaire via taux pics. Particules et ions distingués par analyse signaux pic et fond. Nous avons précédemment optimisé méthode prétraitement sp-ICP-MS échantillons biologiques pour détermination semi-quantitative propriétés physiques ENP dans divers organes (foie, cœur, poumons, reins, rate).

Peau = épiderme (incluant stratum corneum SC) + derme (vaisseaux sanguins, lymphatiques, nerfs). Entrée ENP dans chaque couche peut induire toxicité variable. Ex: distribution NPs dioxyde titane kératinocytes épiderme peau humaine → stimulation espèces réactives oxygène. Souris glabres, exposition dermique NPs dioxyde titane 60 jours → changements pathologiques : derme plus fin (toxicité locale) + nécrose liquéfaction foie (toxicité systémique via vaisseaux sanguins derme). Réponses biologiques chaque couche peuvent varier selon propriétés physiques (taille) et différences particules/ions. Pour comprendre sécurité nAg, nécessaire comprendre propriétés physiques et biodistribution nAg après exposition peau.

Pour résoudre ce problème, approche prétraitant peau et séparant couches sans pertes récupération ni changements propriétés physiques ENP nécessaire. Mais telle approche optimale peau pas encore conçue.

Cette étude optimise approche prétraitement déterminant semi-quantitativement propriétés physiques nAg (ENP modèle) dans chaque couche peau via sp-ICP-MS, et évalue son efficacité in vivo.

Méthodes

Souris

Souris Slc:ICR (femelles, 8 semaines) achetées Japan SLC (Shizuoka, Japon). Logées cycle lumière-obscurité : allumage 8h, extinction 20h. Nourriture/eau granulés et système alimentation eau dessus cage. Protocoles expérimentaux conditions approuvées comité recherche animale Université Osaka, Japon.

nAg et Ag⁺

Suspensions nAg capés citrate diamètre 100 nm (nAg100) achetées nanoComposix (San Diego, USA) dispersions stock (1 mg/mL). Nitrate argent (AgNO₃) acheté Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japon) dispersions stock (1 mg/mL). RM8013, standard calcul efficacité transport, acheté National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, USA). Chaque type nanoparticules soniqué 10 min avant utilisation. Nanoparticules et ions vortexés 10 s avant utilisation.

Réactifs

Hydroxyde sodium (NaOH, 0,1 mol/L) acheté Nacalai Tesque (Osaka, Japon), acide nitrique (HNO₃, 70%) acheté Kanto Kagaku Chemical Industries (Tokyo, Japon). Tampon phosphate salin (PBS), pH 7, préparé.

Optimisation méthodes prétraitement

Épiderme et derme chaque souris séparés, mélangés PBS (ratio p/v 1:10), homogénéisés. Homogénéat mélangé solution nAg100 100 ng/mL. Mélange traité un des réactifs suivants ratio v/v 1:1 : 0,1 mol/L NaOH, 70% HNO₃, ou PBS. Incubation 3 h à 37 °C puis sp-ICP-MS.

Séparation peau par irradiation micro-ondes

Chaque souris euthanasiée isoflurane (Wako), échantillon peau dorsale 2 cm² (2 cm × 1 cm) excisé ciseaux/chirurgicaux pinces. Précaution éviter dommages tissu. Four micro-ondes (RE-SW-20-H, Sharp, Japon) irradiation fréquence 2450 MHz. Échantillons peau placés assiette centre four. Selon exigences test, irradiation 10, 30, 60 s à 200, 600, 900 W. Après irradiation, échantillons rapidement retirés, épiderme et derme séparés rapidement grattage doux pinces chirurgicales. Solution nAg100 100 ng/mL utilisée analyse taux récupération et diamètre moyen nAg après irradiation (200 W, 30 s).

Administration transdermique nAg100 et Ag⁺

Souris Slc:ICR femelles 9 semaines divisées 6 groupes 3 souris selon poids. Anesthésiées isoflurane. Poil dos tondu tondeuse (Panasonic®, Osaka, Japon) rasoir main (Gillette®, Allemagne). nAg100 et Ag⁺ (20 μg/cm²) appliqués directement surface 2,25 cm² (1,5 cm × 1,5 cm) peau dorsale, recouverts hermétiquement film plastique non absorbant. Gaze même taille placée sur film. Bandage élastique auto-adhésif enveloppant peau/gaze, laissé 5 jours.

Prétraitement échantillons peau et sang

5 jours après traitement, sang périphérique plexus veineux rétro-orbital et peau dorsale collectés analyse. 2,25 cm² peau dorsale excisée ciseaux/pinces, précaution éviter dommages. Couches SC enlevées séquentiellement bandes adhésives 2 cm (Scotch®, 3M) avant séparation épiderme/derme. Bandes pressées zone traitée peau dorsale pression constante 10 s. 20 bandes nécessaires enlever SC complet chaque souris. Ensuite derme/épiderme séparés irradiation micro-ondes, homogénéisés PBS (p/v 1:10). Sang collecté, homogénéats derme/épiderme traités NaOH 0,1 mol/L ratio v/v 1:1, incubés séparément 3 h à 37 °C. Après incubation, masse brute argent sang, mélanges épiderme/derme analysée ICP-MS. Quantification et évaluation propriétés physiques nAg/Ag⁺ par sp-ICP-MS.

Mesure masse brute argent

Système ICP-MS Agilent 7700x (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Conditions : puissance RF 1550 W ; gaz porteur 1,05 L/min Ar ; temps résidence 100 ms. Mesures répétées 3× mode MS. Rhodium standard interne Ag. Éléments cibles : ¹⁰³Rh et ¹⁰⁷Ag. Solutions standards Ag/rhodium Wako.

Analyse sp-ICP-MS et calcul

ICP-MS Agilent 7700x pour sp-ICP-MS. Conditions : puissance RF 1550 W ; gaz porteur 1,05 L/min Ar ; temps résidence 10 ms ; temps analyse 30 s. Outils calcul particule unique RIKILT (Wageningen Food Safety Research, Wageningen University, Pays-Bas) pour calcul taille particule.

Analyse statistique

Toutes analyses statistiques logiciel GraphPad Prism v5.0 Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, USA). Signification statistique P < 0,05.

Résultats et discussion

Stratégies construction méthode détermination quantité/propriétés physiques nAg chaque couche peau

Pour déterminer quantité/propriétés physiques nAg chaque couche peau, nécessaire solubiliser complètement échantillons peau et préparer échantillons compatibles sp-ICP-MS. Aussi essentiel séparer épiderme/derme sans pertes récupération ni changements propriétés physiques nAg, car nAg non absorbé transdermiquement parfois éliminé lors élimination SC par bandelettes adhésives.

Quant à solubilisation échantillons peau, nous avons précédemment rapporté que prétraitement NaOH optimal pour quantification et analyse propriétés physiques nAg tissus animaux (foie, cœur, poumons, reins, rate). Donc prétraitement NaOH appliqué échantillons peau cette étude.

Traitement hydrothermal ramollit fibres collagène et améliore digestion enzymatique, favorisant séparation jonction épidermo-dermique (EDJ), largement utilisé séparation peau couches épidermique/dermique. Bien que traitements séparent efficacement couches, nAg dans couches peut être ionisé solution aqueuse → changement propriétés physiques. Rapporté impulsion courte irradiation micro-ondes permet séparation peau couches épidermique/dermique par génération chaleur perturbant EDJ. Donc irradiation micro-ondes appliquée sans incubation solution temps court.

Collectivement, stratégie proposée (illustrée Fig. 1), validée analyse taux récupération et changements propriétés physiques nAg chaque couche peau.

Optimisation méthodes prétraitement détection nAg100 épiderme/derme

Référence étude précédente optimisation méthode prétraitement solubilisation échantillons peau. Ishizaka et al. : parmi réactifs solubilisation (NaOH, HNO₃), NaOH optimal. Test HNO₃ et NaOH comme réactifs solubilisation acide/base. Homogénéats épiderme/derme séparés échantillons peau souris mélangés nAg100 concentration finale Ag 100 ng/mL puis traités chaque réactif solubilisation 37 °C. D'abord évaluation taux récupération Ag suivant traitements. ICP-MS : taux récupération ~100% NaOH et HNO₃ seulement (Fig. 2a). Ensuite évaluation changements propriétés physiques chaque traitement : analyse concentrations récupération chaque particule/ion. sp-ICP-MS : nAg100 quasi complètement ionisé par HNO₃. HNO₃ réactif acide dissout particules → conversion ions (rapporté étude précédente). À l'inverse, majorité nAg100 traité NaOH reste particules, pas ions (Fig. 2b). NaOH permet majorité nAg100 rester forme particulaire. Enfin distributions diamètres particules évaluées analyser propriétés physiques détail. HNO₃ change diamètre moyen 100 nm → 40 nm (ionisation nAg100). Diamètre moyen après NaOH ~100 nm (taille initiale) (Fig. 2c). NaOH prétraitement optimal détection nAg100 peau souris.

Séparation échantillons peau épiderme/derme par irradiation micro-ondes et évaluation taux récupération/changements propriétés physiques nAg

Pour séparer échantillons peau couches épidermique/dermique, différentes conditions irradiation micro-ondes pertinentes étude et précédemment rapportées réussies appliquées, performance comparée séparabilité peau et changements propriétés physiques. Observé : conditions 200 W 10 s, 600 W 30 s, 600 W 60 s, 950 W 30 s, 950 W 60 s → peau ne sépare pas couches (Fig. 3a). Séparation partielle : 200 W 60 s, 600 W 10 s, 950 W 10 s. Séparation complète seulement après irradiation 200 W 30 s. Résultats indiquent 200 W 30 s optimal séparation couches peau.

Vérification si irradiation 200 W 30 s affecte propriétés physiques nAg100 : détermination propriétés physiques Ag couches épidermique/dermique. Homogénéats épiderme/derme chacun mélangés 100 ng/mL nAg100, lysés NaOH, irradiés 200 W 30 s. sp-ICP-MS : majorité nAg100 irradié reste particules, comme groupe non traité (Fig. 3b). Analyse détail distributions diamètres particules : diamètre moyen ~100 nm (taille initiale) (Fig. 3c). Irradiation micro-ondes 200 W 30 s approche prometteuse séparation efficace peau couches épidermique/dermique sans changer propriétés physiques nAg100.

Collectivement, résultats indiquent développement réussi système détermination semi-quantitative propriétés physiques nAg100 chaque couche peau. Méthode : (i) élimination nAg100 non absorbé transdermiquement par élimination SC méthode bandelettes adhésives ; (ii) séparation peau couches épidermique/dermique irradiation micro-ondes ; (iii) solubilisation épiderme/derme traitement NaOH ; (iv) détermination semi-quantitative propriétés physiques Ag chaque couche peau sp-ICP-MS.

Évaluation pratique détermination quantité/propriétés physiques nAg100/Ag⁺ couches peau souris in vivo

Évaluation application pratique : analyse quantité/propriétés physiques Ag épiderme, derme, sang périphérique après exposition peau souris nAg100/Ag⁺ in vivo. 5 jours post-exposition, séparation peau épiderme/derme conditions optimisées irradiation micro-ondes, solubilisation NaOH comme section précédente. ICP-MS : Ag présent tous tissus (épiderme, derme, sang) tous groupes. Derme et sang : Ag groupe Ag⁺-exposé tend à être augmenté vs groupe nAg100-exposé (Fig. 4a). Données suggèrent : bien que formes ion/particule absorbées percutanément et distribuées comme rapporté, formes ioniques infiltrent plus facilement couches profondes tissus que formes particulaires.

Évaluation ratio nAg/Ag⁺ chaque échantillon. Groupe Ag⁺-exposé : presque tout Ag détecté forme ionique épiderme, derme, sang → Ag⁺ absorbé/distribué sans changement propriétés physiques. Groupe nAg100-exposé : ~70% Ag épiderme/derme forme particulaire, reste ionisé. Ag sang périphérique quasi totalement ionisé, forme particulaire à peine détectée (Fig. 4b). Évaluation taille particules couches épidermique/dermique où formes particulaires principalement détectées. sp-ICP-MS : tailles particules détectées deux couches ~70-80 nm, correspondant taux ionisation nAg100 (Fig. 4c). Données suggèrent : exposition peau nAg100 → absorption/distribution sous forme ionisée.

Précédemment rapporté : ligands surface NPs affectent absorption peau. Ex: NPs or modifiées groupe amino absorbées peau souris/humaine plus que NPs or carboxyle ex vivo. Analyse dynamique moléculaire : capacité pénétration peau diminue ordre : hydrophobe neutre > cationique > anionique NPs or. Inféré cette étude : nAg100 moins probable pénétrer SC épiderme (barrière cutanée initiale) car nAg100 modifié citrate chargé négativement. Raison particules observées derme/sang : particules pénètrent pores + épiderme.

Rapporté : pénétration NPs or améliorée modification peptides pénétrants cellules (Tat, R7). Futur : modifications similaires envisageables nAg pour les délivrer plus profond peau. Aussi nécessaire réduire taille nAg car effet modification surface plus grand surface spécifique plus grande.

Conclusions

Cette étude développe approche prétraitement détermination semi-quantitative propriétés physiques nAg100 chaque couche peau par sp-ICP-MS. Approche montre exposition peau nAg100 → ionisation, absorption, distribution couches profondes. Pour comprendre réponses biologiques/toxicité exposition peau nAg100, nécessaire considérer non seulement distribution nAg100 et taille particule, mais aussi Ag⁺ issu nAg100 fondant dans tissus cutanés. Approche prometteuse technique fondamentale pour analyse risques.

Disponibilité des données et matériaux

Partage données non applicable cet article car aucun jeu de données généré/analysé pendant étude.

Abréviations

ENPs :

Nanoparticules conçues

nAg :

Nanoparticule d'argent

Ag⁺ :

Ions argent

sp-ICP-MS :

Spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif à particule unique

SC :

Stratum corneum

nAg100 :

Nanoparticule d'argent diamètre 100 nm

AgNO₃ :

Nitrate d'argent

NaOH :

Hydroxyde de sodium

HNO₃ :

Acide nitrique

PBS :

Tampon phosphate salin

ICP-MS :

Spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif

EDJ :

Jonction épidermo-dermique