Les nanoparticules de phosphore noir stimulent la différenciation ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses ectodermiques via la régulation positive de TG2

Différenciation ostéogénique

Les CSME ont été ensemencées à 3 000 cellules cm⁻² et induites avec un milieu ostéogénique (10 % FBS, 0,1 mM dexaméthasone, 0,2 mM acide ascorbique) pendant 14 jours (sans β‑glycérophosphate pour éviter les biais). La coloration par phosphatase alcaline (ALP) et Alizarin Red S (ARS) a évalué la différenciation précoce et tardive, respectivement. La RT‑qPCR a mesuré RUNX2, ALP, COL‑I, OCN, OPN, BMP‑2 aux jours 7 et 14.

Viabilité et prolifération cellulaires

Les tests CCK‑8 ont évalué la toxicité des BP (0–512 µg mL⁻¹) après 24 h. L'immunomarquage Ki‑67 a quantifié la prolifération. Les concentrations ≤32 µg mL⁻¹ étaient non cytotoxiques ; 2 et 4 µg mL⁻¹ ont été choisies pour les études fonctionnelles.

Études mécanistiques

Le Western blotting a quantifié TG2, fibronectine (FN), laminine (LN), OCN, OPN, COL‑I. L'anticorps neutralisant TG2 (10 µg mL⁻¹) a été appliqué pour confirmer l'implication de la voie. L'analyse statistique a utilisé le test t de Student et l'ANOVA (p < 0,05). Toutes les expériences ont été réalisées en triplicat.

Résultats

Caractérisation des BP

La DLS a montré une distribution de taille étroite (100–200 nm, pic 132 nm). Le potentiel zêta de −23,7 mV a confirmé la stabilité colloïdale. Les images MEB correspondaient aux données DLS. Les pics Raman à 362,3, 438,5, 466,9 cm⁻¹ ont confirmé la structure du BP ; le XRD a indiqué une taille de cristallite moyenne de 102,7 nm.

Phénotype des CSME

L'immunofluorescence de la muqueuse nasale a révélé des cellules nestine⁺ dans la lamina propria. Les CSME de passage 3 affichaient une morphologie fibroblastique et >95 % de positivité nestine/vimentine. Sous induction ostéogénique, la coloration ARS a montré des dépôts minéraux au jour 28 ; l'induction adipogénique a donné une coloration Oil Red O au jour 21.

Biocompatibilité

Les tests CCK‑8 ont indiqué aucune perte significative de viabilité jusqu'à 32 µg mL⁻¹. Le marquage Ki‑67 a confirmé une prolifération inchangée à 2 et 4 µg mL⁻¹.

Amélioration ostéogénique par les BP

La coloration ARS a révélé des nodules de calcium plus grands et plus réguliers dans les groupes 2 et 4 µg mL⁻¹ par rapport au témoin (p < 0,05). L'activité ALP a augmenté au jour 7 dans les cellules traitées par BP (p > 0,05 entre 2 vs 4 µg mL⁻¹). La RT‑qPCR a montré une régulation positive significative de RUNX2, ALP, COL‑I, OCN, OPN, BMP‑2 au jour 14 dans les groupes BP (p < 0,01).

Mécanisme dépendant de TG2

Le Western blotting a démontré une augmentation ~2 fois de la TG2 intracellulaire et extracellulaire dans les cellules traitées par BP. Les niveaux de FN et LN étaient également élevés. La neutralisation de TG2 a aboli le dépôt ARS induit par BP, l'activité ALP et l'expression d'OCN, OPN, COL‑I. Ces données confirment que les BP favorisent l'ostéogenèse par la régulation positive de TG2 et le remodelage de la MEC.

Discussion

Notre étude démontre que les BP sont incorporées en toute sécurité dans le milieu ostéogénique des CSME à des concentrations inférieures à 32 µg mL⁻¹. Les nanoparticules fournissent une source rapide de phosphate, facilitant la minéralisation, tout en activant simultanément TG2 — une enzyme multifonctionnelle qui réticule les protéines de la MEC et module la signalisation intégrine. L'enrichissement résultant de la MEC (FN, LN, COL‑I) améliore probablement les interactions cellule-matrice, stimulant davantage l'engagement ostéogénique. Ces résultats s'alignent avec des rapports antérieurs selon lesquels les nanomatériaux de BP accélèrent la réparation osseuse en fournissant des ions phosphate et en stimulant l'activité des ostéoblastes.

Bien que la sensibilité du BP à l'oxydation puisse limiter la stabilité, sa biodégradation rapide en phosphate inoffensif réduit les risques d'accumulation à long terme. Néanmoins, des études in vivo sont nécessaires pour confirmer la sécurité et l'efficacité dans les modèles animaux et pour optimiser les conceptions d'échafaudages pour la traduction clinique.

Conclusion

Les nanoparticules de phosphore noir, produites via un processus de broyage-ultrasonication évolutif, améliorent en toute sécurité la différenciation ostéogénique des CSME médiate par TG2 in vitro. Ces résultats soutiennent leur incorporation dans les échafaudages d'ingénierie tissulaire osseuse. Les travaux précliniques futurs devraient aborder la pharmacocinétique, la biodistribution et les résultats thérapeutiques dans les modèles de défaut osseux.

Disponibilité des données et matériaux

Les ensembles de données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.