Le miR-133a exosomal des cellules souches de moelle osseuse atténue la fibrose et la transition épithélio-mésenchymateuse dans la myocardite virale via la suppression de MAML1

Résumé

La myocardite est une maladie caractérisée par une inflammation localisée ou diffuse du myocarde sans traitement efficace. Cette étude a exploré le mécanisme de régulation du microARN-133 (miR-133) sécrété par les exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse (BMSC-Exo) sur la fibrose myocardique et la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) dans la myocardite virale (VMC) chez le rat via la régulation de mastermind-like 1 (MAML1). Les BMSC de rat ont été isolées et cultivées pour identifier leur phénotype immunitaire et leurs capacités ostéogénique et adipogénique, et les BMSC-Exo ont été extraits et identifiés. Les exosomes ont été obtenus par ultracentrifugation, identifiés par microscope électronique à transmission et analyse western blot. Les rats ont été injectés avec le virus Coxsackie B3 pour préparer le modèle VMC, et les cardiomyocytes ont été isolés, cultivés et groupés de la même manière que les expériences animales (NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, Adas-miR-133a^Exo). Des expériences in vivo et in vitro ont été menées pour élucider les rôles du miR-133a exosomal et du MAML1 dans l'inflammation, l'apoptose, la TEM, la fibrose et la viabilité cellulaire. La relation de ciblage entre miR-133a et MAML1 a été vérifiée par essai de gène rapporteur à double luciférase. Les BMSC-Exo ont augmenté l'expression du miR-133a chez les rats VMC et ont efficacement amélioré la fonction cardiaque et la fibrose myocardique, augmenté la viabilité des cardiomyocytes et inhibé le processus de TEM. L'élévation du miR-133a dans les exosomes a renforcé les améliorations. Le silence du miR-133a a efficacement inversé les effets des BMSC-Exo sur les rats VMC. Le miR-133a cible le MAML1. L'inhibition du MAML1 a amélioré la fonction cardiaque et la fibrose myocardique chez les rats VMC et a pu inverser l'effet des exosomes à miR-133a silencié sur les rats VMC. Notre étude suggère que le miR-133a exosomal élevé supprime la fibrose myocardique et la TEM chez les rats VMC via la régulation négative du MAML1, inhibant ainsi la progression de la myocardite.

Introduction

La myocardite est considérée comme une maladie inflammatoire des cellules musculaires du cœur. La myocardite est évidemment plus fréquente chez les hommes qu chez les femmes. La myocardite virale (VMC) est un facteur principal menant à la cardiomyopathie dilatée (CMD) et à la mort subite chez les jeunes. La présentation clinique de la myocardite est variable, allant d'états asymptomatiques avec signes et symptômes ambigus à une destruction myocardique sévère par le virus et les cellules immunitaires souffrant de choc cardiogénique et d'arythmies. La myocardite peut être induite par une variété d'éléments infectieux, consistant en virus, bactéries, Chlamydia, rickettsies, champignons et protozoaires, ainsi que des inducteurs non infectieux. Parmi lesquels, l'infection virale a été la cause la plus commune, surtout chez les enfants. Le virus Coxsackie B3 (CVB3), comme le virus le plus crucial menant à la myocardite, peut résulter en réponse de stress oxydatif et apoptose dans la pathogenèse de la VMC, mais un traitement spécifique de la VMC n'a pas encore été rapporté. De plus, la pathogenèse de la VMC n'est pas bien documentée, et un traitement clinique exact fait aussi défaut. Par conséquent, de nouvelles cibles sont urgemment nécessaires pour améliorer le pronostic de la maladie.

Les microARN (miARN) sont des ARN non codants endogènes qui peuvent réguler l'expression des gènes codant pour des protéines. Le miR-133a, comme l'un des miARN spécifiques au cœur, est impliqué dans le développement cardiaque et certaines maladies cardiovasculaires, contenant l'infarctus du myocarde (IDM). De plus, le miR-133a est celui qui est exprimé de manière aberrante dans la cardiomyopathie de Chagas chronique. De plus, le niveau de miR-133a dans le myocarde est connecté avec l'inflammation, la fonction ventriculaire gauche et l'issue clinique dans la cardiomyopathie inflammatoire. Les miARN ont été trouvés dans les exosomes dérivés de cellules mastocytaires de souris et humaines. Les exosomes, vésicules nanosize libérées par la plupart types de cellules, sont trouvés dans différents fluides biologiques. Les exosomes peuvent transférer leur cargaison aux cellules réceptrices, ce qui a été montré pour changer la composition biochimique et les voies de signalisation des cellules réceptrices. Des preuves ont montré que les miARN exosomaux modifiés sont connectés avec la pathogenèse de la myocardite induite par CVB3. Il a été abordé que le miR-125b-5p exosomal de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse conditionnées par hypoxie réduit l'apoptose des cardiomyocytes et améliore la réparation cardiaque ischémique. De plus, le miR-25-3p exosomal des MSC atténue l'IDM par réduction de l'apoptose des cardiomyocytes et de la réponse inflammatoire. D'intérêt, le miR-133a cardiaque exosomal est connecté à la troponine cardiaque cardiaque troponine-I. Le mastermind-like 1 (MAML1) était un gène en aval criblé croisé du miR-133a dans notre étude qui a été rapporté pour impliquer dans la lésion ischémie/réperfusion (I/R) myocardique. Aussi, une étude récente a mentionné que l'invalidation de MAML1 possède une fonction anti-fibrotique dans la fibrose hépatique.

Illuminé par les études précédentes, on se demande si le miR-133a dérivé des exosomes de BMSC pourrait médier la myocardite. Par conséquent, cette étude a été démarrée avec l'hypothèse que le miR-133 transporté par les exosomes dérivés de BMSC (BMSC-Exo) améliore la fibrose myocardique et la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) chez les rats VMC via la régulation de MAML1.

Matériaux et méthodes

Approbation éthique

L'étude a été autorisée par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Quatrième Hôpital affilié de l'École de médecine de l'Université de Zhejiang. Les animaux ont été traités humainement.

Isolation des BMSC

Les animaux expérimentaux étaient des rats mâles Sprague-Dawley (SD) matures de grade spécifique sans pathogènes (SPF) (Centre des animaux expérimentaux de l'École de médecine de l'Université de Zhejiang, Zhejiang, Chine). Les rats ont été euthanasiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique et stérilisés avec 75 % d'alcool. Le fémur et le tibia ont été prélevés sur une table ultra-propre, les muscles et tissus conjonctifs ont été retirés, et la cavité médullaire a été rincée répétitivement avec du milieu Dulbecco modifié à faible glucose (DMEM). Le liquide a été centrifugé pour collecter les précipités qui ont été resuspendus et incubés pendant 24 h (le milieu était changé tous les 2-3 j). Quand elles atteignaient la phase logarithmique, les BMSC étaient détachées avec 0,25 % de trypsine (Gibco, Carlsbad, Californie, USA), centrifugées et resuspendues dans une solution de culture MSC (Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, Chine). La suspension était passagée à un rapport de 1:2. L'opération ci-dessus était répétée, et les BMSC de 4ème passage étaient utilisées pour les expériences subséquentes.

Identification des BMSC

Les antigènes de surface des BMSC de 4ème passage en croissance logarithmique ont été identifiés par cytométrie de flux. Les BMSC étaient détachées avec 0,25 % de trypsine (1 mL) contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique, centrifugées, resuspendues avec du tampon phosphate salin (PBS) approprié et centrifugées à 151 g. Les BMSC étaient alors resuspendues avec du PBS contenant 2 % de sérum fœtal bovin (FBS) frais (Gibco) pour faire une suspension monocellulaire. Les anticorps monoclonaux FITC-CD34, PE-CD29 et PE-CD44 (5 µL chacun, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) étaient incubés avec la suspension cellulaire (100 µL), centrifugés à 151 g, resuspendus avec 500 µL de PBS contenant 1 % de paraformaldéhyde et fixés pendant 30 min. Les marqueurs de fond étaient identifiés via l'utilisation d'anticorps monoclonaux du contrôle d'homotype.

Cytométrie de flux : la suspension monocellulaire était fixée et centrifugée à 151 g. Ensuite les BMSC étaient resuspendues avec du PBS contenant 1 % de paraformaldéhyde, testées sur le cytomètre de flux MACS Quart et analysées par le logiciel correspondant.

Induction de l'ostéogenèse et l'adipogenèse des BMSC

Les BMSC de 4ème passage étaient ensemencées dans des plaques à 6 puits avec 200 cellules/mL. La solution d'induction ostéoblastique et la solution d'induction adipogénique (Cyagen Biosciences Inc.) étaient ajoutées aux BMSC de 60-70 % de confluence. Les BMSC dans deux autres puits n'étaient pas ajoutées avec les liquides d'induction comme contrôles. Les BMSC étaient induites pendant 14 jours et fixées avec 4 % de paraformaldéhyde. Ensuite les ostéoblastes et adipocytes différenciés étaient mis en œuvre avec la coloration au rouge alizarine et la coloration au rouge d'huile O (Wuhan Pulande Biological Technology Co., Ltd., Wuhan, Chine), et observées sous microscope.

Isolation et identification des exosomes

Les BMSC de 4ème passage étaient cultivées pendant 48 h pour récolter le surnageant qui était ensuite centrifugé (800 g et 2000 g), filtré avec des membranes de filtre 0,22 µm et 100 000 MW, et centrifugé (100 000 g) pour collecter les précipités. Ensuite, les précipités étaient resuspendus avec du PBS, centrifugés à 100 000 g à nouveau pour obtenir la précipitation d'exosomes. La suspension de BMSC-Exo dans le PBS était soumise à la détection de concentration par acide bicinchoninique (BCA) et à la détection de protéines marqueurs d'exosomes (CD63, CD81 et CD9) par analyse western blot (Proteintech, Chicago, IL, USA).

Infection par adénovirus recombinant médiant la modification du gène miR-133a des BMSC

Les BMSC étaient passagées pendant la nuit. Le contrôle normal (quantité égale de PBS), le contrôle négatif miR-133a (NC), la surexpression miR-133a (Ad-miR-133a), et la sous-expression miR-133a (Adas-miR-133a) (Hanbio Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Chine) étaient transféctées dans les BMSC selon une multiplicité d'infection (MOI) de 100. Les BMSC étaient cultivées, et les exosomes correspondants (NC^Exo, NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, et Adas-miR-133a^Exo) étaient obtenus par ultracentrifugation.

Établissement du modèle VMC chez le rat et groupement des animaux expérimentaux

Des rats SD mâles matures de grade SPF étaient divisés en 10 groupes, avec huit rats chacun. Le Coxsackievirus B3 (CVB3) était fourni par l'Institut de biotechnologie médicale, Académie chinoise des sciences médicales (Pékin, Chine).

CVB3 (10 mg/kg) était injecté intrapéritonéalement chez les rats tandis que PBS ou BMSC-Exo (100 µg) était injecté par la veine caudale. Les rats normaux pour contrôles étaient injectés avec la solution de culture CVB3 et PBS. Les rats injectés avec 10 mg/kg CVB3 étaient davantage injectés avec PBS, MSC^exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, Ad-miR-133a^Exo, si-NC, ou si-MAML1 (RIBOBIO, Guangzhou, Chine).

Les rats étaient continuellement injectés pendant 7 jours et le sang du globe oculaire était obtenu. Le sang était centrifugé et le sérum collecté, sous-conditionné, et stocké à -20 °C. Après euthanasie des rats, les spécimens cardiaques étaient prélevés, fixés avec 10 % de formaldéhyde, déshydratés avec de l'alcool gradient, clarifiés avec du xylène et inclus dans la paraffine, coupés pour observation histologique. Une partie des coupes étaient placées à -80 °C comme matériaux pour expériences de biologie moléculaire.

Échocardiographie

Au 7ème jour après injection du virus, les rats étaient injectés intrapéritonéalement avec 25 mg/kg de pentobarbital sodique. Après anesthésie complète, la dérivation membre de l'appareil ECG connectée avec l'aiguille d'électrode était insérée sous-cutanément aux extrémités des membres des rats, et l'ECG de dérivation membre était enregistré. Ensuite, les rats étaient fixés en position supine légèrement à gauche, le thorax était dépilé, et la dérivation II ECG était connectée pour obtenir le spectre Doppler du pouls du flux sanguin de l'aorte dans la section para-sternale à quatre cavités. Les indicateurs incluaient l'épaisseur de la paroi postérieure du ventricule gauche (LVPW), le diamètre télésystolique du ventricule gauche (LVIDs), la fraction de raccourcissement (FS) et la fraction d'éjection du ventricule gauche (LVEF).

Coloration hématoxyline-éosine (HE)

Les tissus étaient fixés avec 4 % de paraformaldéhyde, déshydratés, clarifiés, et inclus avec la paraffine. Ensuite les coupes de 4 µm étaient déparaffinées, colorées avec l'hématoxyline (Servicebio, Wuhan, Chine), différenciées avec 1 % d'alcool chlorhydrique, revenues au bleu, et colorées avec l'éosine, déshydratées, clarifiées avec du xylène, scellées avec du gomme neutre, et observées sous microscope optique (Olympus, Tokyo, Japon).

Coloration de collagène de Masson

Les coupes de paraffine étaient déparaffinées, colorées avec l'hématoxyline moins de 2 min, colorées avec la solution magenta Lichun, et rapidement rincées avec une solution d'acide acétique glaciaire à 0,5 %. Ensuite les coupes étaient colorées avec une solution aqueuse de phosphate d'aluminium à 1 %, colorées du rouge foncé au rouge vif au rose, et observées sous microscope. Ensuite les coupes étaient colorées avec le bleu d'aniline (Pulande), conventionnellement déshydratées avec du xylène et scellées. Le logiciel d'analyse d'image médicale Image-Proplus 6.0 était utilisé pour mesurer la zone de coloration positive des fibres collagéniques, et la fraction volumique de collagène (CVF) = zone collagénique/zone totale du champ. La localisation et la couleur des fibres collagéniques étaient distinguées (les cardiomyocytes étaient rouges, et les fibres collagéniques étaient des structures bleues bandées ou homogènes dans l'espace intercellulaire).

Coloration TUNEL

Les coupes de paraffine étaient déparaffinées, placées dans le tampon citrate et cuites à 350 W pendant 10 min. Les coupes étaient ajoutées avec 50 µL de solution TUNEL, jointes avec 50 µL d'agent de conversion-peroxydase, développées avec DAB, et observées sous microscope. Les coupes étaient mises dans l'hématoxyline, trempées avec 95 % d'éthanol I-II, jointes avec éthanol anhydre I-II, xylène I-II, et scellées. Les résultats étaient analysés sous microscope optique.

Dosage ELISA

Le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l'interleukine (IL)-1β et IL-6 étaient détectés par kits ELISA (BOSTER Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Chine). Le sang du globe oculaire était centrifugé à 604 g pour collecter le sérum supérieur. Le surnageant obtenu par centrifugation du milieu de culture cellulaire était détecté dans l'expérience cellulaire. Il y avait sept gradients de concentration dans la dilution standard des échantillons. Le puits blanc était joint avec le diluant d'échantillon, et un autre puits était ajouté avec le tétraméthylbenzidine (TMB), deux puits dupliqués étaient mis pour chaque concentration. Les puits d'échantillons étaient joints avec 50 µL de diluant d'échantillon et les échantillons à tour de rôle. Chaque puits réagissait avec 100 µL d'anticorps primaire (sauf puits TMB) pendant 1 h, ainsi qu'avec 300 µL de tampon tris salin (TBS) à 0,01 M et 100 µL de complexe de travail Avidine-Biotine-Peroxydase (sauf puits TMB). Ensuite chaque puits était ajouté avec 300 µL de TBS à 0,01 M et incubé avec 100 µL TMB. La densité optique (DO) et la concentration de chaque puits étaient mesurées immédiatement et la courbe standard était tracée.

RT-qPCR

L'expression de miR-133a, collagène I, collagène III, α-SMA, TGF-β1, CTGF, E-cadhérine, et FSP-1 dans les tissus myocardiques et cardiomyocytes était détectée via RT-qPCR. L'ARN total était extrait des cardiomyocytes ou tissus myocardiques et transcrit en sens inverse en cDNA via kit d'extraction d'ARN (Takara, Dalian, Chine), et les amorces RT-PCR étaient synthétisées via Invitrogen (Guangzhou, Chine), les séquences sont montrées dans le Tableau 1. L'expression quantitative relative des gènes était analysée en utilisant la glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ou U6 comme gènes de contrôle de charge selon la méthode 2^-ΔΔCt.

Analyse western blot

Les rats étaient euthanasiés avec anesthésie. Les tissus myocardiques étaient congelés et broyés dans l'azote liquide. Ensuite les inhibiteurs de protéase phénylméthanesulfonylfluorure solution stock était mélangée avec le tampon de lyse cellulaire à un rapport de 1:100 (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Chine). Les échantillons étaient lysés avec la solution mélangée et les protéines des cellules étaient extraites. La concentration totale de protéines était détectée avec le kit BCA. Les échantillons étaient mélangés avec le tampon de chargement 5× à 4:1, mis en œuvre avec un bain-marie bouillant pendant 10 min, mis sur glace, et centrifugés. La séparation électrophorétique était effectuée, et les protéines étaient transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (Servicebio) avec une solution de transfert électrique. Ensuite la membrane était bloquée avec 5 % de poudre de lait écrémé, et jointe avec les anticorps primaires CD63, CD81, et CD9 (anticorps polyclonaux rabbit anti-rat de Proteintech, 1:100), MAML1 (ab65090, Abcam, MA, USA, 1:1000), et GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA, 1:1000). Ensuite la membrane était gouttée avec l'anticorps secondaire, peroxydase-marquée IgG (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA, 1:1000), et immergée dans la solution de réaction de chimiluminescence amplifiée (Pierce, Rockford, IL, USA). Avec GAPDH comme contrôle de charge, les images d'empreinte protéique étaient analysées avec le logiciel ImageJ2x.

Culture et passage des cardiomyocytes

Des rats SD âgés de 3-5 jours (Centre des animaux expérimentaux de l'École de médecine de l'Université de Zhejiang, Zhejiang, Chine) étaient prélevés. La partie ventriculaire était rincée avec une solution saline équilibrée de Hank prérefroidie, coupée en petits morceaux, et détachée avec 0,25 % de trypsine. Les morceaux étaient ajoutés avec une quantité appropriée de milieu complet à 10 % pour terminer le détachement et centrifugés à 151 g. Le DMEM contenant 20 % de FBS était appliqué pour la resuspension cellulaire. Les cardiomyocytes étaient purifiés par la méthode d'adhérence différentielle, et le taux de survie était observé via coloration au bleu de trypan, les cardiomyocytes survivants étaient cultivés. Après 24 h, les cardiomyocytes adhérent à la paroi et commencent à pulser. Après 72 h, les pseudopodes s'étendaient.

Construction du modèle VMC de cardiomyocyte

Les cardiomyocytes de 4ème passage en phase de croissance logarithmique étaient sélectionnés et infectés avec MSC^Exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, et Ad-miR-133a^Exo. La solution de virus CVB3 à 100 Tcid50 (100 µL) était ajoutée dans les cellules pour induire un modèle VMC cellulaire. En même temps, une quantité égale de solution de maintenance était ajoutée aux cellules pour un contrôle, et les exosomes correspondants étaient joints aux cardiomyocytes après 1 h d'infection pour 47 h de culture.

Essai CCK-8

Le kit de détection cellulaire CCK-8 (Beyotime) était appliqué pour détecter le taux de survie des cardiomyocytes. Quand elles atteignaient la phase logarithmique, les cellules étaient détachées avec 0,25 % de trypsine, et ensemencées dans une plaque de culture cellulaire à 96 puits à 2,5 × 10⁴ cellules/puits. Jointes avec la solution CCK-8 (10 µL/puits), les cellules étaient continuellement cultivées pendant 1-4 h, et la valeur OD_{450 nm} était mesurée via un lecteur de microplaques.

Cytométrie de flux

La méthode de double coloration AnnexinV-APC/iodure de propidium (PI) était appliquée pour détecter l'apoptose cellulaire. Les cellules étaient centrifugées, resuspendues avec 250 µL de tampon de liaison (4 mL tampon de liaison + 12 mL eau déionisée), et ajustées à 1 × 10⁶ cellules/mL. La suspension cellulaire de 100 µL était ajoutée avec 5 µL Annexin V-APC (BD Biosciences) et 5 µL solution PI (BD Biosciences), chargée sur le cytomètre de flux, et analysée automatiquement par ordinateur.

Essai de gène rapporteur à double luciférase

La séquence sauvage (wt) ou mutante (mut) de la région 3'-non traduite (UTR) de MAML1 était clonée dans le vecteur pGL3-M (Promega, WI, USA), puis MAML1-3'-UTR-wt ou MAML1-3'-UTR-mut étaient générés. Les vecteurs, ensemble avec le mimétique miR-133a ou NC, étaient co-transféctés dans les cardiomyocytes via Lipofectamine 2000. L'activité luciférase était testée 48 h plus tard par le système de gène rapporteur à double luciférase (Promega).

Essai RIP

Le kit RIP (Millipore, USA) était utilisé pour détecter la liaison de MAML1 et miR-133a. Les cellules étaient lysées par tampon de radio-immunoprécipitation (P0013B, Beyotime, Shanghai, Chine), centrifugées à 1400 g et incubées avec les anticorps pour co-précipiter. Les billes magnétiques (50 µL) étaient resuspendues dans 100 µL de tampon de lavage RIP et incubées avec 5 µg d'anticorps anti-MAML1 (1 µg/mL, ab155786) ou IgG (1:100, ab172730). Le complexe bille magnétique-anticorps était resuspendu dans 900 µL de tampon de lavage RIP, interagissait avec 100 µL d'extrait cellulaire, digéré avec la protéinase K, et détecté par RT-qPCR.

Analyse statistique

Le logiciel statistique SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) était appliqué pour l'analyse des données. Les données de mesure étaient exprimées comme moyenne ± écart-type. Le test t était appliqué aux comparaisons entre deux groupes. L'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) était utilisée pour la comparaison entre groupes, et le test post-hoc de Tukey pour les comparaisons par paires. Les prédicteurs étaient conservés s'ils étaient significatifs à une valeur P de 0,05 ou plus petite.

Résultats

Identification des BMSC et BMSC-Exo

Microscopiquement, les BMSC étaient fusiformes et arrondies, et adhérentes à la paroi en motif vortex ou radial (Figure 1A). Après coloration au rouge d'huile O de l'induction adipogénique, les gouttelettes lipidiques des BMSC de 4ème passage étaient rouges, et il y avait des gouttelettes lipidiques rondes de tailles différentes (Figure 1B). Après induction de l'ostéogenèse, les cellules exprimant des nodules calcifiés montraient du rouge après coloration au rouge alizarine, et une distribution inégale des nodules calcifiés et des cellules chevauchantes (Figure 1C). La cytométrie de flux manifestait que les marqueurs MSC CD29 et CD44 (> 95 %) étaient exprimés, mais l'antigène de surface de cellule souche hématopoïétique CD34 (< 95 %) n'était pas exprimé (Figure 1D). Ces résultats manifestaient que les BMSC étaient de haute pureté et conformes aux normes MSC de la Société internationale de thérapie cellulaire.

Le microscope électronique à transmission observait que les BMSC-Exo étaient des vésicules ovales avec une structure membranaire périphérique claire, de tailles différentes, et un diamètre de 40-100 nm (Figure 1E). L'analyse western blot démontrait que les produits extraits exprimaient les protéines caractéristiques d'origine exosomale CD9, CD63, et CD81 (Figure 1F).

Le miR-133a exosomal élevé améliore les symptômes de la myocardite

La transfection des BMSC avec l'adénovirus recombinant miR-133a était observée (Figure 2A). Un grand nombre d'expressions de fluorescence verte de NC, Ad-miR-133a, et Adas-miR-133a étaient observées sous le microscope à fluorescence inversé, indiquant que le vecteur adénovirus recombinant pouvait transfecter efficacement les BMSC. Pour tester l'efficacité de transfection du miR-133a, l'expression du miR-133a dans les BMSC et leurs exosomes était mesurée par RT-qPCR. Il a été découvert que la régulation positive du miR-133a augmentait l'expression du miR-133a tandis que la régulation négative la diminuait (Figure 2B). Subséquemment, nous avons injecté des exosomes contenant le miR-133a chez les rats. Sous le microscope à fluorescence inversé, l'expression de fluorescence verte était observée chez les rats VMC après traitement de NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, ou Adas-miR-133a^Exo, indiquant que le vecteur adénovirus recombinant infectait les tissus myocardiques des rats (Figure 2C). L'expérience RT-qPCR a aussi trouvé que l'expression du miR-133a chez les rats VMC était apparemment diminuée ; l'expression du miR-133a était évidemment élevée chez les rats VMC injectés avec Ad-miR-133a^Exo mais diminuée chez les rats VMC injectés avec Adas-miR-133a^Exo (Figure 2D). Quant aux conditions générales des rats, il a été observé que les conditions générales des rats témoins normaux étaient normales, et les caractéristiques de VMC étaient apparemment exprimées chez les rats VMC et rats VMC injectés avec Adas-miR-133a^Exo, comme poil rude et désordonné, dyspnée, et peu d'appétit. Chez les rats VMC traités avec MSC^Exo, NC^Exo, et Ad-miR-133a^Exo, ces signes étaient améliorés à différents degrés. Le poids des rats VMC diminuait continuellement depuis 1 jour après infection, et l'injection de MSC^Exo, NC^Exo, ou Ad-miR-133a^Exo augmentait le poids des rats. Le poids des rats VMC traités avec Ad-miR-133a^Exo était augmenté évidemment et le poids des rats VMC injectés avec Adas-miR-133a^Exo était clairement diminué (Figure 2E).

L'observation de la fonction myocardique suggérait que (Figure 2F), les rats VMC avaient une LVPW et LVIDs augmentées, et FS et LVEF diminuées. Après injection d'exosomes, une LVPW et LVIDs déclinées, et FS et LVEF évidemment élevées montraient chez les rats VMC. Le traitement Adas-miR-133a^Exo altérait tandis qu'Ad-miR-133a^Exo améliorait la fonction myocardique chez les rats VMC.

Le miR-133a exosomal élevé inhibe l'inflammation dans les tissus myocardiques des rats VMC

La coloration HE manifestait que les fibres myocardiques chez les rats témoins normaux étaient étroitement arrangées et il n'y avait pas d'infiltration de cellules inflammatoires dans le mésenchyme. Les cardiomyocytes chez les rats VMC étaient désorganisés et le mésenchyme était infiltré par un grand nombre de cellules inflammatoires. Les cardiomyocytes chez les rats VMC injectés avec MSC^Exo ou NC^Exo étaient ordonnément arrangés, avec une petite quantité de cellules inflammatoires infiltrant dans le mésenchyme. Les cardiomyocytes chez les rats VMC après traitement Adas-miR-133a^Exo étaient désordonnément arrangés, et les cellules inflammatoires dans le mésenchyme étaient infiltrées. Les cardiomyocytes chez les rats VMC traités avec Ad-miR-133a^Exo étaient ordonnément arrangés sans infiltration évidente de cellules inflammatoires (Figure 3A).

L'ELISA indiquait que (Figure 3B, C) les facteurs inflammatoires (TNF-α, IL-1β, et IL-6) étaient évidemment augmentés chez les rats VMC. Les rats VMC injectés avec Ad-miR-133a^Exo avaient des niveaux réduits de facteurs inflammatoires. Le traitement Adas-miR-133a^Exo causait des facteurs inflammatoires élevés chez les rats VMC.

Le miR-133a exosomal élevé diminue la CVF dans les tissus myocardiques des rats VMC

La coloration de Masson divulguait que les fibres myocardiques chez les rats normaux étaient étroitement arrangées, avec presque pas de fibres collagéniques bleues. Après injection de CVB3, les cardiomyocytes étaient hypertrophiques, avec hyperplasie du tissu conjonctif et un grand nombre de fibres collagéniques bleues, et la CVF était évidemment élevée. Traitées avec les exosomes, les cardiomyocytes étaient ordonnément arrangées, l'hyperplasie du tissu conjonctif intercellulaire était diminuée, les fibres collagéniques bleues et la CVF étaient clairement diminuées. L'espace intercellulaire myocardique des rats VMC injectés avec Adas-miR-133a^Exo était élargi, les cellules étaient évidemment agrandies, les fibres collagéniques bleues et la CVF étaient clairement augmentées ; l'espace intercellulaire était diminué, la distribution des fibres collagéniques bleues et la CVF étaient diminuées chez les rats VMC avec traitement Ad-miR-133a^Exo (Figure 4A, B).

Le miR-133a exosomal élevé réduit l'expression de collagène I, collagène III, TGF-β1, et CTGF dans les tissus myocardiques des rats VMC

Le collagène I et le collagène III sont les composants principaux du collagène, principalement distribués dans les jonctions cellulaires et membranes cellulaires, substance intercellulaire, et cytoplasme. TGF-β1 et CTGF sont les protéines marqueurs de la fibrose. Les résultats de RT-qPCR démontraient que l'expression d'ARNm de collagène I, collagène III, TGF-β1, et CTGF étaient augmentées chez les rats VMC, mais diminuées après traitement par exosomes. Les rats VMC traités avec Ad-miR-133a^Exo avaient des niveaux d'expression d'ARNm diminués de collagène I, collagène III, TGF-β1, et CTGF tandis que les rats VMC après traitement Adas-miR-133a^Exo montraient la situation opposée (Figure 5A-C).

Le miR-133a exosomal élevé inhibe l'apoptose des cardiomyocytes dans les tissus myocardiques des rats VMC

La coloration TUNEL montrait que les cardiomyocytes apoptotiques étaient brun noir ou brun jaune avec condensation nucléaire. Le nombre de cellules apoptotiques était augmenté chez les rats VMC qui serait atténué par traitement par exosomes. Les rats VMC injectés avec Ad-miR-133a^Exo avaient un nombre réduit de cellules apoptotiques et ceux injectés avec Adas-miR-133a^Exo avaient un nombre accru de cellules apoptotiques (Figure 6A, B).

Le miR-133a exosomal élevé déprime la TEM dans les tissus myocardiques des rats VMC

L'E-cadhérine, α-SMA, et FSP-1 sont des indicateurs clés de la TEM. Les résultats de RT-qPCR démontraient que les niveaux d'expression d'ARNm de α-SMA et FSP-1 étaient élevés et le niveau d'expression d'ARNm d'E-cadhérine était diminué chez les rats VMC. En plus, les niveaux d'expression d'ARNm de α-SMA et FSP-1 étaient réduits et le niveau d'expression d'ARNm d'E-cadhérine était augmenté chez les rats VMC après traitement par exosomes. Les niveaux d'expression d'ARNm de α-SMA et FSP-1 étaient élevés et le niveau d'expression d'ARNm d'E-cadhérine était diminué chez les rats VMC traités avec Adas-miR-133a^Exo, tandis que l'expression de ces indicateurs était opposée chez les rats VMC injectés avec Ad-miR-133a^Exo (Figure 7A, B).

Le miR-133a exosomal élevé déprime l'inflammation des cardiomyocytes dans la VMC

En résultat, la microscopie à fluorescence capturait l'expression fluorescente verte chez les rats VMC traités avec NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, ou Adas-miR-133a^Exo, indiquant que le vecteur adénovirus recombinant infectait les cardiomyocytes des rats (Figure 8A). Le RT-qPCR et l'ELISA découvraient que (Figure 8B, D) l'expression du miR-133a était réduite et les facteurs inflammatoires (TNF-α, IL-1β, et IL-6) étaient augmentés chez les rats VMC, ce qui serait inversé par traitement par exosomes. Les rats VMC traités avec Ad-miR-133a^Exo avaient un miR-133a régulé positivement et des facteurs inflammatoires diminués chez les rats VMC, tandis que ceux traités avec Adas-miR-133a^Exo présentaient un miR-133a diminué et des niveaux augmentés de facteurs inflammatoires chez les rats VMC.

Le miR-133a exosomal élevé promeut la viabilité cellulaire, et réprime l'apoptose des cardiomyocytes dans la VMC

L'apoptose et la viabilité cellulaire étaient détectées via double coloration AnnexinV-APC/PI et essai CCK-8. Les résultats révèlent qu'il y avait une augmentation évidente du taux d'apoptose, une diminution de la viabilité cellulaire des cardiomyocytes chez les rats VMC. Le traitement par exosomes réduisait le taux d'apoptose et améliorait la viabilité des cardiomyocytes. Adas-miR-133a^Exo augmentait le taux d'apoptose et perturbait la viabilité des cardiomyocytes chez les rats VMC. Le traitement Ad-miR-133a^Exo fonctionnait les effets opposés sur les cardiomyocytes des rats VMC (Figure 9A-C).

Le miR-133a cible le MAML1

Il a été rapporté que le miR-193b régulé positivement réduit le dommage I/R myocardique en ciblant MAML1. Basé sur cela, nous avons criblé croisé les gènes en aval du miR-133a via les sites web bioinformatiques PITA, miRanda, PicTar, microT et miRmap, et sélectionné MAML1 comme cible du miR-133a (Figure 10A). Nous avons construit MAML1-wt ou MAML1-mut, et co-transfécté les cardiomyocytes avec le mimétique miR-133a ou NC. Les résultats montraient que le mimétique miR-133a réduisait l'activité luciférase de MAML1-wt (Figure 10B). L'expérience RIP a vérifié davantage la relation de ciblage entre miR-133a et MAML1 (Figure 10C). La détection RT-qPCR et western blot de l'expression de MAML1 montraient que l'expression de MAML1 était diminuée dans les cardiomyocytes transféctés avec le mimétique miR-133a (Figure 10D, E).

L'inhibition de MAML1 a un effet protecteur sur les rats avec myocardite et inverse l'effet des exosomes à miR-133a inhibé sur les rats VMC

Pour étudier davantage l'effet du MAML1 régulé par miR-133a sur les rats VMC, nous avons injecté l'adénovirus si-MAML1 ou si-NC dans les rats VMC ou les rats VMC qui avaient été traités avec des exosomes à miR-133a silencié. Le succès de l'injection était validé par RT-qPCR et western blot (Figure 11A, B). Les résultats manifestaient que l'injection de si-MAML1 augmentait le poids des rats VMC (Figure 11C), améliorait la fonction cardiaque (Figure 11D-G), atténuait la pathologie du tissu myocardique et la fibrose (Figure 12A-C), inhibait l'inflammation sérique (Figure 12D, E) et l'apoptose des cardiomyocytes (Figure 13A-G). Aussi, les effets délétères des exosomes à miR-133a silencié chez les rats VMC étaient inversés après injection de si-MAML1.

Discussion

La myocardite est une maladie cardiaque inflammatoire résultant en CMD et insuffisance cardiaque et est le plus fréquemment induite par des infections virales telles que CVB3. Une étude a révélé que le miR-133 soulage l'apoptose des cardiomyocytes et le remodelage électrique chez les souris VMC. De plus, les miARN exosomaux modifiés sont aussi trouvés liés avec la pathogenèse de la myocardite induite par CVB3. Les exosomes dérivés de cellules progénitrices cardiaques atténuent l'apoptose induite par CVB3 via la restriction de la prolifération de CVB3 dans la VMC. Cette étude a exploré le mécanisme de régulation du miR-133 dérivé de BMSC sur la fibrose myocardique et la TEM chez les rats VMC (Fichier additionnel 1: Figure 1).

L'étude a trouvé que l'expression du miR-133a était diminuée dans la VMC. Comme démontré avant, l'expression du miR-133a est diminuée dans l'IDM. Une étude a aussi suggéré que l'expression relative du miR-133 dans les cœurs de souris VMC est évidemment diminuée par contraste aux contrôles. Il y a quelques connexions des miARN avec les exosomes. L'expression différentielle des exosomes et des miARN exosomaux dans la maladie a été considérée comme biomarqueurs de maladie avec performance de diagnostic clinique non invasif ensemble avec leurs potentiels thérapeutiques. Lin et al. ont trouvé que le miR-133 est spécialement trié dans les exosomes dérivés de cellules progénitrices endothéliales humaines causées par hypoxie/réoxygénation (H/R) pour augmenter l'angiogenèse des fibroblastes et la TEM. Une autre étude a révélé que les MSC exhibent une communication avec les cellules parenchymateuses du cerveau et peuvent moduler la croissance des neurites par transfert de miR-133b aux cellules neurales via exosomes.

La découverte majeure de ce travail manifestait que le miR-133a exosomal régulé positivement promouvait la viabilité cellulaire, inhibait l'inflammation, l'apoptose, la TEM, et la fibrose chez les rats VMC. Elles s'accordent bien avec une recherche antérieure que le silence du miR-133a inverse l'inhibition de prolifération de cellules ostéosarcome MG63 induite par polysaccharides d'Astragalus, ensemble avec la promotion de l'apoptose cellulaire. Une autre étude a révélé que le miR-133a surexprimé supprime l'angiogenèse, l'apoptose, la fibrose, et l'inflammation, tout en accélérant le remodelage cardiaque thérapeutique dans les maladies myocardiques ischémiques. Similaire à notre étude, Li et al. ont énoncé que le miR-133 inhibe l'apoptose des cardiomyocytes en régulant l'expression des gènes liés à l'apoptose dans les cœurs de souris VMC. Le miR-133a surexprimé a été rapporté pour déprimer l'apoptose induite par hypoxie et renforcer la survie des cardiomyocytes. Pendant ce temps, le miR-30a et miR-181d exosomaux sériques régulés positivement peuvent avoir les potentiels d'être appliqués comme biomarqueurs pour le diagnostic de VMC.

Une autre découverte dans notre étude était que le miR-133a exosomal régulé positivement diminuait la CVF, réduisait l'expression de collagène I et collagène III chez les rats VMC. Un article a élucidé que le facteur de croissance fibroblastique-18 libéré d'une membrane de collagène cause l'activité ostéoblastique participant au miR-133a régulé négativement. L'expression excessive in vitro de miR-133a déprime l'hypertrophie des cardiomyocytes et réduit l'expression de collagène, comme en évidence dans une autre étude. La CVF égale le rapport de la zone de collagène à la somme de la zone myocardique et zone de collagène, et la valeur moyenne montre la CVF de la coupe. Cette découverte est aussi rapportée par Wang et al. que le modèle souris VMC est construit avec succès par infection CVB3, manifestant une expression CVF apparemment plus haute par contraste avec le groupe contrôle. De plus, la découverte est cohérente avec celle de Ferreira et al. qui démontre que le miR-133a peut prendre un rôle majeur dans la modulation de l'expression génique dans la pathogenèse de la cardiomyopathie de Chagas chronique, avec lien potentiel comme outils diagnostiques et pronostiques. En outre, des preuves ont montré que l'invalidation de MAML1 peut réduire l'hypertrophie des cardiomyocytes pré-traités. Dans notre étude, nous avons trouvé que MAML1 était le gène cible du miR-133a et l'inhibition de MAML1 inversait les effets des exosomes à miR-133a silencié sur les rats VMC. Dans la lésion ischémie-réperfusion myocardique, la régulation négative de MAML1 médiée par miR-193b pouvait en partie réduire l'infarctus et les enzymes myocardiques, ainsi qu'atténuer l'apoptose des cardiomyocytes. Aussi, il y a un rapport suggérant que la déficience de MAML1 pourrait soulager la fibrogénèse hépatique.

Conclusion

En conclusion, cette présente étude offre des preuves que le miR-133a est régulé négativement chez les rats VMC, et le miR-133a exosomal élevé améliore la fonction cardiaque et restreint la fibrose myocardique et la TEM chez les rats VMC, ainsi qu'améliore la viabilité et réprime l'apoptose des cardiomyocytes dans la VMC via le ciblage de MAML1. Notre étude suggère aussi que l'inhibition de MAML1 a un effet protecteur sur les rats avec myocardite et inverse l'effet des exosomes à miR-133a inhibé sur les rats VMC. L'identification du miR-133a exosomal dans la fibrose myocardique et la TEM de la myocardite peut potentiellement élargir notre compréhension des mécanismes sous-jacents à la myocardite et porter aussi une valeur clinique comme cible moléculaire novatrice. Plus de recherches devraient être entreprises pour faire des percées dans le traitement de cette maladie.