Nanoparticules d'or fonctionnalisées à l'acide lithocholique induisant une apoptose sélective dans les cellules de cancer du foie

Résumé

Les nanoparticules d'or (AuNPs) sont réputées pour leur biocompatibilité, leurs propriétés optiques et leur potentiel d'administration de médicaments. Dans cette étude, nous avons conçu des AuNPs avec un espaceur en polyéthylène glycol (PEG) et un ligand d'acide lithocholique (LCA) par couplage carboxylate, produisant des AuNP@MPA-PEG-LCA. Les essais de cytotoxicité ont révélé que les AuNP@MPA-PEG-LCA présentaient une sélectivité marquée, inhibant fortement plusieurs lignées de carcinome hépatocellulaire (HepG2, SMMC-7721) tout en épargnant les hépatocytes normaux (QSG-7701) et les cellules de cancer du sein (MCF-7). L'induction de l'apoptose a été confirmée par la condensation nucléaire (Hoechst 33342), la fixation d'annexine V-FITC, la perte du potentiel de membrane mitochondriale (MMP) (JC-1) et la coloration acridine orange/bromure d'éthidium (AO/EB). Les nanoparticules ont déclenché une accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), entraînant une dysfonction mitochondriale et une mort cellulaire programmée. Ces résultats démontrent que les AuNP@MPA-PEG-LCA constituent un nanothérapeutique ciblé prometteur pour le cancer du foie.

Contexte

Les nanoparticules d'or possèdent une résonance optique unique, une stabilité chimique et une grande surface spécifique qui les rendent attractives pour les applications biomédicales, notamment l'administration de médicaments, l'imagerie et la thérapie photothermique ^[1-5]. Leur géométrie sphérique facilite l'absorption cellulaire efficace et minimise les effets hors cible ^[6-8]. La fonctionnalisation des AuNPs avec des ligands ciblant ou des polymères améliore davantage leur indice thérapeutique, particulièrement en oncologie ^[9-14].

L'acide lithocholique (LCA), un acide biliaire secondaire, exerce une activité antitumorale puissante contre le cancer du foie via l'apoptose ^[29-30]. En tant que molécule naturelle, le LCA peut servir de ligand pour guider les AuNPs vers les tissus hépatiques, améliorer la solubilité et potentiellement moduler les voies de signalisation intracellulaires ^[20-28].

La combinaison de la biocompatibilité des AuNPs avec les propriétés suppressives de tumeur du LCA pourrait produire un agent anticancéreux sélectif exploitant les voies mitochondriales médiatisées par les ROS pour déclencher l'apoptose dans les cellules de carcinome hépatocellulaire.

Méthodes

Matériaux

Tous les réactifs ont été achetés chez Sigma-Aldrich sauf indication contraire. Les réactifs de culture cellulaire (RPMI-1640, FBS) provenaient d'Invitrogen. Les lignées de carcinome hépatocellulaire humain (HepG2, SMMC-7721), les hépatocytes normaux (QSG-7701) et les cellules de cancer du sein (MCF-7) ont été obtenues de l'Institut des sciences biologiques de Shanghai.

Synthèse des AuNP@MPA

Des AuNPs coiffées au citrate (diamètre moyen 4,0 ± 0,5 nm) ont été synthétisées par la méthode de Turkevich ^[38] utilisant HAuCl₄ et NaBH₄. Les nanoparticules résultantes ont ensuite été coiffées avec de l'acide 3-mercaptopropionique (MPA) à pH 11 pour fournir des groupes carboxylate pour la conjugaison ultérieure.

Conjugaison avec le PEG

Les AuNP@MPA (0,0875 mmol) ont été activées avec NHS (0,0875 mmol) et EDC (0,035 mmol) dans un tampon MES 50 mM, suivi de l'ajout de NH₂-PEG₁₀₀₀-NH₂ (0,045 mmol). Après 24 h à 25 °C, les nanoparticules PEGylées (AuNP@MPA-PEG) ont été isolées par centrifugation.

Fixation de l'acide lithocholique

Les AuNP@MPA-PEG ont été mélangées avec du LCA (0,045 mmol) dans du DMF anhydre et agitées pendant 24 h à 25 °C. Le produit final, AuNP@MPA-PEG-LCA, a été purifié par centrifugations répétées.

Microscopie électronique à transmission (MET)

La morphologie et la taille des particules ont été examinées sur un MET JEOL JEM-200CX fonctionnant à 200 kV. Les suspensions de nanoparticules ont été déposées sur des grilles de cuivre à 300 mailles.

Essais de cytotoxicité

La viabilité cellulaire après 48 h d'exposition aux AuNPs (0,2-1,0 mg mL⁻¹) a été mesurée par le test MTT. L'absorbance à 570 nm a été enregistrée sur un lecteur de plaques Tecan Infinite M200.

Morphologie apoptotique (Hoechst 33342)

Les cellules HepG2 ont été traitées avec 0,5 mg mL⁻¹ d'AuNP@MPA-PEG-LCA pendant 24 et 48 h, puis colorées avec 10 µg mL⁻¹ de Hoechst 33342 pendant 30 min. La morphologie nucléaire a été imagée au microscope confocal Leica-SP8.

Apoptose précoce (Annexine V-FITC)

Après 6 h de traitement avec 0,5 mg mL⁻¹ d'AuNP@MPA-PEG-LCA, les cellules HepG2 ont été colorées avec l'annexine V-FITC et analysées par cytométrie de flux (FACSCalibur, BD). Des images confocales ont également été acquises.

Potentiel de membrane mitochondriale (MMP)

Le colorant JC-1 (10 µg mL⁻¹) a été utilisé pour évaluer les changements de MMP dans les cellules HepG2 traitées avec les AuNP@MPA-PEG-LCA (6 h). La cytométrie de flux et la microscopie confocale ont été employées.

Espèces réactives de l'oxygène (ROS)

Les ROS intracellulaires ont été quantifiés par H₂DCF-DA (10 µM) après 6 h d'exposition à 0,5 mg mL⁻¹ d'AuNP@MPA-PEG-LCA. La fluorescence a été mesurée par cytométrie de flux et microscopie confocale.

Résultats et discussion

Caractérisation des nanoparticules

Les AuNP@MPA-PEG-LCA ont conservé une forme sphérique avec un diamètre moyen de 16,0 ± 1,2 nm, confirmé par MET (Figure 1c). Les couches de PEG et de LCA ont contribué à l'augmentation de la taille hydrodynamique par rapport au cœur AuNP@MPA (4,0 nm). Ces dimensions sont idéales pour l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR) dans les tissus tumoraux.

Cytotoxicité sélective

Les tests MTT (Figure 2) ont montré une cytotoxicité négligeable des AuNP@MPA sur toutes les lignées cellulaires. En revanche, les AuNP@MPA-PEG-LCA ont réduit la viabilité des cellules HepG2 et SMMC-7721 de manière dose-dépendante, avec des valeurs IC₅₀ inférieures à 0,6 mg mL⁻¹, tandis que les cellules QSG-7701 et MCF-7 étaient faiblement affectées. Ce profil sélectif souligne la capacité de ciblage conférée par le LCA.

Morphologie apoptotique

La coloration au Hoechst (Figure 3) a révélé une condensation nucléaire progressive, une fragmentation et une marginalisation de la chromatine dans les cellules HepG2 traitées avec les AuNP@MPA-PEG-LCA sur 48 h, indiquant une apoptose tardive. Les cellules témoins et celles traitées avec les AuNP@MPA ont conservé une morphologie nucléaire uniforme.

Confirmation par Annexine V-FITC

La coloration à l'annexine V (Figure 4) a démontré une translocation claire de la phosphatidylsérine vers le feuillet externe de la membrane plasmique dans les cellules traitées avec les AuNP@MPA-PEG-LCA. La cytométrie de flux a quantifié un taux d'apoptose de 38,45 % versus 8,16 % chez les témoins, confirmant l'induction d'une apoptose précoce.

Dépolarisation mitochondriale

L'analyse JC-1 (Figure 5) a révélé une perte de fluorescence rouge des agrégats et une augmentation du signal vert des monomères, indiquant un effondrement du MMP dans les cellules traitées. La cytométrie de flux a confirmé une réduction significative du rapport rouge/vert, corroborant la dysfonction mitochondriale comme événement en aval de l'apoptose.

Génération de ROS

La coloration H₂DCF-DA (Figure 6) a montré une augmentation marquée de la fluorescence verte dans les cellules HepG2 traitées avec les AuNP@MPA-PEG-LCA, reflétant une production accrue de ROS. La quantification cytométrique a confirmé cette tendance, suggérant que le stress oxydatif précède la dépolarisation mitochondriale et l'apoptose.

Conclusions

Nous avons fabriqué avec succès des nanoparticules AuNP@MPA-PEG-LCA (~16 nm) qui inhibent sélectivement la croissance des cellules de carcinome hépatocellulaire en déclenchant l'apoptose. Des essais complets — morphologie nucléaire, fixation d'annexine V, perte de MMP JC-1 et élévation des ROS — confirment que l'action thérapeutique est médiatisée par une dysfonction mitochondriale induite par les ROS. Ces résultats positionnent les AuNP@MPA-PEG-LCA comme un nanomédicament ciblé prometteur pour le traitement du cancer du foie.

Abréviations

AuNPs :

Nanoparticules d'or

DMF :

Diméthylformamide

EDC :

Chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide

FBS :

Sérum fœtal bovin

H₂DCF-DA :

Diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine

HepG2 :

Cellules de carcinome hépatocellulaire humain

JC-1 :

Iodure de 5,5',6,6'-tétrachloro-1,1',3,3'-tétraéthylbenzimidazolylcarbocyanine

LCA :

Acide lithocholique

MCF-7 :

Cellules de cancer du sein humain

MES :

Acide 4-morpholineéthanesulfonique

MMP :

Potentiel de membrane mitochondriale

MPA :

Acide 3-mercaptopropionique

MTT :

Bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényltétrazolium

NHS :

1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione

PEG :

Polyéthylène glycol

PS :

Phosphatidylsérine

QSG-7701 :

Cellules d'hépatocytes normaux humains

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SMMC-7721 :

Cellules de carcinome hépatocellulaire humain

MET :

Microscopie électronique à transmission