L'effet de l'apoptose sur les cellules cancéreuses du foie de nanoparticules d'or modifiées avec de l'acide lithocholique

Contexte

Les nanoparticules d'or (AuNP) en tant que nanomatériaux ont été largement appliquées dans de nombreux domaines en raison de leurs propriétés optiques uniques, de leur bonne stabilité chimique et de leur biocompatibilité [1,2,3,4,5]. Ainsi, il a de larges perspectives d'application dans la nano-électronique, la nano-photonique, la catalyse, les capteurs, les biomarqueurs et de nombreux autres domaines [6,7,8]. Parce que les AuNPs ont une grande surface et une forme sphérique, elles peuvent être utilisées comme support pour les médicaments antinéoplasiques [9,10,11,12]. De plus, de nombreux complexes AuNP ont été principalement utilisés pour le nouveau type de médicaments antitumoraux afin de traiter le cancer [13, 14]. En tant que porteur de médicament antinéoplasique, le complexe AuNP peut contrôler la fonction cellulaire, réguler l'expression des gènes et détecter les analytes dans la cellule [15, 16]. Par conséquent, l'amélioration des AuNPs fonctionnalisés devient l'une des tendances importantes dans la recherche sur le traitement du cancer [17,18,19].

L'acide lithocholique (LCA) existe largement dans l'acide biliaire secondaire des vertébrés supérieurs dans la bile. La diversité des espèces d'acides biliaires a été rapportée dans l'application de différents types d'acides biliaires et de ses dérivés en médecine et dans d'autres domaines [20,21,22], tels qu'ils peuvent être utilisés dans le traitement de la carence en acides biliaires, des calculs biliaires et maladie du foie [23,24,25]. Et certains acides biliaires et ses dérivés peuvent, en tant que transporteurs de médicaments, cibler le traitement des maladies du foie, favoriser l'absorption et réduire le cholestérol. [26,27,28]. Des rapports antérieurs ont démontré que le LCA a un effet antitumoral très puissant dans les cellules cancéreuses du foie et que le mécanisme de mort cellulaire est l'apoptose [29, 30]. L'apoptose est un processus biologique de mort active des cellules, et c'est un mécanisme important par lequel le corps de l'organisme multicellulaire régule le développement du corps, contrôle le vieillissement cellulaire et maintient un environnement interne stable [31, 32]. En particulier, l'inhibition de la prolifération, la différenciation, la réduction du degré malin et la promotion de l'apoptose des cellules tumorales sont les objectifs du traitement tumoral [33,34,35,36,37].

Dans cette étude, nous avons synthétisé les AuNPs avec des propriétés de ciblage biologique en combinant des NPs d'or avec des dérivés de LCA. Nous avons étudié leur cytotoxicité en utilisant la méthode MTT avec des cellules HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, et MCF-7 pendant 48 h. Nos résultats de cytotoxicité ont révélé que AuNP@MPA-PEG-LCA pouvait inhiber la croissance de plusieurs cellules cancéreuses du foie plus efficacement que d'autres cellules cancéreuses et des cellules normales. L'apoptose joue un rôle dans l'inhibition de la prolifération cellulaire, ce qui a été confirmé par la coloration Hoechst 33342, la coloration à l'annexine V-FITC, l'analyse du potentiel de membrane mitochondriale (MMP) et les expériences de coloration AO/EB. Et le niveau de ROS a augmenté dans les cellules cancéreuses du foie, suggérant que AuNP@MPA-PEG-LCA peut induire l'apoptose via un dysfonctionnement mitochondrial induit par la génération de ROS.

Méthodes

Matériaux

Sauf indication contraire, les produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) et utilisés sans autre purification. Le milieu RPMI-1640 et le sérum bovin fœtal (FBS) provenaient d'Invitrogen Corporation. HepG2 (cellules hépatocellulaires humaines de carcinome hépatique), SMMC-7721 (cellules hépatocellulaires humaines de carcinome hépatique), QSG-7701 (cellules hépatocytaires humaines normales) et MCF-7 (cellules humaines de cancer du sein) ont été achetés auprès du Shanghai Institute for Biological Science ( Shanghai, Chine).

Synthèse de AuNP@MPA

Des nanoparticules d'or coiffées de citrate (AuNP@MPA) d'une taille moyenne de 4,0 nm ont été préparées selon la méthode mise au point par J. Turkevich et al. [38]. En bref, 773 μl de solution de citrate de sodium 38,8 mM et 2 mL de 15 mM de HAuCl₄ solution ont été dissous dans 30 mL de Milli-Q H₂ 0, et la solution a été agitée à 25°C. Ensuite, 3 mL de 0,1 M de NaBH₄ (fraîchement préparé) a été ajouté. Après 2 h de réaction à 25 °C, la solution passe de l'incolore à l'orange clair. Ensuite, 3 mL de 0,01 M d'acide 3-mercaptopropionique (MPA) dans de l'éthanol anhydre ont été ajoutés à pH 11 et maintenus en réaction pendant 2 h à 25 °C. Le mélange réactionnel a été centrifugé pour obtenir le composé AuNP@MPA.

Synthèse de AuNP@MPA-PEG

10,5 mg (0,0875 mmol) de 1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione (NHS) et 7 mg (0,035 mmol) de chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC) ont été ajoutés à une solution de 50 mM AuNP@MPA dans Acide 4-morpholineéthanesulfonique (MES) et la solution a été agitée pendant 30 minutes à 25°C. Ensuite, 0,045 mmol NH₂ -PEG1000-NH₂ a été ajouté et le mélange a été agité pendant 24 h à 25°C. Lorsque la réaction est terminée, le mélange a été centrifugé pour obtenir le composé AuNP@MPA-PEG.

Synthèse de AuNP@MPA-PEG-LCA

Le composé AuNP@MPA-PEG dans de l'eau ultrapure a été ajouté à 200 μL de solution de diméthylformamide (DMF) anhydre comprenant 17 mg (0,045 mmol) de LCA, et la solution réactionnelle a été agitée pendant 24 h à 25 °C. Lorsque la réaction est terminée, le mélange réactionnel a été centrifugé pour obtenir le composé AuNP@MPA-PEG-LCA.

Microscopie électronique à transmission (MET)

La morphologie et la taille des AuNPs ont été détectées sur un MET JEOL JEM-200CX, fonctionnant jusqu'à 200 kV. La solution AuNP a été déposée sur une grille en cuivre (300 mesh).

Tests de capacité antitumorale des AuNP

Nous avons utilisé quatre types de cellules (HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, et MCF-7) pour étudier la capacité antitumorale des AuNPs par un 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5 modifié -méthode au bromure de diphényltétrazolium (MTT). Les 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1,0 mg/mL d'AuNP et de nanoparticules d'or d'origine (AuNP@MPA) ont été utilisés dans l'essai. La DO570 de chaque puits a été mesurée sur un lecteur de plaques multimode Tecan Infinite M200.

Détermination de la morphologie par coloration Hoechst

Après 24 et 48 h avec AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL), les cellules HepG2 ont été colorées avec 10 μg/mL de Hoechst 33342 pendant 30 min dans un incubateur de cellules. La morphologie des noyaux cellulaires a été détectée par microscopie confocale Leica-SP8.

Apoptose de la prophase cellulaire :coloration à l'annexine V-FITC

Après 6 h avec AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL), les cellules HepG2 ont été colorées avec de l'annexine V-FITC pendant 10 min dans un incubateur de cellules, puis observées avec un microscope confocal Leica-SP8.

Pour la détection des AuNPs par cytomètre de flux, après 6 h de traitement avec AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL), les cellules HepG2 ont été colorées avec de l'annexine V-FITC pendant 10 min dans un incubateur de cellules et ont été détectées avec un cytomètre en flux FACSCalibur (Becton Dickinson &Co., Franklin Lakes, NJ).

Analyse du potentiel de la membrane mitochondriale (MMP)

Les cellules HepG2 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL) pendant 6 h à 37 °C ont été incubées avec 10 μg/mL JC-1 (5,5′,6,6′-tétrachloro-1,1 iodure d'′,3,3′-tétraéthylbenzimidazolylcarbo-cyanine ; sondes moléculaires) pendant 10 min à 37 °C. Les cellules ont ensuite été détectées avec un cytomètre en flux FACSCalibur.

Pour l'observation en microscopie à fluorescence, les cellules HepG2 ont été traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA pendant 10 min avec 10 μg/mL JC-1 et observées en utilisant la microscopie confocale Leica-SP8.

Mesure des espèces réactives de l'oxygène (ROS)

L'accumulation de ROS intracellulaires a été dosée à l'aide de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (H₂ DCF-DA). Le traitement des cellules HepG2 avec des échantillons AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL) pendant 6 h a été incubé avec 10 μM de H₂ DCF-DA pendant 30 min à 37 °C. Et l'intensité de fluorescence des cellules a été observée à l'aide d'un cytomètre en flux FACSCalibur et d'un microscope confocal.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation des AuNPs

Tout d'abord, AuNP@MPA soluble dans l'eau a été préparé (Schéma 1). La figure 1a illustre les résultats MET de l'AuNP@MPA. Il est indiqué que la forme et la taille de AuNP@MPA sont apparues comme une forme sphérique très similaire avec une taille compacte de 4,0 ± 0,5 nm. Le AuNP@MPA-PEG-LCA a ensuite été préparé (Schéma 1). Et la morphologie des particules a également été analysée par MET (Fig. 1c). Les images MET ont montré que la morphologie de AuNP@MPA-PEG-LCA est similaire à celle de AuNP@MPA. Et les diamètres de AuNP@MPA-PEG-LCA étaient d'environ  16 nm grâce à une analyse statistique.

Représentation schématique de la synthèse de l'AuNP@MPA-PEG-LCA

Images TEM de a AuNP@MPA, b AuNP@MPA-PEG, et c AuNP@MPA-PEG-LCA

Les résultats de la cytotoxicité

Afin d'étudier la cytotoxicité des AuNPs, des cellules HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, et MCF-7 ont été sélectionnées et traitées avec des AuNPs et AuNP@MPA pendant 48 h. Et le test MTT a été utilisé pour détecter la toxicité cellulaire des échantillons. Les viabilités cellulaires des AuNPs et AuNP@MPA sur différentes cellules sont illustrées à la Fig. 2. Les résultats suggèrent que la cytotoxicité de AuNP@MPA est très faible dans toutes les cellules. Cependant, l'AuNP@MPA-PEG-LCA pourrait inhiber plus efficacement la croissance de plusieurs cellules cancéreuses du foie avec une concentration croissante de nanoparticules, mais endommagerait moins les cellules normales et les autres cellules cancéreuses. À savoir, l'activité antiproliférative de l'AuNP@MPA-PEG-LCA sur les cellules HepG2 et SMMC-7721 était très élevée par rapport aux cellules QSG-7701 et MCF-7.

Viabilité cellulaire des cellules AuNP@MPA et AuNP@MPA-PEG-LCA (AuNPs) incubées avec des cellules HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, et MCF-7 pendant 48 h

Induction de l'apoptose

Les noyaux apoptotiques sont un indice commun de l'apoptose. Après traitement avec AuNP@MPA-PEG-LCA pendant les temps indiqués, les cellules ont été incubées avec Hoechst 33342. Ensuite, les caractéristiques morphologiques du noyau cellulaire ont été visualisées en microscopie confocale. Comme le montre la figure 3, les cellules témoins et les cellules incubées avec AuNP@MPA présentent une coloration du noyau cellulaire intacte et homogène ; cependant, le nombre de cellules apoptotiques dans les cellules HepG2 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA augmente progressivement avec l'augmentation du temps d'incubation et le noyau cellulaire présente des caractéristiques d'apoptose typiques, telles que des noyaux fragmentés, de la chromatine condensée et une réduction du volume cellulaire.

Caractéristiques morphologiques du noyau cellulaire des cellules HepG2 colorées avec Hoechst 33342. Les cellules HepG2 ont été incubées avec AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml) pendant a 0 h, b 24 h, et c 48 h et j AuNP@MPA (0,5 mg/ml) incubé pendant 48 h. Les cellules apoptotiques présentaient des noyaux condensés et fragmentés et un rétrécissement du volume cellulaire ; barre d'échelle 20 μm

Comme nous le savons tous, la coloration à l'annexine V peut distinguer les premiers stades de l'apoptose des cellules nécrotiques. Au stade précoce de l'apoptose, l'annexine V pourrait se lier à la membrane phospholipidique phosphatidylsérine (PS), qui est extériorisée de la surface interne à la surface externe de la membrane plasmique [39]. Par conséquent, nous avons étudié le potentiel d'induire l'apoptose de AuNP@MPA-PEG-LCA par des tests de coloration à l'annexine V-FITC. Comme le montre la figure 4a, il n'y a pas de fluorescence verte évidente dans la membrane cellulaire du contrôle, mais il y a une fluorescence verte évidente dans la membrane cellulaire des cellules HepG2 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA. Ce phénomène est un indicateur fort de l'apoptose à un stade précoce. Comme nous le savons tous, les images de microscopie confocale n'ont prouvé que l'apparition de l'apoptose; cependant, la cytométrie en flux pourrait mesurer rapidement et avec sensibilité l'apparition de l'apoptose et déterminer exactement le taux d'apoptose. Par conséquent, nous avons étudié plus avant les étapes de l'apoptose en utilisant la cytométrie en flux. La figure 4b montre les résultats du taux d'apoptose par cytométrie en flux. Le pourcentage d'apoptose était d'environ 38,45 % des cellules HepG2 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA, mais le pourcentage d'apoptose n'était que d'environ 8,16 % dans les cellules témoins. Le pourcentage significatif d'apoptose suggère que la cellule incubée avec AuNP@MPA-PEG-LCA a soutenu l'apoptose.

Les résultats de l'apoptose de a images confocales et b données de cytométrie en flux des cellules HepG2 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml). Les cellules ont été colorées avec de l'annexine V-FITC (excitation à 488 nm et émission à 500-560 nm); barre d'échelle 20 μm

La diminution du MMP

Les mitochondries jouent un rôle important dans l'apoptose car elles peuvent libérer des facteurs pro-apoptotiques, tels que le cytochrome C et le facteur inducteur d'apoptose [40,41,42]. Ainsi, nous avons exploré le changement de MMP en utilisant la microscopie confocale et la cytométrie en flux. La figure 5a montre les images de fluorescence des cellules HepG2 marquées JC-1 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA par microscopie confocale. Nous pouvons observer qu'il y a une fluorescence JC-1 rouge évidente et des mitochondries saines dans les cellules HepG2 témoins, indiquant la présence d'agrégation JC-1. Cependant, il y a plus de fluorescence verte dans les cellules HepG2 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA, indiquant que des effondrements de membrane se sont produits. La perturbation mitochondriale dans les cellules apoptotiques indique que le JC-1 ne s'accumule pas à l'intérieur des mitochondries mais se distribue dans toute la cellule. Et en tant que forme monomérique, le JC-1 dispersé qui existe devient vert fluorescent. Pour quantifier davantage le changement de MMP, nous avons évalué les cellules HepG2 colorées avec JC-1 par cytométrie en flux. Les signaux représentatifs du rapport rouge/vert JC-1 enregistrés dans les cellules HepG2 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA et les cellules témoins par cytométrie en flux sont illustrés à la Fig. 5b. Nous pouvons observer que le rapport rouge/vert a montré une diminution significative des cellules traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA à partir de l'analyse quantitative des cellules colorées JC-1 alors qu'il y avait une augmentation significative des cellules témoins, ce qui suggère que AuNP@ Le MPA-PEG-LCA peut induire l'apoptose dans les cellules HepG2.

un Images de fluorescence de cellules marquées JC-1 vues par microscopie confocale et b effets de AuNP@MPA-PEG-LCA sur les MMP analysés par cytométrie en flux

Effets de AuNP@MPA-PEG-LCA sur ROS

Comme nous le savons tous, l'apoptose peut être déclenchée avec des niveaux de ROS intracellulaires accrus, qui sont également une preuve solide impliquée dans l'induction de l'apoptose [43]. Pour explorer davantage si le dysfonctionnement mitochondrial était lié à la génération de ROS, nous avons déterminé le niveau de ROS dans les cellules HepG2 colorées avec H₂ DCF-DA en utilisant la microscopie confocale et la cytométrie en flux. Comme le montre la figure 6a, l'intensité de la fluorescence verte de H₂ DCF-DA montre une augmentation significative des cellules HepG2 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA par rapport aux cellules témoins. C'est-à-dire que la teneur en ROS dans les cellules HepG2 traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA a été significativement augmentée. Ensuite, l'analyse quantitative de la teneur en ROS dans les cellules a été étudiée par cytométrie en flux. Comme le montre la Fig. 6b, l'intensité de fluorescence plus élevée a été détectée dans les cellules incubées avec AuNP@MPA-PEG-LCA par rapport aux cellules témoins, ce qui indique que la teneur en ROS est plus élevée dans les cellules traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA . Les données suggèrent que le dysfonctionnement mitochondrial était peut-être lié à la génération de ROS. Ces résultats indiquent à titre préliminaire que la génération de ROS a un rôle important dans AuNP@MPA-PEG-LCA induisant l'apoptose.

L'analyse de la production de ROS après que les cellules HepG2 ont été traitées avec AuNP@MPA-PEG-LCA pendant 6 h. Le contenu des ROS dans les cellules HepG2 a été étudié par a microscopie confocale (excitation à 488 nm et émission à 530 nm) et b cytométrie en flux (excitation à 488 nm et émission à 525 nm)

Conclusions

En résumé, nous avons synthétisé l'AuNP@MPA-PEG-LCA avec un diamètre moyen de 16,0 nm qui peut inhiber la croissance de plusieurs cellules cancéreuses du foie. L'AuNP@MPA-PEG-LCA a inhibé efficacement la prolifération des cellules due à l'apoptose, ce qui a été prouvé par des expériences de coloration nucléaire, de coloration JC-1, d'analyse MMP et de coloration à l'annexine V-FITC. Dans l'étude de cytométrie en flux, l'arrêt AuNP@MPA-PEG-LCA dans les cellules cancéreuses du foie prouve en outre leur comportement d'apoptose. Par conséquent, les AuNP peuvent induire efficacement l'apoptose via un dysfonctionnement mitochondrial induit par les ROS et elles sont plus efficaces pour favoriser la mort cellulaire programmée dans les cellules cancéreuses du foie dans une étude mécaniste préliminaire.

Abréviations

AuNP :

Nanoparticules d'or

DMF :

Diméthylformamide

EDC :

Chlorhydrate de 1-(3-Diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide

FBS :

Sérum fœtal bovin

H₂ DCF-DA :

Diacétate de 2′,7′-Dichlorofluorescéine

HepG2 :

Cellules de carcinome hépatocellulaire humain

JC-1 :

Iodure de 5,5′,6,6′-tétrachloro-1,1′,3,3′-tétraéthylbenzimidazolylcarbo-cyanine

ACV :

Acide lithocholique

MCF-7 :

Cellules humaines de cancer du sein

MES :

Acide 4-morpholineéthanesulfonique

MMP :

Potentiel de membrane mitochondriale

AMP :

Acide 3-mercaptopropionique

MTT :

Bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényltétrazolium

NHS :

1-Hydroxypyrrolidine-2,5-dione

PEG :

Polyéthylène glycol

PS :

Phosphatidylsérine

QSG-7701 :

Cellules d'hépatocytes humains normaux

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SMMC-7721 :

Cellules de carcinome hépatocellulaire humain

TEM :

Microscopie électronique à transmission