De minuscules nanoparticules de fluorure de terres rares activent la croissance des cellules tumorales via des interactions polaires électriques

Contexte

La tumorigenèse est un problème multidimensionnel impliquant des changements génomiques. Il est également activé par les interactions cellule-matrice extracellulaire (ECM) entre les échafaudages et les structures cytosquelettiques [1,2,3,4] exprimées via le stress de mécanocapteurs, similaires aux intégrines, à partir de forces cellulaires multipartites capables de modifier la programmation génomique [5]. Les interactions du microenvironnement tumoral avec les échafaudages de la MEC activent généralement les protéines d'adhésion focale membranaire de la cellule et les récepteurs de signaux transmembranaires (TSR), les récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGFR), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGFR) ou les récepteurs du facteur de croissance nerveuse (NGFR). Les mécanocapteurs régulent la croissance des cellules tumorales via une transaction de signal entre le domaine actif extracellulaire des cellules [6,7,8,9] et les filaments intracellulaires d'actine F, en déclenchant une avalanche de réactions de phosphorylation.

Les changements de conformation des protéines et l'excitation des voies TSR nécessitent que la force d'activation se situe dans la plage de force pN, et certainement en dessous de la jauge nN [10]. Outre les contraintes mécaniques aléatoires et la force d'affinité chimique active, l'efficacité de liaison (force de liaison) entre les nanoparticules (NP) et les protéines de la membrane cellulaire peut être modulée via des interactions polaires électriques ou d'autres types d'interactions dispersives à courte ou à longue distance. Sur la surface limitée des NP, seul un certain nombre de protéines peuvent être attachées assez longtemps pour être biologiquement actives [11], et les interactions locales confinées dans l'espace avec le milieu biologique ont été reconnues comme responsables d'un ensemble de fonctionnalités cellulaires divergentes. parcours [12]. Par conséquent, les voies de transaction du signal provenant de l'interaction protéine-NP signalent des problèmes de sécurité pour les NP [11, 13].

Étant donné que la réponse favorable ou défavorable des cellules des NP est spécifique au type [11], le lien entre les NP et les marques biologiques doit être établi au cas par cas [14, 15].

Les résultats contradictoires des cellules tumorales exposées aux NP, que ce soit pour l'efficacité de croissance ablative ou tumorale ou pour les niveaux de toxicité variables des NP [16, 17], font également apparaître les problèmes de sécurité. Néanmoins, malgré les progrès, il existe aujourd'hui un manque de connaissances sur les voies spécifiques par lesquelles les NP interagissent avec les cellules eucaryotes, empêchant l'identification d'une approche thérapeutique universelle des NP. Étant donné que les NP de tailles différentes et les chimies de surface diverses détournent généralement les réponses cellulaires, y compris la liaison NP-récepteur membranaire et l'activité des TSR, la toxicité des NP est liée à la morphologie des tensioactifs, à l'état de charge électrique, à la concentration et à la composition des protéines et des nanomatériaux dans la MEC. [18,19,20,21] et enfin la force de la liaison moléculaire entre les NP et les phénotypes cellulaires [22].

Des études antérieures sur le mélanome et les carcinomes du col de l'utérus exposés à la silice, aux NP d'or et aux nanotubes de carbone ont reconnu que la taille des NP active sélectivement la croissance des cellules tumorales [23,24,25,26,27]. La corrélation entre les signaux TSR dans la lignée cellulaire cancéreuse humaine SK-BR-3 et la taille des nanoparticules d'or et d'argent modifiées a démontré que bien que des nanoparticules de taille 2 à 100 nm aient reformé la transduction du signal, une immense différence dans l'activité apoptotique était atteinte lorsque les cellules interagissaient avec 40 NPs de taille –50 nm [26]. Récemment, il a également été suggéré qu'en changeant la taille des nanoparticules d'or de 5 à 40 nm, les taux de croissance des lignées cellulaires cancéreuses A549 et 95D étaient éventuellement ajustés. Plus précisément, les NP de taille 5 nm ont inhibé toute prolifération des deux types de cellules, tandis que les NP de taille ~ 10 nm n'ont eu aucun effet sur la croissance cellulaire [27]. De même, les cellules A549 et THP-1 exposées au SiO₂ Les NPs présentaient une cytotoxicité dépendante de la taille ainsi que des NPs de taille 15 nm étaient également corrélées avec des niveaux élevés de cytotoxicité. Au contraire, les NP de taille 60 nm présentaient une toxicité plus faible. Enfin, les NP de 200 nm ont augmenté la croissance des cellules souches grâce à l'activation d'ERK1/2, tandis que les NP de 2 à 4 m ont été capables d'activer différentes voies de transduction du signal [28]. Les NP de petite taille conjuguent l'EGFR et activent les voies de transaction des signaux de la protéine kinase B (AKT) et de la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) qui enflamment la croissance cellulaire.

Les nanoparticules de terres rares (RE-NP) peuvent également interagir avec des domaines spécifiques tels que les sites d'adhésion dépendant des ions métalliques (MIDAS), l'ajustement à MIDAS (ADMIDAS), les sites de liaison des ions métalliques synergiques (SyMBS) et le site de liaison de l'adhésion du ligand (LABS) , situé dans le α_{ν 3} sous-unité ou d'autres sous-unités d'intégrines [29, 30].

De même, les RE-NP entraînent un degré supplémentaire de souplesse dans l'interaction des NP tumorales [31,32,33,34]. Alors que les NP de cérium (nanoceria) ont montré une action protectrice contre les dommages cellulaires causés par différents radicaux [35], de faibles niveaux de concentration de NP de cérium modifiés ont fortement stimulé la prolifération des cellules d'hépatome en réduisant l'apoptose via l'activation des voies de signalisation AKT/ERK [36]. Typiquement, un ensemble de NP entourant la cellule est responsable d'un stress cytosquelettique et supporte également une interaction chimique, nano thermodynamique (Hill) [37], entropique ou électrique dipolaire entre les NP et les mécanocapteurs. Cependant, jusqu'à présent, un cas de compréhension des interactions entre les NP, les TSR et les cellules reste vague et indisponible.

En principe, le fort caractère ionique des composés RE devrait stimuler les mécanocapteurs des cellules via des interactions électriques. De plus, étant donné que les ions RE sont largement utilisés dans différentes applications, il est essentiel d'examiner leur contribution potentielle à la croissance des cellules tumorales pour impliquer des protocoles de protection de la santé publique appropriés. Fluorure de lanthane (LaF₃ ) et le fluorure de praséodyme (PrF₃ ) sont utilisés dans les lampes fluorescentes, les verres colorés à rayonnement, les fibres optiques, les applications d'émail et les électrodes. LaF₃ est élaboré dans un type spécifique de verres, de revêtements de lampes au phosphore, de traitement de l'eau et de catalyseurs. C'est également un composant essentiel d'un verre fluoré commercial (ZBLAN), qui, mélangé au fluorure d'europium, est utilisé pour les communications optiques et comme membrane cristalline dans les électrodes fluorées sélectives d'ions avec une bonne transmittance dans l'infrarouge. De même, PrF₃ est également utilisé dans les lampes à arc au carbone pour l'industrie cinématographique, l'éclairage de studio et les lampes de projecteur. Les verres fluorés dopés au praséodyme sont également utilisés dans les amplificateurs à fibre optique monomode.

Ainsi, ce travail démontre que les RE-NP de petite taille avaient le pouvoir de stimuler la croissance des cellules tumorales via des interactions dipolaires électriques.

L'article est organisé en trois sections. Tout d'abord, la distribution de taille, les interactions et la géométrie des NPs sont analysées en appliquant la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la microscopie à force atomique (AFM), la microscopie électronique à transmission (TEM), la diffraction des rayons X (XRD), rapide bidimensionnelle Analyse par transformée de Fourier (2D-FFT) et spectroscopie ultraviolette sous vide (VUV 110-180 nm). Ensuite, la corrélation entre le niveau de croissance de trois lignées cellulaires cancéreuses humaines différentes (A549, SW837 et MCF7) avec la distribution de taille et la concentration de LaF₃ et PrF₃ NPs est établi. Enfin, dans une limite de force requise de 1 pN pour activer les mécanocapteurs et par la suite la croissance des cellules tumorales, la viabilité des cellules tumorales s'inscrit dans un motif théorique d'interaction dipolaire électrique entre un RE-NP et un LABS. Le travail contribue à l'identification et à la classification de différents types de stress cytosquelettique et d'interactions entre les NP et les cellules mécanosensorielles des cellules cancéreuses.

Résultats

Taille et structure des NP

Premièrement, la spectroscopie DLS, AFM, TEM, XRD, FFT, VUV et t des statistiques de test ont été appliquées pour extraire la distribution de taille des RE-NP dans des suspensions liquides (Figs. 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7). Ensuite, des tests de viabilité des cellules et des tests de transfert Western (Wb) ont été utilisés pour identifier l'activation des mécanocapteurs spécifiques par les RE-NP.

Spectres de distribution granulométrique DLS des suspensions RE. a, b PrF₃ et LaF₃ NPs (5 g/L) dans l'eau. c, d PrF₃ et LaF₃ NPs (5 g/L) dans DMEM+FBS. e, f PrF₃ et LaF₃ NPs (0,1 g/L) dans DMEM+FBS. g, h Rayon hydrodynamique moyen (MHR) avec écart type de PrF₃ et LaF₃ NPs dans DMEM+FBS à différents niveaux de concentration

AFM numérique (x , y ) histogrammes de taille des RE-NP. (a1–d1 ) PrF₃ (2 × 2 μm ² ) et LaF₃ (1 × 1 μm ² ) NPs dans les suspensions DMEM+FBS. (a2–d2 ) (x , y ) histogrammes de taille du diamètre moyen de l'aire du cercle égal \( \left(\overline{d}\right) \) des RE-NPs. (a3–d3) (x , y ) histogrammes de taille des diamètres de zone de Feret \( \left(\overline{\ F.D.}\right) \) des RE-NPs. (a4–d4 ) Histogrammes de l'angle de Feret (F.A.) par rapport au x -axe. Les RE-NP étaient orientés le long de deux directions principales entre ±(44-60°)

TEM numérique (x , y ) histogrammes de taille des RE-NP. (a1, b1 ) Images TEM de RE-NP. Les lignes jaunes indiquaient les limites 2D entre les RE-NP. (a2, b2 ) (x , y ) histogrammes de taille du diamètre moyen de l'aire du cercle égal \( \left(\overline{d}\right) \) des RE-NPs. (a3, b3 ) (x , y ) histogrammes de taille du diamètre de la zone de Feret \( \left(\overline{\ F.D.}\right) \) des RE-NPs. (a4, b4 ) Histogrammes de l'angle de Feret (F.A.) par rapport au x -axe avec des directions préférentielles à ±(44–60°). (c ) Histogramme de taille du diamètre de Feret des RE-NPs de petite et petite taille extraits des images AFM et MET pour 4 m ² zones

Histogrammes des paramètres de surface (hauteur z) de PrF₃ et LaF₃ RE-NPs sur un substrat de verre dans du DMEM+FBS et de l'éthanol pour différentes zones de balayage. un , e Rugosité de la zone. b , f Zone RMS. c , g De taille moyenne. d , h Z maximum -plage

AFM et images optiques de RE-NPs séchées dans DMEM+FBS. un –d Optique (a ) et des images AFM (b –d ) de DMEM+FBS montrant des structures auto-assemblées de 5 µm. e –h CCD (e ) et des images AFM (f –h ) de PrF₃ NPs dans des supports DMEM+FBS montrant des structures auto-assemblées de dendrites à 500 nm. je –l CCD (i ) et des images AFM à différents grossissements (j –l ) de LaF₃ NPs dans DMEM+FBS montrant des structures auto-assemblées de dendrites de 100 nm

Spectres 2D-FFT de z -répartition en hauteur des RE-NPs séchées dans des milieux DMEM+FBS témoignant de la présence de NPs de petite taille dans les suspensions liquides. un , b Distribution de hauteur z de PrF₃ NPs à partir d'images AFM, Fig. 2(a1, b1). Petit z -les caractéristiques de hauteur (~ 5 nm) ont été identifiées dans (b ). c , d distribution de la hauteur z de LaF₃ NPs à partir d'images AFM, Fig. 2(c1, d1). e , f Spectres de puissance de z -vecteurs d'onde de hauteur de PrF₃ NPs le long du x -axe. g , h Spectres de puissance de z -vecteurs d'onde de hauteur de LaF₃ NPs le long du x -axe

Spectres XRD de a PrF₃ et b LaF₃ NPs. Les diamètres de surface moyens de PrF₃ et LaF₃ Les NP étaient de ~ 23 ± 4 et ~ 15 ± 4 nm, respectivement

DLS

Des mélanges hétérogènes nuageux ont été initialement formés en ajoutant des RE-NPs dans des milieux de culture cellulaire, démontrant la complexité des interactions entre les RE-NPs dans des suspensions liquides. Des structures minuscules (< 10 nm), petites (> 10 et < 20 nm) et de grande taille (> 20 nm) de RE-NP ont été identifiées pour les deux PrF₃ et LaF₃ solubles (Fig. 1a–d).

Les valeurs moyennes du rayon hydrodynamique (MHR) des RE-NP de grande taille (55-83 nm pour PrF₃ et 99-296 nm pour LaF₃ ) étaient directement et inversement proportionnelles au niveau de concentration des NP (0,1–10 kg m ⁻³ ) dans du liquide Eagle modifié de Dulbecco avec du sérum bovin fœtal (DMEM+FBS), Fig. 1g, h. Aussi, le MHR de petite taille LaF₃ et PrF₃ Les NPs sont restées constantes, 10,66 ± 0,74 nm et 10,64 ± 0,40 nm, respectivement, à différents niveaux de concentration de RE-NPs. Le MHR des RE-NPs est resté inchangé pendant au moins 6 jours. Après séchage des suspensions de RE-NPs, il était impossible de redissoudre la poudre de RE, car des agglomérations de grande taille se sont stabilisées par de fortes interactions forçant la précipitation.

Imagerie AFM et TEM des RE-NP et analyse de surface

Pour une distribution de taille fiable et des statistiques de RE-NP de petite taille dans DMEM+FBS à 0,1 kg m ⁻³ AFM (zones de balayage 1 × 1 et 2 × 2 μm ² ) et l'imagerie MET ont également été appliquées (Fig. 2(a1–d1) et Fig. 3(a1, b1)). Après avoir transféré les gouttes liquides des RE-NPs dans DMEM+FBS sur le substrat de verre, un nombre relativement important de minuscules RE-NPs non agrégées a été identifié [38] à partir à la fois de la taille moyenne et du diamètre moyen de Feret des NPs ( Fig. 2(a2–d2, a3–d3) et Fig. 3(a2, b2, a3, b3)). De plus, les histogrammes de la distribution des angles des diamètres de Feret AFM et TEM (pour la plus grande dimension des NP) indiquaient que les deux RE-NP étaient orientés préférentiellement le long de deux directions entre ± (44–62 ^o ), par rapport au x -axe (Fig. 2(a4–d4) et Fig. 3(a4, b4)).

Malgré cela z -la distribution de la hauteur des NP n'a fourni aucune information directe sur la distribution globale de la taille des NP, c'est un outil comparatif pratique pour la première estimation de (x , y ) distribution de taille car la hauteur z et (x , y ) les distributions restent interdépendantes [38].

Les paramètres de surface moyens des deux PrF₃ et LaF₃ dans des suspensions séchées pour différentes zones de balayage AFM sont également illustrés à la Fig. 4. Le petit z -les valeurs de hauteur indiquaient un z très uniforme -répartition en hauteur des deux RE-NP pour les petits 1 × 1 μm ² zones de balayage. Au contraire pour les RE-NPs et les zones de balayage plus grandes, le z -la distribution en hauteur était significativement plus large. Le faible z -les valeurs de distribution de hauteur sur de petites zones de balayage reflètent la présence de RE-NP de petite taille dans les suspensions liquides. Les valeurs des paramètres de surface dans le milieu DMEM+FBS étaient en moyenne plus importantes que dans l'éthanol, montrant un état réactif complexe entre les protéines et les RE-NPs, en accord avec la structuration multifacette de la Fig. 5 et les données 2D-FFT (Fig. 6 ). Dans l'ensemble, LaF₃ Les NP ont présenté une réponse intrigante dans les suspensions séchées et des paramètres de rugosité de surface plus étendus que PrF₃ NPs.

FFT

Des anneaux colorés ont été ajoutés dans des rayons sélectionnés dans les spectres 2D-FFT (Fig. 6a–d). Les cycles représentent différentes distributions de taille de NP dans l'espace euclidien, d'une taille minuscule égale à la taille d'un pixel (1,9 à 3,9 nm) à une taille considérable de ~ 2 m, qui était la limite de balayage supérieure de la pointe de l'AFM dans le z -axe (Fig. 6e–h). Un déconvolué des z -les valeurs de hauteur avec le rayon de la pointe de l'AFM fournissent une résolution réelle dans le z -répartition en hauteur de ~ 5 nm. Les spectres 2D-FFT ont démontré une distribution intense des vecteurs d'onde près du centre, en raison d'un z moyen -hauteur des RE-NPs de ~ 44 nm. Les motifs FFT présentaient une structure de halo, qui s'estompe progressivement, en raison d'une large structure polydispersée de petite taille identifiée dans les spectres 2D-FFT. Comme seul le halo apparaissait dans les spectres sans aucun motif de diffraction pour les deux spectres 2D-FFT, des structures auto-assemblées régulières manquaient. Les longueurs de corrélation caractéristiques obtenues à partir des motifs 2D-FFT en anneau de PrF₃ et LaF₃ étaient ~ 51, 70 nm et 28, 49 nm, respectivement, en accord avec les valeurs MHR extraites des spectres DLS.

XRD

La spectroscopie XRD a caractérisé la structure cristalline et a fourni des informations complémentaires sur la taille de PrF₃ et LaF₃ NPs (Fig. 7). Les pics de diffraction pointus, correspondant à la structure de phase hexagonale standard pour les deux RE-NPs, révèlent un état cristallin élevé des phases d'agglomération. En utilisant la formule de Scherrer (\( \tau =\frac{0.9\lambda }{\beta \cos \left(\theta \right)}\Big) \), le diamètre moyen moyen du cercle à aire égale (MEAC) τ de PrF₃ et LaF₃ Les NP ont été estimées à ~ 23 ± 4 et ~ 15 ± 4 nm, respectivement.

Spectroscopie VUV

Le spectre de transmission VUV du PrF₃ hydroscopique Couche de NPs déposée sur CaF₂ substrat, de 125 nm (~ 10 eV) à 190 nm (~ 6,5 eV) est montré dans Fig. 8. Les pics VUV à 140-170 nm précédemment attribués aux transitions de Pr ³⁺ ions trivalents du sol 4f configuration de l'état électronique aux composants Stark du 4f5d configuration électronique à l'intérieur de YF₃ , LaF₃ , KY₃ F₁₀ et LiLuF₄ matrice monocristalline et ils sont recouverts d'une bande d'absorption VUV de l'eau, révélant la présence de molécules d'eau liées dans le PrF₃ et LaF₃ cristaux.

Spectre de transmission VUV de PrF₃ NPs en suspensions aqueuses déposées sur le CaF₂ séché substrat. Le spectre indique l'attachement et le piégeage de l'eau dans PrF₃ NP

Test de viabilité

Suite à l'analyse de la distribution des tailles et aux statistiques des RE-NP, le test de viabilité des sels de tétrazolium hydrosolubles (WST) a été utilisé pour surveiller la toxicité de la PrF₃ et LaF₃ NPs pour trois lignées cellulaires cancéreuses humaines, la A549 dérivée du cancer du poumon, la SW837 dérivée du cancer du côlon et la MCF7 dérivée du cancer du sein. Trois concentrations différentes de suspensions de RE-NP (0,5, 1 et 5 mM) dans du DMEM+FBS (A549, SW837) et du milieu Roswell Park Memorial Institute avec du sérum bovin fœtal (RPMI+FBS) (MCF7) ont été utilisées. Les lignées cellulaires ont été initialement placées sur des plaques à 96 puits, laissées à attacher pendant la nuit. Pour être dans la zone linéaire de croissance cellulaire et pour éviter la saturation (Fig. 9a) un jour après, milieu frais contenant du PrF₃ et LaF₃ des suspensions ont été ajoutées et des tests de viabilité ont été effectués 24 et 48 h plus tard après l'ajout de RE-NP, ou 48 et 72 h après le moment initial de l'étalement cellulaire. Cependant, pour les trois concentrations et les trois lignées cellulaires en culture, une différence de surcroissance a été détectée, à condition de ne pas remplacer le milieu et de ne pas ajouter de RE-NP supplémentaires dans la culture, pratiques qui modifient les conditions initiales de l'expérience. De plus, il était impossible de plaquer une concentration cellulaire inférieure à ~ 5 × 10 ⁴ cellules par puits car la confluence des trois lignées cellulaires était trop petite pour garantir une croissance cellulaire mesurable. La configuration expérimentale optimale a été établie pour ~ 5 × 10 ⁴ cellules par puits.

un Histogrammes du test de viabilité WST de trois lignées cellulaires cancéreuses différentes (A549, SW837, MCF7) traitées avec différentes concentrations de PrF₃ et LaF₃ NP dans les milieux biologiques. b Image AFM d'une seule cellule cancéreuse A549. c Image AFM d'une cellule cancéreuse A549 divisée dans des RE-NP dans DMEM+FMS. d Analyse de phosphorylation Wb des cellules A549, SW837 avec les voies AKT et ERK

A une concentration plus élevée (5 mM), pour les deux suspensions RE, une croissance ascendante pour toutes les lignées cellulaires a été obtenue (Fig. 9b, c). Parmi eux, la valeur de croissance la plus élevée a été pour la ligne SW837 (86%, LaF₃ ). Moins prononcée, mais toujours pertinente, une prolifération cellulaire (15%) a été remarquée pour la lignée cellulaire MCF7 à 5 mM. Un t analyse statistique de test (p et Fisher F valeurs) des viabilités des cellules tumorales ont montré que la croissance des cellules tumorales était insaturée à 24 h; il suivait une loi physique inconnue reliant la viabilité et la concentration des RE-NP (Fichier supplémentaire 1).

Dosages de phosphorylation

L'état de phosphorylation de deux protéines a également été testé (Fig. 9d). L'utilisation d'anticorps spécifiques et de tests Wb dans les lignées cellulaires A549 et SW837 a poussé dans DMEM+FBS avec 5 mM de LaF₃ et PrF₃ NPs pendant 24 h, une activité de phosphorylation élevée de ERK1/2 et AKT dans les cellules traitées, par rapport aux cellules témoins (CTRL), a été obtenue.

Discussion

Le taux de croissance relatif des cellules cancéreuses augmentait à des niveaux de concentration plus élevés des deux RE-NP (Fig. 9a). Cependant, les valeurs MHR des RE-NP dans DMEM+FBS ont été suivies directement (PrF₃ ) et inversement proportionnelle (LaF₃ ) à la concentration de RE-NPs de 0,1 à 10 kg m ⁻³ (Fig. 1g, h). Par conséquent, les RE-NP d'une taille moyenne supérieure à ~ 55 nm ne devraient avoir aucun effet sur la croissance cellulaire et seules les NP de petite taille peuvent réellement participer à la croissance tumorale.

Taille et structure des RE-NP

Identification des minuscules RE-NP

A partir des données expérimentales, la taille moyenne, la distribution et les paramètres statistiques des RE-NPs ont été extraits. En appliquant t tester les statistiques pour « l'hypothèse nulle » du « cercle moyen à aire égale » des NP dans la PrF séchée₃ et les suspensions DMEM+FBS, les p La valeur du diamètre des NP entre deux images AFM sélectionnées au hasard était ~ 0,001 (Fichier supplémentaire 2). Une valeur de diamètre MEAC (63 nm) a été extraite avec confiance des données AFM, et cela était comparable à la valeur MHR des données DLS (Fig. 1g).

Au contraire, la valeur du diamètre MEAC de LaF₃ sélectionné au hasard les échantillons ont montré un diamètre MEAC moyen de 26 nm avec une valeur de probabilité de rejet plus élevée (p = 0.07), indiquant un comportement divergent de LaF₃ en suspensions liquides. L'écart entre le diamètre MEAC et le MHR de DLS (296 nm) (Fig. 1) est dû à la complexité des interactions dans LaF₃ suspensions à nouveau. En effet, pour un 2 × 2 μm ² Zone de balayage de pointe AFM, le z moyen -la hauteur était de ~ 140 nm, montrant la présence de LaF₃ de grande taille NPs, transférées des suspensions liquides sur le substrat (Fig. 4). Pour « l'hypothèse nulle » de « valeurs de diamètre MEAC égales à partir d'échantillons MET sélectionnés au hasard », le p les valeurs étaient également faibles (p = 0,001). Pour les deux RE-NP, les valeurs moyennes de diamètre MEAC extraites des données combinées TEM et XRD pour les deux PrF₃ et LaF₃ indiqué élevé p valeurs, p = 0,29 et 0,06, respectivement, ne permettant ainsi aucune corrélation entre les données MET et XRD. Uniquement TEM, AFM (PrF₃ ) et les données DLS étaient suffisamment fiables pour extraire le diamètre MEAC et les valeurs core-shell (Fichier supplémentaire 2).

De plus, une distribution angulaire non isotrope des diamètres de Feret a indiqué que PrF₃ et LaF₃ les structures étaient des diélectriques hautement polarisés, car la distribution des angles anisotropes est une indication de fortes interactions polaires électriques entre les nanocristaux. Un état polarisé diversifié de LaF₃ était responsable de la réduction de l'efficacité relative de l'état d'agglomération dans les suspensions et d'une augmentation des paramètres de rugosité de surface dans les échantillons séchés.

Une analyse particulaire logicielle d'images AFM aléatoires pour 5 L et une concentration de 0,1 kg m ⁻³ identifié un certain nombre de ~ 22 et ~ 11 RE-NPs avec une taille inférieure à 15 nm et 10 nm (p = 0.001), respectivement, et un certain nombre de ~ 60 RE-NPs à partir d'images MET (p = 0,001) dans une zone de ~ 4 μm ² , confirmant ainsi la présence de RE-NPs de petite taille dans les suspensions (Fig. 3(c), Fiche complémentaire 2) non détectées avec le DLS.

Structure et géométrie des RE-NPs

La distribution de taille des RE-NPs est divergente dans les suspensions d'éthanol et de DMEM + FBS (Fig. 4). La diversité est due à différentes interactions moléculaires entre les protéines adsorbées, les glucides, les électrolytes et la surface des RE-NP, conduisant à la formation de capes organiques très complexes (corona), qui modulent les interactions spécifiques des RE-NP avec les cellules dans Support DMEM+FBS.

L'interaction entre les molécules d'eau piégées dans les RE-NP hygroscopiques et le DMEM+FBS était également vitale pour la formation noyau-coquille. Il a également eu un effet profond sur les changements protéiques et conformationnels dans les interactions intermédiaires au cours de la phase initiale de préparation. Comme le rapport surface/volume des NP développait des valeurs élevées dans les suspensions, la stabilité effective et les propriétés physico-chimiques, mécaniques et d'écoulement des RE-NP, y compris la capacité à absorber les protéines, étaient extrêmement variées [39,40,41] .

La distribution comparative de la taille des RE-NP dans des suspensions liquides (DLS) et solidifiées via AFM et TEM a montré que les RE-NP étaient encapsulées à l'intérieur de formes organiques formant des structures diélectriques cœur-coquille, où une coquille protéique entoure le cœur RE. L'AFM imagé à partir de RE-NP solidifiés dans des suspensions DMEM + FBS déposées sur des substrats de verre indique également la formation de RE-NP à multiples facettes et de complexes corona protéiques (Fig. 5). Alors que les milieux séchés formaient un motif auto-assemblé régulier de structures cristallines (Fig. 5a–d), les suspensions de RE-NPs séchées présentaient une structure en couches amorphe comportant plusieurs points noirs, visibles même avec l'appareil photo numérique de l'AFM (Fig. 5e–l) . À un grossissement optique plus élevé, des agglomérations discrètes de formes globulaires, plus petites que celles du milieu seul, ont également été détectées pour les deux RE-NP dans DMEM+FBS, ainsi que des structures de type dendrite, toutes deux montrant la complexité des interactions, en accord avec le résultats des paramètres de surface (Fig. 4). Même avec la résolution AFM la plus élevée (1 × 1 m ² zone), la dernière voie de la figure 5, aucune agrégation isolée de RE-NPs, dans la limite de résolution d'environ 5 nm, n'a été identifiée dans les structures séchées pour les deux RE-NPs. Les mycéliums sphériques de couleur noire, longs de 1 à 2 m, montrés sur les images optiques, étaient de grandes formations agglomérantes de RE-NPs core-shell. La complexité des réactions entre les RE-NP et le DMEM+FBS a été visualisée via la transformation des structures allongées auto-assemblées à long terme en DMEM+FBS pur en structures dendritiques.

Les résultats indiquent l'image d'une seule structure centrale RE-NP encapsulée à l'intérieur d'une enveloppe protéique. Ces structures étaient indétectables car elles étaient entourées de matière organique et d'électrolytes, les deux ayant réagi de manière croisée avec les RE-NP. Le spectre VUV de PrF₃ montre quelques pics spectraux entre 140 et 170 nm (Fig. 8). Les transitions ioniques sont chevauchées par une bande d'absorption d'eau VUV étendue de 145 à 180 nm avec un maximum à 168 nm. Seules les signatures spectrales des 4f6 configuration électronique avec maxima à 132 et 127 nm étaient présents dans le spectre. However, these bands could evince the presence of water in the high hygroscopic PrF₃ suspensions. Water has a rich, structured absorption band in the VUV spectral range centred at 122 nm, revealing the presence of water molecules in the core-shell NPs.

Activation of Mechanosensors

Activation of Integrins by External Forces

The activation of oncogenic pathways by RE-NPs [24], besides the 3D structural nature of TSRs, is based on some Natural Evolution principles for sustaining the viability of cells. First, upon binding a specific external ligand in a LABS, conformational changes along the entire TSR spectrum underline a series of cascading pathways, triggering tumour cell growth (Fig. 9c, d). The transmission of signals advances through the plasma membrane via various protein chains. Signal transduction was via conformational transformations of integrins responding to a high affinity external force (Fig. 10a, b).

Simplified layout of integrin activation by NPs and signal transaction pathways. un Structure and conformational geometries of integrins at a low (A), medium (B) and high-affinity strengths (C). b AKT and ERK1/2 signal transaction pathways activated by RE-NPs via external integrin stimulation

Because of “life sustainability” and “survival laws” that prevents cancer cell growth by random “noise”, it is required that the strength of the external force should be within a bounded range of values and also the external strength stimulus should apply for a long period on a large number of mechanosensors in a cancer cell. The external strength that stimulates cancer must be slightly larger than the strength of the interatomic molecular forces under normal conditions. For a thermal energy of a ligand at room temperature (kT  = 0.025 eV, T  = 298 K), and for a regular thermal stress of molecular bonds of ~ 0.05 nm, the mean thermal force acting on the LABS stays for 1.2 × 10 ⁻¹² N. In principle, a force above ~ 10 × 10 ⁻¹² N acting coherently on the whole set of mechanosensors on a cell should activate signal transduction in tumour cells. Consequently, ignoring any thermal and mechanical stressing in the ECM normal conditions, integrin activation via electrical polar interactions between LABS and NPs has the potency to start signal transduction in cancer cells and to initiate tumorigenesis.

Integrin Structure and Geometry

An integrin receptor in the upright conformation state extends ∼ 20 nm upwards from the cell membrane [42] (Fig. 10a). For no contacts between the two α- and β-subunits, other than those in the headpiece near the ligand-binding pocket, the α- and β-subunits are well separated with their cytoplasmic tails extended out up to ∼ 8 nm [42]. A conic projection geometry (20 nm slant height, 5–10 nm diameter of its circular base), bounded by the α- and β-subunits, defines a projected area on the surface of cell’s membrane between ~ 19 and ~ 80 nm ² , for a typical mean radius of a tumour cell R _c  ≈ 5 μm (equivalent surface area of a spherical cell \( {S}_c=4\pi {R}_c^2=3.14\ \mathrm{x}\ {10}^8\ {\mathrm{nm}}^2 \)). By dividing the area S _c of a spherical tumour cell surface with the projected area of an integrin on a cell surface, an upper limit of the number of integrin receptors for these projected areas was n _int  = 1.6 x 10 ⁷ and 3.9 × 10 ⁶ respectivement. These numbers are compared with the mean number of integrins on a cell \( {\overline{N}}_{int}\approx 2\ \mathrm{x}\ {10}^5 \) and for an average interspacing of 45 nm between adjacent integrin receptors [43]. Nevertheless, \( {\overline{N}}_{int} \) might be larger because of an uneven surface structure, different separating distances between integrins and variable size of tumour cells (Fig. 9c), but the number of integrins on a cell membrane stand between n _int and \( {\overline{N}}_{int} \).

Interaction of Mechanosensors with RE-NPs

ERK ½ and AKT Activation

The TEM images and the elemental mapping of F, La and Pr showed that RE-NPs were unable to penetrate inside the cell. They gathered around the A549 cell membrane (Fig. 11), confirming that an external force can stimulate cell growth because of TSRs activation [44]. The Pr atoms were distributed around the boundaries of the cell’s membrane. The small numbers of F, La and Pr identifications inside the cell were not associated with endocytosis of RE-NPs, but they were images of RE-NPs from the projections of the two cells hemispheres on cell’s equatorial cycle.

TEM images and elemental analysis of RE-NPs at the surface boundaries of A549 cells. un TEM image of small size LaF₃ NPs surrounding the A549 cells. b Elemental analysis of F atoms in RE-NPs distributed around the cell. c Elemental analysis of La atoms. The low concentration of La atoms was associated with a rather small scattering efficiency of the X-rays. d –f The same as for (a –c ) for PrF₃ RE-NPs

It was also evident that both RE-NPs were able to enhance AKT phosphorylation, especially in A549 cells (Fig. 9d), where the steady-state level of AKT pathway activity was higher for the SW837 cell line. The phosphorylation level for the MCF7 cell line was below the detection limit, in agreement with the relatively low levels of growth. High phosphorylation levels of ERK1/2 [36] and AKT were detected in A549 and SW837 cell lines. Cell growth was started once NPs with a proper size interact with the mechanosensors of the cells to provide the correct force for initiating cell growth [45, 46]. ERK and AKT pathways were frequently active in several cancer cell types via extracellular springing, as they were stimulated by the TSRs, upon a selective binding with various mitogenic ligands, or via the activation of the mechanosensory group. The interaction was responsible for a continuous intracellular stimulation that, according to the cell’s phenotype, driven the cancer cells to uncontrolled and endless growth. Viability tests were also run for 48 and 72 h, but the growth of all cell lines was saturated at 48 and 72 h after the initial moment of Cell plating.

Interaction of Cells with Ions

Likewise, as fluoride anions are the most reactive electronegative elements and, the mean radii extension of the unscreened 4f electronic configuration of La and Pr trivalent ions are relatively large, high electric surface charges could be developed via electric dipole interactions [47].

One crucial question stands whether a single ion binding on a specific site can activate tumour cell growth. Because the projected area of the 4f electronic configuration of a single RE ion is S _4f  = 0.040 and 0.043 nm ² (for an approximated spherical geometry of the 4f electronic configuration and a 4f mean orbital radii ~ r _4f =0.113 and 0.117 nm for Pr and La ions, respectively), a typical upper limit number of single RE ions, or other equivalent size ions, over the whole area of the cell membrane was ~ S_c / S _4f  = N _4f ~7.9 × 10 ⁹ RE ions; a number which is at least two orders of magnitude above the upper limit of the mean number of integrins on a tumour cell. As the relative overgrowth of cells was ascending with rising concentration (Fig. 9a), it is unlikely that tumour cell growth is triggered by a specific binding of single trivalent RE ions [48] on the ligand sites [49,50,51]. Indeed, the large number of RE ions should have saturated the cell’s growth and thus the viability of cells should have remain independent from the concentration of the RE ions.

Interaction of Integrins with RE-NPs

Within the requisite force range of few pN, and for efficient activation of integrins from NPs, the interaction between NPs and LABS should activate a large fraction of integrins of the cell for a long time. In the most extreme favoured case for cell growth, the number of NPs had to remain equal with the number of integrins on the cell’s surface, and the interactive force between LABS and NPs has to be attractive for obtaining a constant (long-term) action. A thin spherical shell of spherical NPs surrounding a tumour cell occupied a volume\( {V}_{sc}\approx 4\uppi {R}_c^2x \), where R _c  = 5 μm is the cell radius and x  ≈ 20 nm is half the separating distance between adjacent integrin receptors and V _sc  ≈ 6.3 x 10 ⁹ nm ³ . For justifying the requirement that each integrin receptor interacts only with one NP, a first estimation of the size of NPs to meet the above requirements for the whole set of integrins on a cell is obtained by dividing the volume of the spherical shell V _sc with the number of integrins. A simple calculation for a cell radius 5 μm shows that the limits of radii of NPs activating the whole set of integrins within the spherical shell volume V _sc  ≈ 6.3 x 10 ⁹ nm ³ covering the cell is obtained by divided the volume V _sc with the number of integrins \( {\overline{N}}_{int}\approx 2\ \mathrm{x}\ {10}^5 \) and n _int  ≈ 1.6 x 10 ⁷ . The volume of the spherical NPs stands for 3.15 × 10 ⁴ and 3.93 × 10 ² nm ³ respectivement. Therefore, the radii of the NPs interacting with an integrin lay between ~ 20 and 5 nm. Allowing for one order of magnitude variations in the number of integrins \( {\overline{N}}_{int} \), the radii of the NPs interacting with integrins is between ~ 27 and ~  3 nm respectively.

By also applying similar simple calculations and within the experimental limits of concentration levels of RE-NPs (0.1–10 kg m ⁻³ ), the maximum numbers of PrF₃ with MHR 55–83 nm and LaF₃ with MHR 296–100 nm NPs (Fig. 1g, h) covering the surface of a tumour cell V _sc stood for 4.1 × 10 ⁴ –2.1 × 10 ⁴ and 17.1 × 10 ² –1.5 × 10 ⁴ NPs. These values are placed well below the number of integrins on the cell surface. For rising concentrations of PrF₃ and LaF₃ from 0.1 and 10 kg m ⁻³ , the number of PrF₃ and LaF₃ NPs in the suspensions must go up for either descending or ascending size of NPs. As viabilities of cancer cells are raised at higher concentration levels, it is unlikely that 55–296 nm sized RE-NPs are responsible for cancer cell mitosis under the current experimental configuration.

Also, from the DLS data, the size of both RE-NPs between 10 and 20 nm remained constant (10.6 nm) at different RE concentrations. The number of RE-NPs with this size covering the cell surface is between 3.7 × 10 ⁵ and 1.5 × 10 ⁶ . This number is comparable with the mean number of integrins \( {\overline{N}}_{int}\approx 2\ \mathrm{x}\ {10}^5 \) on a cell surface. Therefore, only small size RE-NPs have the potency to stimulate cancer cell growth by stimulating all the integrins on a cell surface, in agreement with the experimental observations (Figs. 1g, h and 9a).

The number of tiny sizes RE-NPs with MEAC diameter (TEM) from 2 to 10 and 10 to 15 nm on the cell surface (S _c  = 314 μm ² ) stands for 1.3 × 10 ⁴ and 1.8 × 10 ⁴ RE-NPs, respectively. Those values stayed one order of magnitude below \( {\overline{N}}_{int}\approx 2\ \mathrm{x}\ {10}^5 \) and therefore tiny size RE-NPs had also the potency to justify the experimental results of rising viability values with concentration (Fig. 9a). Also, the rough surface of tumour cell (Fig. 9c) is able to form cavities, where small size RE-NPs are trapped, triggering thus cell’s mechanosensors. Most important, only tiny size RE-NPs have the potency to activate integrin receptors via electrical dipole interactions (vide infra).

Interaction of EGFR with RE-NPs

An upper limit of small size NPs capable of stimulating cell’s overgrowth via the EGFR was set previously to 14 nm [52], but a realistic size of NPs stimulating the EGFR should be < 5 nm [53] (Fig. 12). The area number density of EGFR on the surface of tumour cells stands for ~ 1.4 × 10 ⁻⁴ nm ⁻² and the total number of EGFR on the surface S _c of cells remains between ~ 4.2 x 10 ⁴ and 10 ⁵ [54,55,56]. RE-NPs with 5–10 nm size stayed for a number of 34 NPs (Fig. 3). Extrapolating this number to the surface of a cell S _c , the total number of RE-NPs remained at ~ 10 ⁴ NPs, a number which matches the number of EGFR receptors on a A549 cell. Therefore, the EGFR have the potency to be activated synergistically also by a number of tiny size RE-NPs.

AKT and ERK1/2 signal transduction pathways activated by RE-NPs via EGFR stimulation. EGFR is activated only by tiny size ~ 5 nm NPs

Electric Dipole Interaction Between RE-NPs and LABS

The above experimental results are supported by the hypothesis of cancer cell growth from LABS stimulation by tiny size core-shell RE-NPs via electrical dipole interactions, Appendix.

Indeed, the mean electrical dipole force \( \left\langle {\overrightarrow{F}}_{V_2}\right\rangle \)acting on LABS from a core-shell RE-NP includes two terms (Fig. 13d and Appendix, Eq. A22). The first radial term is inversely proportional to the forth power of separating distance r ₁ between the RE-NPs and LABS and is also proportional to the size of NP. The second polar term is inversely proportional to both the separating distance r ₁ and the square power of the size of NP,

un Electrical dipole interaction between one core-shell RE-NP and one LABS. b , c RE core-shell NP near a MIDAS (b ) and ADMIDAS (c ) adhesion sites. d Locus area (green) of the size of RE-NPs and separating distance between a LABS and a core-shell RE-NP for two electrical charging states

Dans l'éq. 1, G et G ₁ are the geometrical factors of NPs, describing either core-shell or core spherical structures, Appendix, Eqs. A6 and A14; N ₁ , N ₂ are the numbers of surface electrons on the a RE-NPs and LABS surfaces; d et b are the effective characteristic spatial extension of atomic orbitals of LABS, ~ 0.1 nm, and the radius of RE-NP; e et ε ₀ are the electron charge and the vacuum permittivity and \( \theta =\frac{d}{r_1}<0.01\ rad \). Because the core of the RE-NPs is a crystalline semiconductive material, an inherent large number of surface and volume defective sites were accountable for a high density of pseudo-electron energy levels that allowed the electrons to move freely within the core volume [46]. Consequently, a core-shell structure had the potency to be highly polarised. Therefore, LABS can be activated efficiently by core-shell RE-NPs via electrical dipole interactions at close separating distances. The high polarised efficiency of the core nucleus was confirmed experimentally via the selective orientation of NPs along two distinct directions (Fig. 2(a4–d4) and Fig. 3(a4, b4)).

The polar interaction force is also proportional to the geometrical factor G ₁ , Appendix, Eq. A14. Typical values of dielectric constants of the culture media, shell configuration and RE core components stand for ε ₁  = 78, ε ₂  = 10 and ε ₃  = 15. When the ratio of core-shell to core radii b/a sets within 1 and 50, the geometrical factors G , G ₁ retain almost constant values (G  = 0.2, G ₁  = 0.01) and they are self-same for both a spherical core (b/a  = 1) and a spherical core-shell. Any permanent or induced polarisation of an open or closed a-I-MIDAS domain forming the LABS domain has its origin on six coordinated water oxygen atomic orbitals with Mn ²⁺ or Mg ²⁺ ions, arranged in a spherical geometric configuration [7] (Fig. 12a–c).

As the electrical dipole force in Eq. 1 stands for the vector sum of a radial (first term) and a polar component (second term), the last term prevails over the first one provided that

In this case, a LABS is activated from the polar force component for all (b/a) ratios and, most important this term is inversely proportional to the second power of the size of NPs, in agreement with the experimental results that only tiny or small size LaF₃ NPs activated cancer cell proliferation.

The prevailed polar force term for different r ₁ et b values and for different Ν ₁ , Ν ₂ charging states activating the LABS/MIDAS stay within the limits [57,58,59,60].

Inequality 3 relates the size b of the RE core-shell NPs, the separating distance r ₁ and the number of the bound or free electrons Ν ₂ , Ν ₁ on the surface of the two dipoles. The locus of points (r ₁ , b ) satisfying the inequality 3 for different surface charge states Ν ₁ , Ν ₂ is bounded by the black, red and blue lines (Fig. 13c). As there was no specific assumptions for the type of RE-NP, results can be equally applied for any type of polarised NPs.

When the algebraic product of the number of the surface electrons N ₁ et N ₂ (bound or free) on the LABS and the RE-NP, respectively, was N ₁ N ₂  = 2, the locus of RE-NPs size and separating distance for integrin activation was < 1 nm. At higher charging states, N ₁ N ₂ = 10 ⁴ , the locus area spans a wider RE-NPs size and separating distance area set of values, from 0.5 nm–19 nm to 2.5–15 nm, respectively.

From the above analysis, it is found that only tiny or small size NPs can activate LABS at a certain separating distance r ₁ and the electrical dipole interaction strength decays inversely proportional to the second power of the size of NPs. From Fig. 13c and for a charging state with N ₁ N ₂  = 5 x 10 ⁴ , the size of NPs capable to activate LABS is bounded by the limits

Conclusions

Cancer is a complex disease. Tumours are highly heterogeneous, and cell growth, among other factors, depends on dynamical interactions between cells and the continually changing extracellular matrix. Besides random genomic mutations, signal transductions in cells, activating cell growth can be triggered by mechanical, thermodynamic and electrical polar interactions between the microenvironment of the extracellular cell matrix and the membrane’s mechanosensors. Here, we demonstrated that tumour cell proliferation in three different human cancer cell lines (A549, SW837, MCF7) had the potency to be activated by a synchronised and synergetic activation of EGFR or via electrical dipole interactions between tiny size RE-NPs and the LABS of integrins on a cell.

Because the prerequisite force for integrin activation should stand between 10 ⁻¹² and 10 ⁻⁹ N, the size of the active RE-NPs causing cell growth should be within certain limits. Cancer activation is specified by both the electrical surface charges on the LABS and the NPs and by their separating distance. This electric dipole activating force follows an inversely proportional square power law of the radius of NPs, evidencing that only tiny or small size RE-NPs have the potency to stimulate cancer cell growth via electrical dipole interactions, in agreement with the experimental results.

Methods

Synthesis of RE-NPs

PrF₃ NPs were synthesised via co-precipitation. Briefly, 4 g of Pr₂ O₃ were added to 110 mL of 10% nitric acid in a polypropylene glass beaker together with 3 g of NaF under stirring. The mixture was heated to 50 °С and stirred for 45 min until a clear light-green solution appeared. Then it was filtered. The pH of the mixture adjusted to 4 by adding 25% of ammonium hydrate. Next, the mixture was stirred again for 20 min. Finally, the precipitated NPs washed with distilled water by centrifugation.

LaF₃ NPs were also synthesised by applying the same protocol in a mixture of La₂ O₃ (4 g) and NaF (3 g). From both preparations, an aliquot of the suspensions containing NPs was air-dried for structural analysis and the remaining part kept as water suspension for the biological studies.

The suspensions of NPs were prepared in complete DMEM+FBS cell culture medium by adding water suspended NPs directly to the medium to a final concentration of 5 mM. Then, starting from the 5 mM stock solution, some subsequent dilutions using DMEM as a solvent were prepared to a final NPs concentration of 1 mM and 0.5 mM, respectively.

Size Distribution of RE-NPs

XRD

The crystal structure and the size of PrF₃ and LaF₃ NPs were characterised by XRD spectroscopy, with an X-ray diffractometer (Shimadzu XRD-7000S) in the 2θ range from 10° to 80° using the graphite monochromatised Cu-Ka radiation (1.5406 Å). The weighted average of τ for all peaks was used in the statistics. Weighting, besides β, took into account the relative intensity of every peak of the XRD spectra. The corresponding errors incorporate the reading error (0.3 mrad) and the standard error of the mean (se  = σ / √ Ν ).

DLS

The size distribution and the MHR of RE-NPs in water and DMEM+FBS suspension were determined for comparison by DLS at 632.8 nm and right angles at 37 °C with a multi-angle dynamic and static light scattering instrument (PHOTOCOR-FC). The values of the MHR (Stokes radius) and the size distribution of NPs were calculated from the autocorrelation spectra and the Stokes-Einstein relation with the DynaLS software. Because the intensity of scattered light in pure DMEM+FBS was 20 times lower than with RE-NPs additives, the level of aggregating proteins in pure DMEM+FBS was negligible compared with mixed suspensions of RE-NPs in DMEM+FBS medium. MHR and RE-NPs size distribution and size errors were obtained by fitting and processing the data from the DLS instrument with the DynaLS software that allows the MHR to be calculated in different spectral domains of the main size distributions, from 10–10 ² to 10 ² –10 ³ nm, Additional file 2.

AFM

Because size distribution below 15 nm was close to the low limit range of DLS, AFM was also applied to evaluate small size distribution. At low concentration of RE-NPs in liquid suspensions and slow drying rates of droplets on glass substrates, the deposits reflected the size distribution in the liquid suspensions [37]. Following the dispersion of RE-NPs in ethanol or DMEM+FBS, a drop of suspension was placed on a clean glass substrate using a micropipette, and then it was dried in air at room temperature for AFM imaging and analysis (diInnova, Bruker). AFM was performed in the tapping mode, in ambient conditions with a phosphorus-(n)-doped silicon cantilever (Bruker, RTESPA-CP), having a nominal spring constant of 40 nN/nm and operating at a resonance frequency of 300 kHz. Surface areas of various sizes (0.5 × 0.5–50 × 50 μm ² ) were imaged with high spatial resolution (512 px × 512 px) at a scanning rate of 0.2 Hz to identify domains with different size distributions via “scan area filtering” [37]. From the morphological analysis by the SPM LabAnalysis V7 software, the particle’s size distribution, shape and aggregation stage were determined.

The size of NPs for different scanning areas was also noticeable by the particle analysis chromatic bar (Fiji integrated ROI colour coder based on MEAC diameter) (Fig. 2(a1–d1)). The AFM image was transformed into a binary image using an appropriate z -height threshold. Every pixel of the processed image contained information not only for the z -height in the pixel area but also for the presence of particles in the pixel area. The x -histograms of MEAC and Ferret diameter (Fig. 2(a2–d2, a3–d3)) were extracted by using the “Image J 1.51n Fiji distribution software”, with the correct z -height threshold values. The size resolution per pixel was 3.9 and 1.9 nm for PrF₃ and LaF₃ respectively.

The particle identification, the noise extraction and the particle area data were processed by the “Particle Analyser function” of Fiji software (Fig. 2(a1–d1)). The particle diameter histograms were also analysed. Both the equal area circle diameter (Fig. 2(a2–d2)) and Feret diameter or “calliper diameter” (maximum diameter of a particle among all directions) (Fig. 2(a3–d3)), whose direction was the Feret angle (Fig. 2(a4–d4)), were analysed. The mean equal area circle diameter and the mean Feret diameter were calculated taking into account all particles identified. The associated errors incorporated the actual pixel size in every AFM image and the standard error of the mean (se  = σ / √ Ν ).

A t test was performed for every set of AFM images based in the “null hypothesis” that the mean particle diameter was the same for all the AFM images between randomly selected figures (Fig. 2(a1–b1, c1, d1)). Le p value (probability that the null hypothesis based on t distribution is not valid) is shown in Additional file 2.

TEM

The same technique was followed for calculating the above parameters in TEM imaging (Fig. 3(a1–b4)). Atomic resolution TEM (Hitachi HT7700 Exalens) imaged either extracellular or intracellular RE-NPs attachment on the A549 cells fixed in glutaraldehyde. Elemental analysis of F, La and Pr were also carried out (Oxford Instruments X-Max 80T).

2D-FFT

Additional information on the NPs size distribution in the (x , y ) plane was also extracted from the 2-D Fourier transform of AFM images of NPs using the relation

où f (x , y ) is a size function at a point (x, y ), k _x , k _y are the associated wavevectors in the inverse Eukledian space at the same point and I (k _x , k _y ) is the “spectral density” of the function f (x , y ) at the point k _x , k _y . For most applications, f (x , y ) is the z -height of the NPs at the point (x, y ) and z  = f (x , y ).

For a set of discrete data, such as the digitised AFM images, the 2D-FFT was used instead of 2D Fourier transform in the continuous space. For a m  × n  X-matrix (pixels of an AFM image), the 2D-FFT transform takes the form

where \( {\omega}_m^{jp}={e}^{2 pi/m},{\omega}_n^{kq}={e}^{2 pi/n} \) are the associated frequencies. Then, an appropriate shift along the y -axis was performed and the integers m, n, p, q, k were translated into lengths and inverse lengths respectively by a multiplication with the pixel’s size of the image.

Water Trapping in RE-NPs

VUV Spectroscopy

To appraise the state of water in RE-NP’s complexes during the initial stage of suspension preparation, the adsorption of water molecules on the surface of the hygroscopic PrF₃ NPs was identified with a laboratory-made VUV (110–180 nm) absorption spectrometer. It consists of a hydrogen lamp operating in a longitudinal stabilised discharge mode at 10 kV, a stainless steel vacuum chamber and a VUV monochromator (Acton VM502), equipped with a solar blind photomultiplier (Thorn EMI 9412 CsTe) and a laboratory-made data collection system. Thin layers of PrF₃ NPs suspensions in water were prepared and dried on 1-mm-thick VUV-grade CaF₂ substrates by applying the “drop-casting method”. Then, the CaF₂ substrates were placed in the optical path between the hydrogen lamp and the VUV monochromator in a vacuum. The stainless steel 316 vacuum chamber was evacuated initially to 10 ^− 7 mbar using two turbomolecular pumps at a differential pumping configuration (Edwards EXT 100/200, pumping speed 150 ls ⁻¹ ). However, a high outgassing rate of PrF₃ sets an upper limit to the background pressure in the vacuum chamber ~ 8.5 × 10 ⁻⁵ mbar. The relatively low background pressure of both compounds irreversibly damages the VUV optics and the turbomolecular pump after few hours of operation and therefore it sets certain experimental constraints, preventing an equivalent registration of LaF₃ spectrum because of high outgassing rates and a low background operating pressure (< 10 ⁻⁴ mbar). The experimental data (light transmitted through the sample film on CaF₂ window) were fitted to a logarithmic response for calculating the transmittance.

Cell Culture and Growth Assay

Cell Growth

The A549 and SW837 cell lines were maintained in DMEM+FBS, whereas the MCF7 lines were in RPMI+FBS. Both media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1 × penicillin, 1 × streptomycin and 2 mM l-glutamine. Cells were incubated at 37 °C, 5% CO₂ in a humidified atmosphere.

The WST viability test was used to monitor the intrinsic toxicity of PrF₃ and LaF₃ NPs for three human cancer cell lines, A549, SW837 and MCF7. For the viability assay, three different concentrations of RE solubles (0.5, 1 and 5 mM) in DMEM+FBS (A549, SW837) and RPMI+FBS (MCF7) were used. The initial number of cells seeded in the 96-well plates was ~ 5 × 10 ⁴ cells/well. This amount of cells was plated 24 h prior to the RE-NPs treatment of cells in order to allow enough time for the cells to attach properly to the plate (wells) and to attain the optimum growing conditions. Subsequently, the viability test was performed 24 h after RE-NPs addition, or 48 h after the initial cell cultures were placed in the wells. As we did not observe any cell reduction, but on the contrary cell-overgrowth, especially with the SW620 cell line at 5 mM, the cell confluence quickly reached 80–90% of its initial value after 24 h of the addition of RE-NPs or 48 h from the initial plating.

Five microliters of WST solution was added to each well and the plate was incubated for 1 h during the growth state. The absorbance at 450 nm of each well was measured using a microplate reader (Biorad, x Mark). Each experimental point for each cell line and each RE suspension was extracted from two samples and triplicated every 2 days (total of 108 samples).

F test was used for every set of cell viability measurements. Here, the “null hypothesis” was that the relative to the CTRL “mean viability value was the same at different concentrations within the same cell line”. With this null hypothesis, an unknown law connecting tumour cell viability and RE-NPs concentration was identified. Le p value (probability the null hypothesis to be rejected) was also tested from the F distribution Additional file 1.

Western Blotting and Antibodies

Total proteins were extracted with 60 μL of radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5); 150 mM NaCl, 1 mM Na₂ EDTA; 1 mM EGTA; 1% NP-40; 1% sodium deoxycholate; 2.5 mM sodium pyrophosphate; supplemented with proteases inhibitors 1 mM β-glycerophosphate; 1 mM Na₃ VO₄ 1 μg/ml; leupeptin) and the Wb assay was performed according to standard protocols (Fig. 9b). Briefly, total proteins (50 μg) were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose membrane. Blots were incubated overnight at 4 °C with appropriate primary antibodies. The antibodies used were tubulin code sc-8035, from Santa Cruz (final concentration 1:1000 in blocking buffer); p-ERK (E-4) code sc-7383, from Santa Cruz (final concentration 1:500 in blocking buffer); and p-AKT (Thr308) code 9275S, from Cell Signaling (final concentration 1:1000 in blocking buffer).

Wb bands are collected from different blots showing quality control of antibodies specificity. Numbers at the top of the phosphorylation images show grey scale levels from 0 (black) to 168 (grey) (maximum value ), indicating activation at a non-saturated mode.

Abréviations

2D-FFT:

Two-dimensional fast Fourier transform

ADMIDAS:

Adjacent MIDAS

AFM :

Microscopie à force atomique

AKT:

Protein kinase B

CTRL:

Control cells

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

ECM :

Cell-extracellular matrix

EGFR:

Epidermal growth factor receptors

ERK:

Extracellular signal-regulated kinase

F.A.:

Feret angle

F.D.:

Feret area diameters

FBS:

Fetal bovine serum

LABS:

Ligand adhesion binding site

MEAC:

Mean equal area circle

MHR:

Mean hydrodynamic radius

MIDAS:

Metal ion-dependent adhesion sites

NGFR:

Nerve growth factor receptor

NP :

Nanoparticule

RE-NPs:

Rare-earth nanoparticles

RIPA:

Radioimmunoprecipitation assay

RMS:

Root mean square

RPMI:

Roswell Park Memorial Institute medium

SDS-PAGE:

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

SyMBS:

Synergistic metal ion binding sites

TEM :

Microscopie électronique à transmission

TSR:

Transmembrane signal receptors

VEGFR:

Vascular endothelial growth factor

VUV:

Vacuum ultraviolet

Wb:

Western blot assays

WST:

Water-soluble tetrazolium salts

XRD :

Diffraction des rayons X