Évaluation de la modulation par le fullerène C60 de la liaison diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate-ADN et de la cytotoxicité dans les cellules leucémiques humaines

Résumé

Un nouveau représentant des carbacylamidophosphates — le diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL), contenant deux substituants phénoxy près du groupe phosphoryle, a été synthétisé, identifié par analyse élémentaire et spectroscopies IR et RMN, et testé comme agent cytotoxique seul et en combinaison avec le fullerène C₆₀.

Selon les résultats de simulation moléculaire, le fullerène C₆₀ et HL pourraient interagir avec l'ADN et former un complexe rigide stabilisé par des interactions d'empilement des groupes phényl de HL avec le C₆₀ et le nucléotide G de l'ADN, ainsi que par des interactions du groupe CCl₃ de HL par liaisons ion-π avec la molécule de C₆₀ et par liaisons électrostatiques avec le nucléotide G de l'ADN.

Grâce au test MTT, l'activité cytotoxique de HL contre les cellules leucémiques humaines CCRF-CM avec une valeur IC₅₀ détectée à 10 µM à 72 h de traitement a été montrée. Sous l'action combinée de 16 µM de fullerène C₆₀ et HL, la valeur d'IC₅₀ a été détectée à une concentration plus faible de 5 µM HL et à une période plus précoce de 48 h d'incubation ; de plus, l'effet cytotoxique de HL a été observé à une faible concentration de 2,5 µM à laquelle HL seul n'avait aucune influence sur la viabilité cellulaire. La liaison du fullerène C₆₀ et HL avec le sillon mineur de l'ADN avec formation d'un complexe stable est supposée être l'une des raisons possibles de leur inhibition synergique de la prolifération des cellules CCRF-CEM.

L'application du fullerène C₆₀ en combinaison avec 2,5 µM HL s'est avérée sans effet nocif sur la stabilité structurale de la membrane des érythrocytes sanguins. Ainsi, l'action combinée du fullerène C₆₀ et HL à faible concentration potentialise l'effet cytotoxique de HL contre les cellules leucémiques humaines et n'est pas suivie d'effet hémolytique.

Contexte

Le représentant des nanostructures de carbone, le fullerène C₆₀, possède des propriétés physicochimiques uniques et une activité biologique non seulement comme antioxydant ou photosensibilisateur, mais aussi comme modificateur de l'effet toxique des médicaments anticancéreux en raison de sa capacité à pénétrer à l'intérieur de la cellule et à fonctionner comme vecteur de médicament. La molécule de C₆₀ peut interagir avec des médicaments chimiothérapeutiques tels que la doxorubicine, le cisplatine et le paclitaxel et former des complexes avec eux, renforçant l'effet thérapeutique.

Les carbacylamidophosphates (CAPh) sont des molécules organiques qui ont attiré l'attention en raison de leur structure particulière, de leur activité biologique et de leurs perspectives d'application biomédicale. La présence de groupes peptide et phosphoramide combinés dans le fragment C(O)N(H)P(O) de la molécule détermine son interaction avec les molécules biologiques et les membranes cellulaires. La variation des substituants près des groupes phosphoryle et carbonyle permet de moduler les propriétés stéréochimiques et pharmacologiques des CAPh. En particulier, différents représentants des CAPh ont montré une activité antinéoplasique.

Récemment, nous avons confirmé qu'un représentant des CAPh, le diméthyl-N-(benzoyl)amidophosphate, utilisé dans une gamme de concentrations millimolaires, diminuait la viabilité des cellules leucémiques L1210 et que son effet toxique était facilité par le fullerène C₆₀. Nous avons également montré que l'introduction de substituants aromatiques supplémentaires et du groupe électronegatif CCl₃ dans la structure des CAPh entraînait une augmentation de leur toxicité. Ainsi, un effet toxique significatif du dimorfolido-N-trichloroacetylphosphoramide a été montré contre des cellules leucémiques humaines de différentes origines, mais sa concentration effective restait élevée et aucune augmentation de toxicité après action combinée avec le fullerène C₆₀ n'a été observée. Dans la continuité de ces investigations, nous avons synthétisé un nouveau représentant des CAPh, le diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL), qui possède deux substituants phénoxy au lieu de groupes morfolido près du groupe phosphoryle (Fig. 1).

Structure du diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL).

L'objectif de la recherche était d'estimer l'activité biologique du diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL) seul ou en combinaison avec le fullerène C₆₀, en utilisant une analyse in silico de leur interaction avec l'ADN et une étude in vitro des effets cytotoxiques contre une lignée cellulaire leucémique humaine.

Méthodes/Expérimental

Produits chimiques

Milieu liquide RPMI 1640, sérum fœtal bovin (FBS), Pénicilline/Streptomycine et L-glutamine (Biochrom, Allemagne), Diméthylsulfoxyde (DMSO) (Carl Roth GmbH+Co, Allemagne), MTT [3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromure] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., USA), HCl (Kharkivreachim, Ukraine).

Caractérisation du composé chimique

Pour augmenter la solubilité, nous avons obtenu le sel de sodium du diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL) selon les réactions suivantes (Fig. 2).

Schéma de solubilisation du diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL) en sel de sodium.

La solution de trichlorophosphazotrichloroacétyl (0,035 M) dans 200 ml de chloroforme a été ajoutée lentement à une suspension bien agitée de phénolate de sodium (0,106 M, 12,3 g) dans 150 ml de chloroforme (Fig. 2 ; étape 1). La température du mélange n'a pas été autorisée à dépasser 40–50 °C. L'agitation a continué pendant environ 1 h, puis la solution a été chauffée à 70 °C et agitée pendant 20 min dans ces conditions. Le produit résultant, le triphénoxyphosphazotrichloroacétyl, a été évaporé. Ensuite, 40 ml de NaOH 1 M ont été ajoutés et refluxés pendant 90 min (Fig. 2 ; étape 2. Le mélange résultant a été évaporé. Le précipité solide de HL sodique a été lavé trois fois à l'éther diéthylique et recristallisé à partir d'i-propanol sous forme de poudre cristalline blanche (rendement 80 %). Des cristaux incolores de NaL·3H₂O adaptés à l'analyse par rayons X ont été obtenus par évaporation lente d'une solution i-PrOH:H₂O (9:1 v/v). Le composé est stable à l'air, hautement soluble dans l'eau et les alcools. P.f. 215 °C.

HL a été identifié par analyse élémentaire et spectroscopies IR et RMN : les analyses élémentaires (C, H, N) ont été effectuées à l'aide de l'analyseur élémentaire universel EL III CHNOS. Les mesures spectrales IR ont été effectuées pour des échantillons sous forme de pastilles KBr sur un spectromètre Perkin–Elmer Spectrum BX FT-IR avec une résolution de 2 cm⁻¹ et 8 accumulations de scans, combinées pour moyenniser les artefacts d'absorption aléatoires dans la gamme spectrale 4000–400 cm⁻¹. Les spectres ¹H RMN en solutions DMSO-d6 ont été enregistrés sur un spectromètre RMN AVANCE 400 Bruker à température ambiante.

HL : IR (cm⁻¹) : 1639 vs, sh (νCO) ; 1353 s, sh (Amide II) ; 1194 s, sh (νPO) ; 941 s, sh (νPN).

¹H RMN (DMSO-d₆) : 7,05 (t, 2H, γ-CH₂) ; 7,205, 7,255 (dt, 8H, α- et β-CH₂).

Pour CCl₃C(O)N(Na)P(O)(OC₆H₅)₂, la composition élémentaire a été déterminée, % : C 40,58, H 2,35, N 3,15 ; et calculée, % : C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Synthèse et caractérisation du fullerène C₆₀

Une solution colloïdale aqueuse hautement stable de fullerène C₆₀ (200 µM, pureté > 99,5 %, taille moyenne des nanoparticules jusqu'à 50 nm) a été synthétisée à l'Université technique d'Ilmenau (Allemagne) comme décrit dans [17, 18].

Culture cellulaire

Les expériences ont été réalisées sur la lignée cellulaire leucémique aiguë à cellules T humaines CCRF-CM. La lignée cellulaire a été achetée auprès de l'Institut Leibniz DSMZ - Collection allemande de microorganismes et de cultures cellulaires : CCRF-CM (ACC 240). Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10 % FBS, 1 % Pénicilline/Streptomycine, et 2 mM Glutamine, dans des flacons de 25 cm² à 37 °C avec 5 % CO₂ dans un incubateur humidifié.

Les cellules en milieu RPMI 1640 ont été incubées avec du fullerène C₆₀ (16 µM) ou HL (2,5, 5 et 10 µM) séparément et ensemble pendant 24, 48 et 72 h. La survie cellulaire sans ajout de HL ou de fullerène C₆₀ a été prise comme 100 % (échantillon témoin contenait 0,05 M DMSO).

Test de viabilité cellulaire (MTT)

La viabilité cellulaire a été évaluée par le test de réduction MTT [3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromure]. Aux moments indiqués d'incubation, des aliquotes de 100 µl (0,5 × 10⁴ cellules) ont été placées dans des plaques à 96 puits Sarstedt (Nümbrecht, Allemagne), 10 µl de solution MTT (5 mg/ml dans PBS) ont été ajoutés à chaque puits, et les plaques ont été incubées pendant 2 h supplémentaires à 37 °C. Le milieu de culture a ensuite été remplacé par 100 µl de DMSO ; la formation de formazan a été déterminée en mesurant l'absorption à 570 nm avec un lecteur de microplaques Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Suisse).

Animaux

L'étude a été menée sur des rats mâles blancs de la lignée « Wistar » pesant 170 ± 5 g. Les animaux ont été maintenus dans des conditions standard dans le vivarium de l'ESC « Institut de Biologie et Médecine », Université nationale Taras Chevtchenko de Kyiv. Les animaux avaient un accès libre à la nourriture et à l'eau. Toutes les expériences ont été conduites conformément aux principes internationaux de la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés sous le contrôle du Comité de Bioéthique de l'institution susmentionnée.

Estimation de l'hémolyse des érythrocytes

Les érythrocytes ont été obtenus à partir de sang hépariné de rats de lignée « Wistar » et dilués dans une solution de NaCl à 0,85 % à 0,700 o.u. à 630 nm sur le spectrophotomètre Scinco (Allemagne). L'hémolyse des érythrocytes a été causée par HCl 0,001 N. La cinétique de l'hémolyse a été mesurée spectrophotométriquement (λ = 630 nm) toutes les 10 s pendant 2 min. Le pourcentage d'érythrocytes hémolysés a été calculé comme présenté dans [20]. Les érythrocytes ont été incubés dans une solution de NaCl à 0,85 % avec du fullerène C₆₀ (16 µM) ou HL (2,5 et 10 µM) séparément et ensemble pendant 1 h. Les érythrocytes sans ajout de HL ou de fullerène C₆₀ ont été pris comme 100 % (échantillon témoin contenait 0,05 M DMSO).

Étude in silico

La molécule d'ADN à double hélice a été utilisée comme modèle à partir de la base PDB (Protein Data Bank). L'interaction de la molécule d'ADN avec HL séparément et en combinaison avec le fullerène C₆₀ a été étudiée. Nous avons pris en considération les structures suivantes de la molécule d'ADN : 2MIW (CCATCGCTACC - intercalation d'un composé dans un petit sillon de l'hélice d'ADN), 1XRW (CCTCGTCC - intercalation dans un petit sillon), et 2M2C (GCGCATGCTACGCG - liaison d'un composé avec les grands et petits sillons de l'hélice d'ADN). Nous avons appliqué l'algorithme d'amarrage systématique (SDOCK+), intégré dans le paquet QXP (cette méthode démontre toutes les conformations possibles des structures étudiées avec la valeur minimale de l'écart quadratique moyen (RMSD)). Nous avons généré 300 complexes potentiellement possibles avec l'ADN, les dix meilleurs ayant été sélectionnés pour l'étape suivante, en utilisant une fonction de score intégrée dans le paquet QXP.

Les interactions de la molécule d'ADN avec HL séparément et en combinaison avec le fullerène C₆₀ ont été caractérisées par les paramètres suivants : (1) le nombre de liaisons hydrogène, (2) la surface de contact de l'ADN et de la structure correspondante, (3) la distance entre l'ADN et la structure amarée, et (4) l'énergie totale de la structure de liaison.

Pour évaluer la stabilité des complexes du composé chimique avec le fullerène C₆₀, nous avons conduit une dynamique moléculaire courte (DM, 100 ps) en utilisant l'outil logiciel Gromacs selon un algorithme de Nosé-Poincaré-Anderson (NPA) basé sur le champ de force OPLS-AA.

Les calculs ont été effectués sur les paramètres suivants : température (en Kelvin) - 300 ; pression (en kilopascal) - 100 ; la liaison impliquant l'atome d'hydrogène ou le ligand était limitée par l'algorithme.

Analyse statistique

Les données ont été représentées comme moyenne ± ET de plus de quatre expériences indépendantes. La moyenne (M) et l'écart-type (ET) ont été calculés pour chaque groupe. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant une ANOVA à deux facteurs suivie de tests post-hoc de Bonferroni. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Le traitement des données et le tracé ont été effectués par PC IBM à l'aide d'applications spécialisées GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., USA).

Résultats et discussions

Étude in silico

Interaction de HL avec l'ADN

Il a été montré que HL pouvait s'intercaler dans l'ADN et former un complexe stable lorsqu'il est lié dans un sillon mineur de l'ADN via les nucléotides AGC-GCTA (Fig. 3a). Dans ce cas, l'interaction d'empilement entre la base azotée du nucléotide A et le groupe phényl de HL ainsi que l'interaction électrostatique entre le groupe CCl₃ et le nucléotide C ont été formées. Après simulation DM, les valeurs RMSD pour l'hélice double d'ADN et HL étaient de 3,3 et 1,62 Å, respectivement. L'environnement nucléotidique de HL (GCA-CTA) a été partiellement modifié et l'interaction d'empilement a été perdue, tandis qu'une liaison hydrogène s'est formée entre le nucléotide G et le groupe CO de HL.

Interaction du diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL) avec la molécule d'ADN : a, b liaison avec les sillons mineur et majeur ; c intercalation dans un sillon mineur. La structure d'ADN utilisée depuis la base PDB : a, b—2M2C et c—1XRW.

La liaison de HL avec un sillon majeur de l'ADN s'est produite via les nucléotides TCG-AT (Fig. 3b). Dans ce cas, une liaison hydrogène entre le groupe CO de HL et la base azotée du nucléotide A s'est formée et une interaction d'empilement entre les deux groupes phényl de HL et les bases azotées des nucléotides C et G s'est produite. De plus, une probabilité de liaison électrostatique entre le groupe CCl₃ de HL et les bases azotées des nucléotides AT est apparue.

Après simulation DM, aucun changement dans l'environnement nucléotidique de HL n'a été détecté. Les valeurs RMSD pour l'ADN et HL étaient de 2,77 et 1,58 Å, respectivement. En raison de cela, l'interaction d'empilement entre le nucléotide C et le groupe phényl a disparu.

Dans le cas de l'intercalation de HL dans l'ADN, son environnement consistait en des nucléotides CG-CG (Fig. 3c). L'interaction d'empilement avec les nucléotides CG est apparue : un groupe phényl était coincé entre les bases azotées et l'autre formait une interaction d'empilement avec le nucléotide C.

Après simulation DM, les valeurs RMSD pour l'hélice double d'ADN et HL étaient de 1,71 et 1,89 Å, respectivement. L'environnement nucléotidique de HL n'a pas été modifié. L'un des groupes phényl a formé une interaction ion-π avec la base azotée du nucléotide G, qui s'est avérée décalée de 1,12 Å.

Les paramètres d'énergie obtenus témoignent que l'énergie des conflits stériques entre l'ADN et HL ainsi qu'à l'intérieur de HL lui-même était insignifiante (Tableau 1).

Nous avons fait une analyse comparative des paramètres d'énergie de la liaison de HL avec les sillons mineur et majeur de l'ADN ou son intercalation dans le sillon mineur de l'ADN. Les valeurs de Bump étaient de 6,2 kJ/mol dans le cas de l'intercalation de HL dans l'ADN et 2,5 kJ/mol dans le cas de sa liaison avec les sillons mineur et majeur de l'ADN (Tableau 1). Les valeurs Int étaient de 8,7 kJ/mol pour l'intercalation, 6,3 kJ/mol pour la liaison avec un sillon majeur, et 3,6 kJ/mol pour la liaison avec un sillon mineur. Ces données montraient que la liaison de HL avec un sillon mineur de l'ADN était la plus stable.

Interaction combinée de HL et du fullerène C₆₀ avec l'ADN

Précédemment, avec l'utilisation de simulation informatique, nous avons démontré que la molécule de C₆₀ pouvait interagir avec l'ADN et former un complexe stable C₆₀+ADN lors de la liaison avec le sillon mineur de l'ADN. Comme montré à la Fig. 4, le fullerène C₆₀ pouvait également former des liaisons ion-π avec les groupes CCl₃ de la molécule HL.

Interaction combinée du diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL) et du fullerène C₆₀ avec l'ADN (versions HL+C₆₀ ou C₆₀+HL) : a, b liaison avec les sillons mineur et majeur, c, d intercalation dans les sillons mineur et majeur. Les structures d'ADN utilisées de la base PDB : a, b—2M2C, c—1XRW, et d—2MIW.

Nous avons utilisé deux versions de modélisation moléculaire de l'interaction HL, fullerène C₆₀ et ADN, qui ont été proposées dans [16] et se sont avérées utiles pour l'interprétation des résultats de simulation DM. Nous avons utilisé la structure PDB 1XRW de la molécule d'ADN dans la version où initialement HL puis la molécule de C₆₀ s'intercalent dans l'ADN (HL+C₆₀) et la structure PDB 2MIW de la molécule d'ADN — dans la version où initialement la molécule de C₆₀ puis HL s'intercalent dans l'ADN (C₆₀+HL).

La liaison avec un sillon mineur de l'ADN dans le cas de la version HL+C₆₀ s'est produite via les nucléotides GCTA-GCAT (Fig. 4a). Les groupes phényl remplissaient un sillon mineur et entraient en interactions d'empilement : un groupe avec le fullerène C₆₀ et l'autre avec la base azotée du nucléotide G. Les interactions électrostatiques sont survenues entre le groupe CCl₃ de HL et à la fois la base azotée du nucléotide G et le fullerène C₆₀.

Selon les résultats de simulation DM, une hélice double d'ADN dans ce cas était caractérisée par une mobilité considérable (valeur RMSD 3,08 Å), la valeur RMSD pour HL était de 2,04 Å, tandis que le fullerène C₆₀ restait pratiquement immobile. En conséquence, l'environnement nucléotidique de la structure HL+C₆₀ a été modifié par TGC-GCATG. De plus, une liaison hydrogène entre le groupe amino de HL et l'ADN et des interactions d'empilement entre les nucléotides de bases azotées GC et le fullerène C₆₀ sont apparues.

La liaison de HL+C₆₀ avec un sillon majeur de l'ADN s'est produite via les nucléotides C-ATCC (Fig. 4b). Des liaisons hydrogène se sont formées entre le groupe CO de HL et la base azotée du nucléotide A. Les groupes phényl remplissaient un sillon majeur de l'ADN et entraient en interaction d'empilement avec le fullerène C₆₀.

Selon les résultats de simulation DM, l'environnement nucléotidique de la structure HL+C₆₀ n'a pas été modifié : les valeurs de RMSD pour l'ADN et HL étaient de 3,14 et 2,24 Å, respectivement, le fullerène C₆₀ est resté pratiquement immobile. Dans ce cas, toutes les interactions entre HL et le fullerène C₆₀ ont disparu et HL a interagi stériquement seulement avec l'ADN. On suppose qu'en conséquence, le fullerène C₆₀ ainsi que HL seraient expulsés du sillon majeur de l'ADN.

Lorsque HL+C₆₀ étaient intercalés dans un sillon mineur de l'ADN (Fig. 4c), la liaison avec les nucléotides CGT-GAG s'est produite. Le fullerène C₆₀ s'est avéré être incorporé dans un sillon mineur de l'ADN et interagir avec lui stériquement. Les groupes phényl de HL formaient des interactions d'empilement avec les bases azotées des nucléotides CG-CG. Selon la simulation DM, les valeurs de RMSD pour l'ADN et HL étaient de 2,29 et 2,13 Å, respectivement, le fullerène C₆₀ est resté pratiquement immobile, et le groupe CC1₃ de HL est entré en interaction électrostatique avec la base azotée du nucléotide G.

Dans le cas de la version C₆₀+HL, la liaison avec un sillon mineur de l'ADN (Fig. 4d) s'est produite via les nucléotides CGC-GCC. L'un des groupes phényl de HL formait un empilement avec le fullerène C₆₀ et l'autre avec le nucléotide G. Le groupe CC1₃ de HL apparaissait former une liaison électrostatique avec la base azotée du nucléotide C. Selon l'analyse DM, les valeurs de RMSD pour l'ADN et HL dans ce cas étaient de 2,35 et 2,75 Å, respectivement, le fullerène C₆₀ est resté immobile, et l'environnement nucléotidique de la structure C₆₀+HL a été modifié par CGCT-GC. De plus, la molécule de C₆₀ a pénétré plus profondément dans l'ADN et a formé une interaction d'empilement avec la base azotée du nucléotide C.

Selon les paramètres d'énergie calculés, le complexe formé dans le cas de l'intercalation de C₆₀+HL dans un sillon mineur de l'ADN était le plus rigide (la valeur Bump 20,0 kJ/mol) (Tableau 1). En revanche, dans le cas de l'interaction HL+C₆₀ avec l'ADN, ce paramètre n'était que de 6,2 kJ/mol lorsque HL+C₆₀ était intercalé dans un sillon mineur de l'ADN, 7,8 kJ/mol lorsqu'il était lié avec un sillon mineur de l'ADN, et 8,8 kJ/mol lorsqu'il était lié avec un sillon majeur de l'ADN. De plus, les paramètres d'énergie montraient que la formation de fortes liaisons hydrogène à l'intérieur du complexe HL+C₆₀+ADN n'était possible que dans le cas de la liaison avec un sillon majeur de l'ADN, lorsque la valeur de Hbnd était de −2,3 kJ/mol, dans les autres types d'interaction elle était égale à zéro ou −1,0 kJ/mol (Tableau 1). De plus, selon les résultats DM dans ce cas, tanto le fullerène C₆₀ que HL apparaissaient déplacés d'un sillon majeur de l'ADN.

Par conséquent, la liaison de C₆₀+HL avec un sillon mineur de l'ADN est suggérée comme la version la plus probable de l'interaction combinée du fullerène C₆₀, HL et ADN.

Étude in vitro des effets biologiques de HL

Viabilité des cellules CCRF-CEM

Dans les expériences in vitro, l'influence à long terme du diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL) dans la gamme 2,5–10 µM sur la viabilité des cellules leucémiques humaines CCRF-CEM a été estimée par le test MTT. Les cellules ont été incubées pendant 24, 48 et 72 h dans le milieu RPMI 1640 avec soit 16 µM de fullerène C₆₀, soit HL seul, soit leur combinaison. La viabilité des cellules incubées sans C₆₀ ou HL a été considérée comme 100 %.

À 24 h d'incubation, aucun effet de HL sur la viabilité des cellules CCRF-CEM n'a été observé (Fig. 5). Cependant, à des incubations plus prolongées, l'activité cytotoxique de HL aux concentrations 5 et 10 µM est devenue évidente, la viabilité cellulaire à 48 h étant inhibée de 25 et 33 % respectivement, et continuant à chuter à 72 h.

Viabilité des cellules CCRF-CEM incubées avec le diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL) à différentes concentrations. (M ± m, n = 8) ; *p < 0,05 comparé aux cellules témoins.

Il faut noter que la diminution de 50 % de la viabilité des cellules CCRF-CEM (IC₅₀) a été détectée à 72 h sous l'action de HL à la concentration de 10 µM (Fig. 5). Récemment, nous avons montré qu'un autre représentant des CAPh, le dimorfolido-N-trichloroacetylphosphoramide, causait une diminution de 50 % de la viabilité des cellules CCRF-CEM à 72 h à une concentration de 1 mM. L'analyse comparative de ces données démontre que l'introduction de groupes phénoxy au lieu de groupes morfolido dans la structure du dérivé CAPh a permis de diminuer de deux ordres sa concentration toxique effective contre les cellules leucémiques. Nous supposons que la flexibilité conformationnelle du noyau –P(O)(OC₆H₅) a assuré une interaction plus efficace de ce composé avec l'ADN.

Aucune influence du fullerène C₆₀ utilisé seul sur la viabilité cellulaire pendant la période d'incubation n'a été détectée (données non présentées). En même temps, les résultats montrés à la Fig. 6 démontrent que le fullerène C₆₀ intensifie l'activité cytotoxique de HL contre les cellules CCRF-CEM. Sous l'action combinée du fullerène C₆₀ et HL, une diminution de 50 % de la viabilité cellulaire a été observée à une concentration plus faible de HL (5 µM) et à une période plus précoce (48 h) d'incubation que sous l'action de HL seul. De plus, à 72 h d'action combinée du fullerène C₆₀ et HL, l'effet cytotoxique de HL a été détecté à une faible concentration de 2,5 µM à laquelle HL seul n'avait aucune influence sur la viabilité cellulaire (Fig. 6).

Viabilité des cellules CCRF-CEM incubées avec le diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL) seul ou en combinaison avec 16 µM de fullerène C₆₀. (M ± m, n = 8) ; *p < 0,05 comparé aux cellules témoins ; #p < 0,05 comparé à HL.

Ainsi, le fullerène C₆₀ a été montré pour potentialiser les effets cytotoxiques de HL et augmenter significativement la sensibilité des cellules leucémiques à son action à faible concentration. En tenant compte que le fullerène C₆₀ est capable de s'accumuler à l'intérieur des cellules leucémiques sur 24 h et de se localiser dans les compartiments intracellulaires, particulièrement dans le noyau, son interaction avec l'ADN nucléaire des cellules cancéreuses activement prolifératives ne doit pas être exclue.

Donc, les données obtenues in vitro sont en accord avec les résultats de l'étude in silico et démontrent que la liaison initiale de la molécule de C₆₀ puis de HL avec le sillon mineur de l'ADN avec formation d'un complexe stable pourrait être l'une des raisons possibles de leur inhibition synergique de la prolifération des cellules CCRF-CEM.

Résistance des érythrocytes à l'hémolyse

Lors de l'évaluation du potentiel anticancéreux de la combinaison HL et fullerène C₆₀, il est important de prendre en compte ses effets possibles sur les cellules non malignes, en particulier sur les cellules sanguines.

L'étude de la résistance des érythrocytes à l'hémolyse acide permet d'élucider l'influence de l'agent pharmacologique au niveau de la membrane. La dynamique de l'hémolyse reflète la dynamique de la perturbation de la membrane plasmique de l'érythrocyte et donc la stabilité de son organisation structurale. À la Fig. 7, la dépendance du pourcentage d'hémolyse des érythrocytes incubés pendant 1 h dans une solution NaCl sans additions (témoin) et avec soit HL, soit fullerène C₆₀ seul ou en combinaison. Aucune influence de 16 µM de fullerène C₆₀ sur l'hémolyse des érythrocytes n'a été détectée (non montré). HL à la concentration de 2,5 µM seul ou en combinaison avec C₆₀ n'a pas affecté la résistance des érythrocytes à l'hémolyse (Fig. 7). Pendant ce temps, sous l'action de HL à la concentration de 10 µM, une accélération de l'hémolyse avec un maximum à 20 s a été détectée. L'action combinée de 10 µM HL et de fullerène C₆₀ a été suivie par une intensification supplémentaire de l'hémolyse avec 60 % d'érythrocytes hémolysés à 20 s.

Résistance des érythrocytes à l'hémolyse en présence de diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL) séparément et en combinaison avec 16 µM de fullerène C₆₀. (M ± m, n = 8).

Les données obtenues ont montré que l'application du fullerène C₆₀ en combinaison avec 2,5 µM HL n'avait aucun effet nocif sur la stabilité structurale de la membrane des érythrocytes sanguins et permettait en même temps d'augmenter significativement l'activité cytotoxique de HL à cette faible concentration contre les cellules leucémiques. Malgré l'effet cytotoxique synergique du fullerène C₆₀ et HL à 10 µM contre les cellules leucémiques, l'application de leur combinaison semblait limitée par l'intensification de l'effet hémolytique.

Enfin, dans le contexte de l'étude in vitro ci-dessus, il est important de souligner qu'une interface eau/solide a de l'eau confinée qui peut également affecter à la fois le transport, les propriétés thermodynamiques des nanostructures, et leur interaction avec les membranes cellulaires.

Il existe des données de littérature sur la localisation intracellulaire des dérivés de carbacylamidophosphates, en particulier, la pénétration des phosphoramidates dans les cellules. Ainsi, les dérivés de phosphoramidate peuvent pénétrer à travers la membrane du cancer du sein MDA-231 et des lignées cellulaires de cancer du poumon (H460, H383 et H2009). Les mustards de nitrobenzyl phosphoramide ont été montrés pour perméer à travers les membranes cellulaires et se localiser dans les mitochondries des cellules mammifères NTR⁺. Il n'est pas exclu que le fullerène C₆₀, capable de pénétrer la membrane de la cellule cancéreuse par diffusion passive ou endocytose, avec accumulation dans le noyau et les mitochondries, puisse être un transporteur de petites molécules antitumorales.

Conclusions

Un nouveau représentant des dérivés de carbacylamidophosphates qui ont deux substituants phénoxy près du groupe phosphoryle, le diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate (HL), a été synthétisé et testé comme agent cytotoxique seul et en combinaison avec le fullerène C₆₀. Selon les résultats de simulation moléculaire, lorsque le fullerène C₆₀ puis HL étaient liés avec un sillon mineur de l'ADN, un complexe rigide était formé, stabilisé par des interactions d'empilement des groupes phényl de HL avec le fullerène C₆₀ et le nucléotide G de l'ADN, ainsi que par des interactions du groupe CCl₃ de HL par liaisons ion-π avec la molécule de C₆₀ et par liaisons électrostatiques avec le nucléotide G de l'ADN.

Grâce au test MTT, nous avons montré l'activité cytotoxique de HL contre les cellules leucémiques humaines CCRF-CM avec une valeur IC₅₀ détectée à 10 µM à 72 h de traitement cellulaire. L'effet cytotoxique de HL a été facilité par le fullerène C₆₀. Sous l'action combinée de 16 µM de fullerène C₆₀ et HL, la valeur d'IC₅₀ a été détectée à une concentration plus faible de 5 µM HL et à une période plus précoce de 48 h d'incubation, et de plus, l'effet cytotoxique de HL a été observé à une faible concentration de 2,5 µM à laquelle HL seul n'avait aucune influence sur la viabilité cellulaire.

Précédemment, nous avons montré un effet toxique significatif du dimorfolido-N-trichloroacetylphosphoramide contre les cellules leucémiques humaines de différentes origines, mais sa concentration effective était élevée et aucune augmentation de toxicité après action combinée avec le fullerène C₆₀ n'a été observée. Nous supposons que l'introduction de groupes –P(O)(OC₆H₅) flexibles au lieu de groupes morfolido dans le dérivé CAPh a contribué à abaisser sa concentration toxique contre les cellules leucémiques humaines, assurant son interaction efficace avec la molécule de C₆₀ et l'ADN. La liaison du fullerène C₆₀ et HL avec le sillon mineur de l'ADN avec formation d'un complexe stable est supposée être l'une des raisons possibles de leur inhibition synergique de la prolifération des cellules CCRF-CEM.

Nous avons révélé que l'application du fullerène C₆₀ en combinaison avec 2,5 µM HL n'avait aucun effet nocif sur la stabilité structurale de la membrane des érythrocytes sanguins, tandis que la combinaison du fullerène C₆₀ avec 10 µM HL semblait limitée par l'intensification de l'effet hémolytique.

Ainsi, le fullerène C₆₀ a été montré pour potentialiser l'effet cytotoxique de HL et augmenter significativement la sensibilité des cellules leucémiques humaines à son action à faible concentration. Une combinaison de fullerène C₆₀ avec HL à une faible concentration de 2,5 µM peut être prometteuse pour de futures études biomédicales.

Abréviations

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

ADN :

Acide désoxyribonucléique

FBS :

Sérum fœtal bovin

HL :

Diphényl-N-(trichloroacétyl)amidophosphate

IR :

Spectroscopie infrarouge

DM :

Dynamique moléculaire

MTT :

3-(4,5-Diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2-H-tétrazolium bromure

RMN :

Résonance magnétique nucléaire

RPMI - 1640 milieu :

Milieu Roswell Park Memorial Institute