Vectorisation génique améliorée utilisant des nanoparticules d'or fonctionnalisées avec chitosane, chitosane N-acylé et oligosaccharide de chitosane

Résumé

Les nanoparticules d'or (AuNP) sont de plus en plus utilisées dans la recherche biomédicale en raison de leurs propriétés optiques uniques, haute densité et facilité de modification de surface. Ici, nous présentons une plateforme de vectorisation génique non-virale qui combine des AuNP avec trois polymères dérivés du chitosane : chitosane natif (CO), chitosane N-acylé (Acyl-CO) et oligosaccharide de chitosane (COS). Deux voies synthétiques ont été explorées : une réduction chimique conventionnelle avec borohydrure de sodium et une synthèse verte en une seule étape où le COS réduit et stabilise simultanément les AuNP. Les nanocomposites résultants ont été pleinement caractérisés par spectroscopie UV-Vis, potentiel zêta, FTIR et microscopie électronique à transmission (TEM). L'électrophorèse sur gel d'agarose a confirmé une complexation robuste d'ADN plasmidique (pADN), et l'efficacité de transfection dans les cellules HEK-293 a été évaluée via l'activité β-galactosidase et la fluorescence EGFP. Des taux de transfection de 27 %, 33 % et 60 % ont été atteints avec CO-AuNP, Acyl-CO-AuNP et COS-AuNP respectivement, démontrant que la formulation verte à base de COS offre une performance de vectorisation génique supérieure tout en évitant les agents réducteurs toxiques.

Contexte

La thérapie génique repose sur la délivrance de matériel génétique thérapeutique dans les cellules cibles. Alors que les vecteurs viraux fournissent des efficacités de transfection élevées, ils souffrent d'immunogénicité, capacité de charge limitée et complexité de production. Les vecteurs non-viraux, en contraste, sont plus sûrs, plus faciles à produire et plus stables lors du stockage. Le chitosane, un polysaccharide naturel dérivé de la chitine, a émergé comme vecteur non-viral prometteur en raison de sa charge positive, faible toxicité et capacité à protéger l'ADN de la dégradation enzymatique. Cependant, le chitosane natif est peu soluble au pH physiologique et hautement visqueux en solutions acides diluées, limitant son application biomédicale. Les modifications chimiques telles que la N-acylation augmentent l'hydrophobicité et ajustent le degré de désacétylation, tandis que l'oligomérisation (COS) réduit la viscosité et améliore l'absorption cellulaire due aux chaînes plus courtes.

Les nanoparticules d'or, avec leur taille ajustable, résonance de plasmon de surface et forte affinité pour les groupes amine, thiol et cyanure, sont des candidats idéaux pour construire des nanovecteurs multifonctionnels. Les polymères cationiques comme le chitosane peuvent être greffés sur les AuNP pour créer des surfaces chargées positivement qui lient électrostatiquement l'ADN plasmidique, facilitant l'internalisation cellulaire. De plus, la haute densité des AuNP favorise une absorption cellulaire rapide, et leurs propriétés optiques permettent un suivi en temps réel de la délivrance.

Des études antérieures ont démontré que les conjugués chitosane-AuNP peuvent atteindre des efficacités de transfection supérieures aux liposomes ou nanoparticules polymériques. Pourtant, la plupart des synthèses reposent sur des agents réducteurs toxiques comme le borohydrure de sodium ou le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB). Dans ce travail, nous introduisons une voie de synthèse verte qui utilise le COS comme agent réducteur et stabilisant, éliminant les produits chimiques dangereux tout en préservant les propriétés physicochimiques favorables des nanocomplexes.

Méthodes

Synthèse des nanocomposites

Trois formulations distinctes d'AuNP ont été préparées (Figure 2). Les CO-AuNP et Acyl-CO-AuNP ont été synthétisées via réduction chimique avec NaBH₄, tandis que les COS-AuNP ont été produites par une méthode verte en une seule étape où le COS réduit simultanément Au³⁺ and cape les nanoparticules.

Matériaux

Chlorure d'or(III) trihydrate (HAuCl₄·3H₂O), borohydrure de sodium (NaBH₄), chitosane de faible poids moléculaire (50–190 kDa, 75 % désacétylation) et COS (5 kDa) ont été achetés chez Sigma-Aldrich. Toute la verrerie a été nettoyée avec l'eau régale pendant 24 h et rincée à l'eau Milli-Q pour éliminer les traces métalliques.

CO-AuNP

CO (2 mg mL⁻¹) a été dissous dans l'acide acétique 1 % et stocké overnight. La solution a été filtrée (0,22 µm) et mélangée avec 10 mM HAuCl₄ (1 mL) sous agitation vigoureuse pendant 30 min. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) a été ajouté goutte à goutte ; la couleur a changé de jaune à rouge vin, indiquant la formation de nanoparticules. L'agitation a continué pendant 2 h.

Acyl-CO-AuNP

L'acylation du chitosane de faible poids moléculaire a été réalisée avec le chlorure de caproyle suivant un protocole modifié. Le gel résultant a été précipité avec l'acétone, lavé au méthanol et séché. Le gel (0,33 % dans HCl 0,1 M) a été mélangé avec 10 mM HAuCl₄ (1 mL) et agité pendant 1 h. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) a alors été ajouté, produisant une solution rose-rouge qui est devenue pleinement colorée en 2 h d'agitation.

COS-AuNP

Pour la synthèse verte, COS (100–200 mg) a été ajouté à HAuCl₄ (0,003–0,017 % p/p) et agité à 80 °C pendant 60 min. Quatre variantes ont été préparées, différant par la quantité de COS et la concentration d'or (Tableau 1). Les nanoparticules ont été purifiées par centrifugation (12 000 g, 30 min).

Caractérisation

FTIR

Les spectres FTIR (Perkin Elmer Spectrum One) ont confirmé la présence de bandes amides et l'acylation réussie d'Acyl-CO. Le degré de substitution (DS) a été calculé à 75 % en utilisant le rapport des absorbances à 1651 cm⁻¹ et 3350 cm⁻¹.

Potentiel zêta

Les mesures de potentiel zêta (Malvern Nano Z) ont révélé des charges de surface positives (43–55 mV) pour tous les composites, confirmant leur adéquation pour la liaison d'ADN. Les valeurs post-complexation ont chuté, indiquant une adsorption réussie du plasmide.

UV-Vis

Les spectres UV-Vis (400–700 nm) ont affiché des pics de résonance de plasmon de surface localisée (LSPR) à 534 nm (CO-AuNP), 507 nm (Acyl-CO-AuNP) et 533–536 nm (COS-AuNP). Les spectres sont restés inchangés après 150 jours, prouvant la stabilité colloïdale.

TEM

Les images MET (JEOL JEM-1010) ont révélé des nanoparticules sphériques avec des diamètres allant de 3 à 15 nm. Les distributions de taille étaient plus étroites pour les COS-AuNP, reflétant une monodispersité supérieure.

Formation de complexe et liaison ADN

Les plasmides pSV-β-Gal (6,82 kb) et pIRES2-EGFP (5,3 kb) ont été purifiés par lyse alcaline. L'ADN (200–400 ng) a été mélangé avec chaque nanocomposite dans du DMEM, et l'électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 % agarose, 90 V, 60 min) a démontré une rétention complète de l'ADN dans les puits, confirmant la complexation électrostatique.

Transfection cellulaire

Culture cellulaire

Les cellules HEK-293 ont été ensemencées à 12 000 cellules par puits dans des plaques 96 puits, atteignant ~90 % de confluence après 24 h.

Transfection EGFP

Les complexes (15 µL, 200 ng ADN) ont été ajoutés aux cellules pendant 2 h, suivis de 48 h d'incubation dans du DMEM complet. L'expression GFP a été quantifiée par microscopie de fluorescence (Carl Zeiss Axio Vert.A1).

Transfection β-galactosidase

Après 24 h d'incubation, les cellules ont été fixées et incubées avec une solution X-gal. La coloration bleue, indiquant l'activité β-galactosidase, a été observée par microscopie en champ clair (Motic AE2000). LipofectAMINE™ 2000 a servi de contrôle positif.

Viabilité cellulaire

L'exclusion au bleu de trypan (0,2 %) a évalué la viabilité 2 h post-transfection. Les gammes de concentration étaient 0,1–3 mM pour CO-AuNP et Acyl-CO-AuNP, 0,5 mM pour COS@3-AuNP et COS@4-AuNP, et 0,1 mM pour COS@1-AuNP et COS@2-AuNP.

Résultats et discussions

Synthèse et caractérisation des nanocomposites

Les COS-AuNP verts ont été produits sans réactifs dangereux, démontrant la faisabilité d'une voie de synthèse pleinement biocompatible. Les spectres UV-Vis (Figure 3) ont confirmé la formation d'AuNP, avec des pics LSPR cohérents à travers toutes les formulations. Les tests de stabilité après 150 jours n'ont montré aucun décalage spectral, indiquant une robustesse colloïdale excellente.

Stabilité

Les spectres UV-Vis après 150 jours (Figure 4) pour CO-AuNP (a), Acyl-CO-AuNP (b), COS-AuNP (c) sont restés stables.

FTIR

Les spectres FT-IR (Figure 5) du chitosane, chitosane acylé et COS montrent les bandes clés : 1651 cm⁻¹ (amide I), 1591 cm⁻¹ (amide II).

Potentiel zêta

Le Tableau 2 liste les valeurs de potentiel zêta : CO-AuNP 43,3 mV, Acyl-CO-AuNP 40,2 mV, COS-AuNP 46,3–55,3 mV. Toutes les valeurs restaient positives après liaison ADN, confirmant la complexation.

TEM

Les micrographies MET (Figure 6) : (a) Acyl-CO-AuNP 4,7 nm, (b) CO-AuNP 3,5 nm, (c-f) COS-AuNP 7,4–15,6 nm.

Complexation ADN

Les gels d'agarose (Figure 7) ont montré une rétention complète de l'ADN dans tous les nanocomplexes, tandis que le plasmide libre migrait vers le bas. Les COS-AuNP affichaient la liaison la plus forte, retenant jusqu'à 350 ng de plasmide avant saturation.

Efficacité de transfection

Dans les cellules HEK-293, les COS-AuNP ont atteint les taux de transfection les plus élevés : 60 % avec β-galactosidase et 48 % avec EGFP. Les Acyl-CO-AuNP et CO-AuNP ont atteint 33 % et 27 % respectivement. La performance supérieure des COS-AuNP est attribuée à leur rapport chitosane/or plus élevé et leur taille de particule optimale.

Viabilité cellulaire

L'exclusion au bleu de trypan a révélé une viabilité élevée (>90 %) pour les COS-AuNP, tandis que LipofectAMINE™ 2000 et CO-AuNP montraient des taux de survie plus faibles (61 % et 78 %). Les COS-AuNP combinent donc haute efficacité de transfection et cytotoxicité minimale.

Conclusions

Nous avons fabriqué avec succès des conjugués nanoparticules d'or-chitosane via des voies conventionnelles et vertes. Les COS-AuNP, synthétisés sans réactifs toxiques, ont affiché une efficacité de transfection supérieure (jusqu'à 60 %) et une excellente cytocompatibilité (>93 %). Leur distribution de taille étroite et charge de surface positive permettent une liaison robuste du plasmide et une internalisation cellulaire efficace. Ces résultats positionnent les COS-AuNP comme une plateforme de vectorisation génique prometteuse, respectueuse de l'environnement, adaptée au développement préclinique ultérieur.

Disponibilité des données et matériaux

Tous les jeux de données soutenant les conclusions de cette étude sont inclus dans le texte principal.

Abréviations

Acyl-CO :

Chitosane acylé

AuNP :

Nanoparticules d'or

CO :

Chitosane

COS :

Oligosaccharide de chitosane

DMEM :

Milieu modifié de Dulbecco pour Eagle

FTIR :

Transformée de Fourier infrarouge

PBS :

Tampon phosphate salin

pADN :

Acide désoxyribonucléique plasmidique

TEM :

Microscopie électronique à transmission