SOX2 module la voie CCAT1/miR‑185‑3p/FOXP3 pour contrôler la prolifération et l'autorenouvellement des cellules souches du cancer du col de l'utérus

Résumé

Il a été présenté le rôle des ARN non codants longs (lncARN) dans le cancer du col de l'utérus (CCU). Nous visons à discuter l'effet de la région déterminant le sexe boîte Y 2 (SOX2)/ARN long non codant transcript-1 associé au cancer du côlon (CCAT1)/microARN-185-3p (miR-185-3p)/protéine boite fourchue 3 (FOXP3) sur la prolifération et la capacité d'autorenouvellement des cellules souches du CCU. Les expressions de miR-185-3p, SOX2, CCAT1 et FOXP3 ont été testées dans les tissus et cellules de CCU. La relation entre l'expression de SOX2/CCAT1 et les caractéristiques clinicopathologiques chez les patientes CCU a été vérifiée. Des investigations de perte- et gain-de-fonction ont été menées dans les cellules CD44⁺HeLa pour discuter les fonctions biologiques et la capacité d'autorenouvellement. Finalement, les relations entre SOX2, CCAT1, FOXP3 et miR-185-3p ont été vérifiées. L'expression de miR-185-3p était diminuée, tandis que les expressions de SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient augmentées dans les tissus et cellules de CCU. Les expressions de SOX2 et CCAT1 étaient liées à la taille de la tumeur, la métastase ganglionnaire et le stade de la fédération internationale de gynécologie et d'obstétrique du CCU. La sous-régulation de SOX2 ou CCAT1 et la surexpression de miR-185-3p résultaient en l'inhibition de la prolifération, l'invasion, la migration et le nombre de sphères cellulaires ainsi que l'accélération de l'apoptose des cellules CD44⁺HeLa. SOX2 pouvait se lier à CCAT1 ce qui affectait l'expression de miR-185-3p, et FOXP3 était ciblé par miR-185-3p.

Introduction

Le cancer du col de l'utérus (CCU) est la quatrième cause majeure de mortalité chez les femmes avec environ 570 000 cas et 311 000 décès dans le monde en 2018 [1]. Cette maladie complexe est impliquée dans une variété de facteurs, incluant les effets génétiques et l'infection virale [2]. Avec le développement du co-test du papillomavirus humain et de la vaccination contre le papillomavirus humain, les procédures de diagnostic précoce de la dysplasie cervicale et du cancer résultent en une réduction de l'incidence, de la morbidité et de la mortalité du CCU [3]. Pour les patientes CCU précoces, la chirurgie est recommandée, telle que la chirurgie préservant la fertilité, la biopsie conique, la trachélectomie radicale, la dissection des ganglions lymphatiques pelviens, la radiothérapie pelvienne et la curiethérapie [4]. En raison de métastases ou récidives chez les patientes CCU avancées, le pronostic est encore pauvre [5]. Par conséquent, il est encore urgent d'identifier de nouveaux marqueurs pronostiques efficaces et des stratégies thérapeutiques pour améliorer le traitement du CCU.

La région déterminant le sexe boîte Y 2 (SOX2) est un membre critique de la famille des facteurs de transcription SOX et est principalement manifesté dans les cellules souches embryonnaires et adultes et aussi exprimé dans les cellules souches tumorales [6]. Il a été révélé que SOX2 module la radiorésistance dans le CCU par la voie de signalisation hedgehog [7]. Une autre étude a démontré que SOX2 est crucial pour maintenir la sous-population de cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires de CCU [8]. Les ARN non codants longs (lncARN) sont une classe de molécules d'ARN avec 200 nucléotides de longueur [9]. Le lncARN transcript-1 associé au cancer du côlon (CCAT1) est situé sur le chromosome humain 8q24.21 et considéré comme un « point chaud » qui résulte en mutations génétiques dans le cancer du côlon [10]. Une étude a rapporté que CCAT1 accélère la prolifération et l'invasion cellulaire du CCU [11]. Selon Jia et al., CCAT1 améliore dramatiquement la prolifération, la migration et l'invasion des cellules CCU [12]. De plus, une autre étude a révélé que CCAT1 améliore le degré malin de la maladie inflammatoire de l'intestin en ruinant la barrière intestinale en réduisant le microARN-185-3p (miR-185-3p) [13]. Le miARN peut inversement contrôler l'expression du gène en réduisant l'ARNm et en supprimant la traduction [14]. Des expériences in vitro dans une étude antérieure ont révélé que miR-185-3p module la radiorésistance du carcinome nasopharyngé [15]. Une autre étude a impliqué que miR-185 est participé à la résistance au cisplatine du cancer ovarien in vivo et in vitro [16]. La protéine boite fourchue 3 (FOXP3) est un facteur de transcription appartenant à la famille des protéines FOX, qui est d'abord trouvée dans les cellules T régulatrices (Treg) et joue un rôle vital dans le maintien et le processus des cellules Treg [17]. Une étude rapporte que FOXP3 est connectée à la lymphangiogenèse du CCU [18]. Une autre étude révèle que le niveau de FOXP3 est dramatiquement lié au stade de la fédération internationale de gynécologie et d'obstétrique (stade FIGO) et à la taille de la tumeur du CCU [19]. Dans cette étude, nous avons donc examiné les effets de l'axe SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 sur la prolifération et la capacité d'autorenouvellement des cellules souches du CCU.

Matériaux et Méthodes

Approbation éthique et consentement à participer

Les expériences impliquant des êtres humains ont été mises en œuvre conformément aux principes exprimés dans la Déclaration d'Helsinki. L'étude a été approuvée par le Comité de révision institutionnel du Premier Hôpital de l'Université de Jilin. Tous les participants ont signé un document de consentement éclairé.

Sujets d'étude

De décembre 2016 à décembre 2018, 39 cas de tissus CCU et tissus normaux adjacents correspondants ont été récoltés auprès de patientes CCU et préservés dans l'azote liquide. Les critères d'inclusion étaient les suivants : (1) Les patientes étaient confirmées comme CCU par pathologie de biopsies dans les canaux transcervicaux et cervicaux, cytologie de frottis cervical, test d'iode cervical, spéculum vaginal et résection vertébrale cervicale. (2) Les patientes n'ont pas reçu de radiothérapie et chimiothérapie 2 semaines avant l'opération. Les critères d'exclusion étaient les suivants : (1) patientes subissant toute radiothérapie ou chimiothérapie, (2) patientes en désaccord avec la collecte de l'échantillon et (3) patientes avec troubles du système immunitaire.

Sélection et culture cellulaire

Les lignées cellulaires CCU (SiHa, HeLa, CaSki, HCC94 et C33A) et la lignée cellulaire épithéliale cervicale humaine immortalisée H8 ont été achetées chez Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Les cellules CCU SiHa, HeLa et HCC94 ont été cultivées dans le milieu Dulbecco modifié à haute glucose (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), tandis que CaSki, C33A et cellules H8 dans le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 contenant 10 % FBS (37℃ et 5% CO₂). Les cellules étaient détachées et sous-cultivées tous les 2 jours.

Tri des cellules souches du CCU (cellules CD44⁺HeLa)

Les cellules souches du CCU ont été séparées de la lignée cellulaire CCU HeLa par culture en suspension cellulaire. Les cellules CCU HeLa ont été cultivées par le milieu modifié d'Iscove sans sérum (IMDM) dans une boîte de Petri à ultra-faible adhérence pendant 21 j avec le milieu semi-quantitativement échangé tous les 3-5 j. Certaines cellules étaient suspendues en sphères, et les cellules formant des sphères HeLa (SFC) étaient obtenues. La propriété des cellules sphériques était identifiée et analysée. Les cellules étaient détachées par trypsine et ajustées à 1 × 10⁶ cellules/mL. Les cellules étaient ajoutées avec anticorps CD44 et triées par cytométrie de flux. Les cellules HeLa avec CD44 positif étaient les cellules souches tumorales HeLa, tandis qu'avec CD44 négatif étaient les cellules non-souches HeLa. Les cellules souches du CCU étaient cultivées dans DMEM/F12 et appendues avec 20 ng/mL facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), 20 ng/mL facteur de croissance épidermique (EGF) et B27. Le milieu contenait 1 % de pénicilline et streptomycine [20].

Traitement cellulaire

Les cellules CD44⁺HeLa étaient transféctées avec sh-SOX2, sh-SOX2 contrôle négatif (NC), sh-CCAT1, sh-CCAT1 NC, mimic miR-185-3p, mimic NC, sh-CCAT1 et inhibiteur miR-185-3p ainsi que sh-CCAT1 et inhibiteur NC. Toutes les séquences d'oligonucléotides étaient fournies par GenePharma (Shanghai, Chine). Détachées par trypsine, les cellules étaient ensemencées dans une plaque à 6 puits avec 3 × 10⁶ cellules/puits. Lorsque atteignant 60 % de confluence, les cellules étaient changées en milieu sans sérum et incubées pendant 1 h. La transfection était facilitée par le réactif de transfection Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA).

Réaction de polymérase en chaîne par transcription inverse quantitative (RT-qPCR)

L'ARN dans les tissus et cellules était extrait par Trizol (Invitrogen). L'ARN (1 μg) était inversé en ADNc par le kit RTase virus leucémique murin moloney (Invitrogen). L'ADNc était ajouté au système PCR en temps réel. Les amorces étaient conçues par Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Chine) (Tableau 1). U6 était le contrôle de charge de miR-185-3p, tandis que la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) de SOX2, CCAT1 et FOXP3. Les résultats étaient analysés par la méthode 2^−ΔΔCt.

Essai Western Blot

La protéine totale dans les cellules et tissus était extraite. La concentration de protéine était déterminée par des kits d'acide bicinchoninique (AmyJet Scientific, Wuhan, Hubei, Chine). La protéine était mélangée avec le tampon de chargement et bouillie pendant 5 min, suivie par bain de glace et centrifugation. La protéine était traitée avec 10 % d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium et transférée sur une membrane. La membrane était bloquée avec 5 % de lait écrémé pendant 1 h, sondée avec les anticorps primaires SOX2 (1:1000, Jiangsu Rui sitan Co., Ltd., Jiangsu, Chine), FOXP3 (1:1000, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA), GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) et re-sondée avec l'anticorps secondaire marqué par peroxydase de raifort, couverte par film protecteur et exposée. L'imageur Bio-rad Gel Doc EZ (Bio-rad, Californie, USA) a été adopté pour le développement. Les images de protéines étaient analysées par le logiciel ImageJ2x.

Essai Cell Counting Kit (CCK)-8

L'essai CCK-8 a été mis en œuvre avec les kits (Beyotime, Shanghai, Chine). Les cellules (1 × 10⁴) étaient ensemencées dans une plaque à 96 puits et incubées. Cultivées pendant 0, 24, 48 et 72 h, les cellules étaient ajoutées avec 10 μL/puits solution CCK-8 et incubées pendant 1 h. La valeur de densité optique était déterminée avec le lecteur de microplaques Multiskan Spectrum à longueur d'onde complète à 450 nm. Six puits étaient pris pour compter la valeur moyenne. La courbe de croissance cellulaire était tracée avec le temps comme ordonnée et la viabilité cellulaire relative comme ordonnée. La valeur de densité optique représentait la prolifération cellulaire.

Cytométrie de flux

Les cellules (1 × 10⁶) étaient centrifugées à 1500 tr/min, suspendues avec 200 μL tampon de liaison, incubées avec 5 μL iodure de propidium (PI) et 5 μL annexine V-fluorescéine isothiocyanate (FITC) à tour de rôle et appendues avec 400 μL tampon. Le taux d'apoptose cellulaire était vérifié par un cytomètre de flux (BD Biosciences, NJ, USA).

Test de grattage

Les cellules transféctées étaient détachées et préparées en suspension cellulaire. Les suspensions cellulaires (1 × 10⁶ cellules/mL) étaient ensemencées dans une plaque à 6 puits et cultivées à 80-90 % de confluence. Des grattages transversaux et longitudinaux sur la plaque à 6 puits étaient faits uniformément par une pointe de pipette aseptique de 10 μL le long de la règle. Le milieu original était remplacé par le milieu complet, et les cellules étaient continuellement cultivées. La migration des cellules était observée sous un microscope à 0 h et 72 h et photographiée au même site.

Essai Transwell

Les cellules transféctées étaient trypsinisées, centrifugées à 1000 g et rincées avec DMEM. Une chambre Transwell entièrement hydratée était placée dans une plaque à 24 puits contenant 10 % FBS-DMEM (600 mL/puits). La suspension cellulaire (5 × 10⁵ cellules/mL, 200 μL) était ajoutée dans la chambre supérieure Transwell (enduite de 1:8 Matrigel 80 μL), tandis que 500 μL 20 % FBS-DMEM à la chambre inférieure. Les cellules étaient continuellement cultivées pendant 24 h, fixées avec 500 μL 4 % paraformaldéhyde (PFA) et colorées avec 0,1 % solution de coloration violet de cristal. Ensuite, les cellules sur la surface et le bord de la chambre supérieure étaient essuyées avec un coton-tige. Cinq champs étaient sélectionnés aléatoirement, et les cellules étaient comptées sous un microscope Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon, Japon).

Essai de formation de sphères

Les cellules étaient ensemencées dans une plaque à 6 puits à faible adsorption contenant un milieu de suspension sans sérum avec 200 cellules/puits. Après 2 s, le taux de formation de sphères des cellules était observé sous un microscope Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon), et le taux de formation de sphères était calculé comme nombre moyen de sphères/nombre de cellules ensemencées × 100 %.

Essai d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP)

L'essai ChIP a été opéré avec le kit ChIP (Upstate, NY, USA). SOX2 (1:1000, Re-stem Biotech, Jiangsu, Chine) et IgG lapin normal (12-370, Millipore, USA) anticorps étaient utilisés pour immunoprécipiter le complexe protéine-ADN croisé. Les cellules CD44⁺HeLa étaient fixées avec 1 % PFA et incubées pour produire le croisement ADN-protéine. Ensuite, l'ADN était coupé en fragments de chromatine de 200-300 pb par ultrasons. La chromatine d'ADN précipitée était récupérée et analysée par RT-qPCR.

Essai de tirage d'ARN

Les plasmides biotin-marqués miR-185-3p type sauvage (WT) et type mutant (MUT) (50 nM) étaient transféctés dans les cellules CD44⁺HeLa, respectivement. Les cellules étaient incubées avec un lysat cellulaire spécifique (Ambion, Austin, Texas, USA) après 48 h de transfection. Le lysat cellulaire (50 mL) était sous-conditionné. Le lysat résiduel était incubé avec des billes de streptavidine M-280 (Sigma, St. Louis, MO, USA) pré-enduites de RNase-free et d'ARNt levure (Sigma). Suivi par cela, les cellules étaient nettoyées deux fois avec lysat froid, trois fois avec tampon sel bas et une fois avec tampon sel haut. Une sonde miR-185-3p antagoniste était mise en place comme NC. L'ARN total était extrait par Trizol, et le niveau de CCAT1 était testé par RT-qPCR.

Essai de gène rapporteur luciférase double

Les sites de liaison potentiels E1 et E2 de SOX2 sur la région promotrice de CCAT1 étaient prédits par https://jaspar.genereg.net/. La séquence promotrice de CCAT1 contenant le site de liaison SOX2 et CCAT1 E1 était synthétisée, et les vecteurs CCAT1 3'UTR WT (E1-WT) et CCAT1 3'UTR MUT (E1-MUT) étaient formés. Les vecteurs étaient clonés dans pmirGLO (Beyotime). Après cela, CCAT1-WT/pmirGLO ou CCAT1-MUT/pmirGLO était co-transfecté avec sh-SOX2 ou sh-SOX2 NC aux cellules CD44⁺HeLa, respectivement, pendant 2 j et puis lysé. L'activité luciférase était testée par le système de détection luciférase (Takara, Dalian, Chine).

Le site web bioinformatique était utilisé pour prédire et analyser les sites de liaison de CCAT1 et miR-185-3p. Les sites de liaison de CCAT1 et miR-185-3p étaient vérifiés par essai de gène rapporteur luciférase double. Le 3'UTR de CCAT1 contenant le site de liaison miR-185-3p était composé. CCAT1 3'UTR WT et CCAT1 3'UTR MUT étaient construits et co-transfectés avec mimics NC et mimics miR-185-3p aux cellules CD44⁺HeLa pendant 2 j. Ensuite, les cellules étaient lysées et l'activité luciférase était testée par le système de détection luciférase (Takara). La même méthode était appliquée pour vérifier la relation de ciblage entre miR-185-3p et FOXP3.

Analyse statistique

Toutes les données étaient évaluées par le logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Les données de mesure étaient indiquées comme moyenne ± écart-type. Le test t était appliqué pour la discrépance entre deux groupes et l'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie par le test de comparaisons multiples de Tukey pour la discrépance parmi les groupes. La variable de classification était évaluée par le test exact de Fisher. Une valeur p inférieure à 0,05 était considérée comme significative.

Résultats

L'expression de miR-185-3p diminue, tandis que les expressions de SOX2, CCAT1 et FOXP3 augmentent dans les tissus CCU, et les expressions de SOX2 et CCAT1 sont liées à la taille de la tumeur, la métastase ganglionnaire (MG) et le stade FIGO

Lors de la détection du rôle de l'axe SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 sur la prolifération et la capacité d'autorenouvellement des cellules souches du CCU, les expressions de miR-185-3p, SOX2, CCAT1 et FOXP3 dans les tissus CCU et tissus normaux adjacents ont été testées par RT-qPCR et essai Western blot. Il a été manifesté que (Fig. 1a-c) l'expression de miR-185-3p était réduite, tandis que les expressions de SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient augmentées dans les tissus CCU.

L'expression de miR-185-3p diminue, tandis que les expressions de SOX2, CCAT1 et FOXP3 augmentent dans les tissus CCU. a Comparaison de l'expression d'ARNm SOX2, CCAT1, miR-185-3p et FOXP3 dans les tissus CCU et normaux adjacents. b Bandes de protéines de l'expression protéique SOX2 et FOXP3 dans les tissus CCU et normaux adjacents. c Comparaison de l'expression protéique SOX2 et FOXP3 dans les tissus CCU et normaux adjacents. *p < 0,05 vs. tissus normaux adjacents. Les données de mesure étaient décrites comme moyenne ± écart-type, et les comparaisons entre deux groupes étaient évaluées par test t

La relation entre l'expression de SOX2/CCAT1 et les caractéristiques clinicopathologiques du CCU a été analysée (Tableau 2). La surexpression de SOX2 et CCAT1 dans le CCU était connectée avec la taille de la tumeur, la MG et le stade FIGO, indiquant que les expressions de SOX2 et CCAT1 étaient plus élevées chez les patientes avec une taille de tumeur plus grande, une MG et un stade FIGO avancé des patientes CCU.

L'expression de miR-185-3p réduit, tandis que les expressions de SOX2, CCAT1 et FOXP3 augmentent dans les cellules CD44⁺HeLa

Ensuite, les expressions de miR-185-3p, SOX2, CCAT1 et FOXP3 dans la lignée cellulaire épithéliale cervicale humaine immortalisée H8 et les lignées cellulaires CCU SiHa, CaSki, HeLa, HCC94 et C33A ont été testées. Il a été suggéré que (Fig. 2a-c) l'expression de miR-185-3p était dégradée, tandis que SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient élevés dans les lignées cellulaires CCU. Parmi eux, SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les cellules HeLa avaient la plus grande différence d'expression par rapport aux cellules H8 ; ainsi, les cellules HeLa étaient criblées et triées ; les HeLa-SFC étaient obtenues par cultures en suspension cellulaire, et l'expression de CD44 à la surface cellulaire avant et après tri était identifiée par cytométrie de flux. Les résultats soulignaient que le taux positif de CD44 dans les HeLa-SFC était marquantement plus élevé que celui avant tri, suggérant un tri réussi des cellules souches du CCU (Fig. 2d). Les cellules souches triées étaient nommées cellules CD44⁺HeLa. Ensuite, les expressions de miR-185-3p, SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient testées dans les cellules HeLa et CD44⁺HeLa (Fig. 2e-g). Il a été manifesté que les expressions de SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient régulées positivement et miR-185-3p était régulée négativement dans les cellules CD44⁺HeLa.

L'expression de miR-185-3p réduit, tandis que les expressions de SOX2, CCAT1 et FOXP3 augmentent dans les cellules CD44⁺HeLa. a Comparaison de l'expression d'ARNm SOX2, CCAT1, miR-185-3p et FOXP3 dans H8 et lignées cellulaires CCU. b Bandes de protéines de l'expression protéique SOX2 et FOXP3 dans H8 et lignées cellulaires CCU. c Comparaison de l'expression protéique SOX2 et FOXP3 dans H8 et lignées cellulaires CCU. d Détection du taux d'expression CD44 dans les cellules HeLa avant et après tri par cytométrie de flux. e Comparaison de l'expression d'ARNm SOX2, CCAT1 et miR-185-3p entre les cellules HeLa et CD44⁺HeLa. f Bande de protéine de l'expression protéique SOX2 dans les cellules HeLa et CD44⁺HeLa. g Comparaison de l'expression protéique SOX2 entre les cellules HeLa et CD44⁺HeLa. ^p < 0,05 vs. cellules H8. ^&p < 0,05 vs. cellules HeLa. Les données de mesure étaient décrites comme moyenne ± écart-type, les comparaisons entre deux groupes étaient évaluées par test t, et les comparaisons parmi plusieurs groupes étaient évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie par le test post-hoc de Tukey

La sous-régulation de SOX2 et la sous-régulation de CCAT1 diminuent la prolifération, la migration, l'invasion et le taux de formation de sphères et augmentent l'apoptose des cellules CD44⁺HeLa

Par la suite, SOX2 et CCAT1 étaient silencés dans les cellules CD44⁺HeLa pour explorer leurs effets sur la prolifération et l'autorenouvellement des cellules souches du CCU. Détecté par essai CCK-8, cytométrie de flux, test de grattage, essai Transwell et expérience de formation de sphères, la prolifération, la migration, l'invasion et le taux de formation de sphères étaient supprimés et l'apoptose des cellules CD44⁺HeLa était favorisée par l'inhibition de SOX2 et CCAT1 (Fig. 3a-i). C'était indicatif que le silence de SOX2 ou CCAT1 inhibait la prolifération et l'autorenouvellement des cellules souches du CCU.

La sous-régulation de SOX2 et la sous-régulation de CCAT1 diminuent la prolifération, la migration, l'invasion et le taux de formation de sphères et augmentent l'apoptose des cellules CD44⁺HeLa. a Essai CCK-8 testé courbe de croissance cellulaire dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. b Cytométrie de flux détectée apoptose cellulaire dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. c Comparaison du taux d'apoptose cellulaire dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. d Migration cellulaire dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2 testée par test de grattage. e Comparaison de la migration cellulaire dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. f Détection de la capacité d'invasion des cellules dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2 par essai Transwell. g Comparaison de la capacité d'invasion des cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. h Expérience de formation de sphères testée capacité d'autorenouvellement dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. i Comparaison du taux de formation de sphères dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. a p < 0,05 vs. groupe sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. groupe sh-CCAT1 NC. Les données de mesure étaient décrites comme moyenne ± écart-type, et les comparaisons parmi plusieurs groupes étaient évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie par le test post-hoc de Tukey

miR-185-3p appauvri inverse le rôle de la sous-régulation de CCAT1 dans les cellules CD44⁺HeLa

Ensuite, nous avons examiné si miR-185-3p était impliqué dans le processus de CCAT1 régulant la prolifération et l'autorenouvellement des cellules souches du CCU. CD44⁺HeLa était transfécté avec mimic miR-185-3p ou co-transfecté avec sh-CCAT1 et inhibiteur miR-185-3p. Les résultats ont présenté que la surexpression de miR-185-3p réduisait notablement la prolifération, la migration, l'invasion et le taux de formation de sphères tout en augmentant le taux d'apoptose des cellules CD44⁺HeLa. Les cellules traitées avec inhibiteur miR-185-3p pouvaient inverser le rôle de CCAT1 sous-régulé dans la prolifération, la migration, l'invasion, l'apoptose et la formation de sphères cellulaires des cellules CD44⁺HeLa (Fig. 4a-i).

miR-185-3p surexprimé supprime la prolifération, la migration, l'invasion et le taux de formation de sphères et augmente l'apoptose des cellules CD44⁺HeLa. a Essai CCK-8 testé courbe de croissance cellulaire dans les cellules traitées avec mimic miR-185-3p. b Cytométrie de flux détectée apoptose cellulaire dans les cellules traitées avec mimic miR-185-3p. c Comparaison du taux d'apoptose cellulaire dans les cellules traitées avec mimic miR-185-3p. d Migration cellulaire dans les cellules traitées avec mimic miR-185-3p testée par test de grattage. e Comparaison de la migration cellulaire dans les cellules traitées avec mimic miR-185-3p. f Détection de la capacité d'invasion des cellules traitées avec mimic miR-185-3p par essai Transwell. g Comparaison de la capacité d'invasion des cellules traitées avec mimic miR-185-3p. h Expérience de formation de sphères testée capacité d'autorenouvellement dans les cellules traitées avec mimic miR-185-3p. i Comparaison du taux de formation de sphères dans les cellules traitées avec mimic miR-185-3p. a p < 0,05 vs. groupe sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. groupe sh-CCAT1 NC. c p < 0,05 vs. groupe mimic NC. d p < 0,05 vs. groupe sh-CCAT1 + inhibiteur NC. Les données de mesure étaient décrites comme moyenne ± écart-type, et les comparaisons parmi plusieurs groupes étaient évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie par le test post-hoc de Tukey

SOX2 faiblement exprimé et CCAT1 faiblement exprimé diminuent l'expression de FOXP3 et augmentent l'expression de miR-185-3p dans les cellules CD44⁺HeLa

Par la suite, nous avons examiné l'expression SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les cellules CD44⁺HeLa après transfection de sh-SOX2, sh-CCAT1, mimic miR-185-3p et co-transfection de sh-CCAT1 et inhibiteur miR-185-3p. Les expressions de SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient réduites, tandis que l'expression de miR-185-3p était élevée dans les cellules traitées avec sh-SOX2. Les expressions de CCAT1 et FOXP3 étaient réduites, et l'expression de miR-185-3p était augmentée dans les cellules traitées avec sh-CCAT1. L'expression de miR-185-3p était élevée, et l'expression de FOXP3 était diminuée dans les cellules introduites avec mimic miR-185-3p. L'expression de FOXP3 était élevée, et l'expression de miR-185-3p était réduite dans les cellules successivement transféctées avec sh-CCAT1 et inhibiteur miR-185-3p (Fig. 5a-d).

SOX2 faiblement exprimé et CCAT1 faiblement exprimé diminuent l'expression de FOXP3 et augmentent l'expression de miR-185-3p dans les cellules CD44⁺HeLa. a Expression SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les groupes sh-SOX2 NC et sh-SOX2. b Expression SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les groupes sh-CCAT1 NC et sh-CCAT1. c Expression SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les groupes mimic NC et mimic miR-185-3p. d Expression SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les groupes sh-CCAT1 + inhibiteur NC et sh-CCAT1 + inhibiteur miR-185-3p. a p < 0,05 vs. groupe sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. groupe sh-CCAT1 NC. c p < 0,05 vs. groupe mimic NC. d p < 0,05 vs. groupe sh-CCAT1 + inhibiteur NC. Les données de mesure étaient décrites comme moyenne ± écart-type, et les comparaisons parmi plusieurs groupes étaient évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie par le test post-hoc de Tukey

SOX2 se lie à CCAT1 ce qui affecte l'expression de miR-185-3p, et FOXP3 est un gène cible de miR-185-3p

Les sites de liaison potentiels de la région promotrice de CCAT1 du facteur de transcription étaient prédits et analysés par le site web https://jaspar.genereg.net/, et il a montré que SOX2 et CCAT1 avaient des sites de liaison potentiels dans la région promotrice de CCAT1 (Fig. 6a). Le ChIP-qPCR a rapporté que (Fig. 6b) : En contraste avec le groupe IgG, plus de fragments promotrices de CCAT1 étaient enrichis dans le groupe SOX2 au site de liaison E1, ce qui a prouvé que SOX2 était lié au promoteur de CCAT1 au site E1 et que SOX2 était impliqué dans la régulation de CCAT1. L'essai de gène rapporteur luciférase double a affiché que (Fig. 6c) : L'activité luciférase était supprimée dans les cellules co-transfectées avec sh-SOX2 et E1-WT, indiquant que SOX2 pouvait se lier à CCAT1.

SOX2 peut se lier à CCAT1 ce qui affecte l'expression de miR-185-3p, et FOXP3 est un gène cible de miR-185-3p. a Prédiction des sites de liaison dans les régions promotrices SOX2 et CCAT1 par sites bioinformatiques. b Expérience ChIP-qPCR a vérifié la relation de liaison entre SOX2 et CCAT1. c Le site de liaison de SOX2 et CCAT1 vérifié par essai de gène rapporteur luciférase double. d Prédiction des sites de liaison dans CCAT1 et miR-185-3p par sites bioinformatiques. e Vérification de la liaison de CCAT1 et miR-185-3p par essai de gène rapporteur luciférase double. f La relation de liaison entre CCAT1 et miR-185-3p dans les cellules vérifiée par essai de tirage d'ARN. g Prédiction de la relation de ciblage entre miR-185-3p et FOXP3 par site web bioinformatique. h Identification de la relation de ciblage entre miR-185-3p et FOXP3 par essai de gène rapporteur luciférase double. Les données de mesure étaient décrites comme moyenne ± écart-type, et les comparaisons entre deux groupes étaient évaluées par test t

Le site web Jefferson a prédit que CCAT1 pouvait se lier à miR-185-3p (Fig. 6d). L'essai de gène rapporteur luciférase double a rapporté que (Fig. 6e) l'activité luciférase était diminuée dans les cellules introduites avec mimic miR-185-3p et CCAT1-WT, suggérant que miR-185-3p pouvait se lier à CCAT1. L'essai de tirage d'ARN a été utilisé pour vérifier si CCAT1 pouvait se lier avec miR-185-3p. Les résultats ont révélé que (Fig. 6f) le niveau d'enrichissement de CCAT1 dans les cellules traitées avec Bio-miR-185-3p-WT augmentait marquantement, tandis que le niveau d'enrichissement de CCAT1 dans les cellules traitées avec Bio-miR-185-3p-MUT ne montrait pas de différence significative. Ce résultat a démontré que CCAT1 pouvait adsorber miR-185-3p, affectant ainsi l'expression de miR-185-3p.

La relation de ciblage entre miR-185-3p et FOXP3 a été prédite par le site web Jefferson (Fig. 6g). L'essai de gène rapporteur luciférase double a vérifié que (Fig. 6h) l'activité luciférase relative des cellules diminuait dramatiquement après co-transfection de FOXP3-WT et mimic miR-185-3p aux cellules CD44⁺HeLa, tandis que FOXP3-MUT co-transfecté avec mimic miR-185-3p n'affectait pas l'activité luciférase relative des cellules, suggérant que miR-185-3p ciblait FOXP3.

Discussion

Le CCU est la quatrième malignité fréquente chez les femmes dans le monde, suivie par les cancers du sein, du côlon et du poumon [3]. Il a été rapporté que les cellules CCU avec expression positive de SOX2 montrent les caractéristiques des cellules souches cancéreuses [21]. Une étude a rapporté que CCAT1 est un lncARN oncogénique essentiel lié au CCU et exerce un rôle facilitant dans la croissance et l'invasion des cellules CCU [11]. Une autre étude révèle que miR-185-3p pourrait prédire la radiosensibilité du carcinome nasopharyngé et réguler la croissance et l'apoptose des cellules cancéreuses [22]. Il a été rapporté que l'auto-anticorps circulant contre FOXP3 reflète la progression continue de la lésion cervicale et peut être un biomarqueur potentiel pour le pronostic précoce du CCU [23]. L'étude actuelle a été conçue pour explorer comment l'axe SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 influençait la prolifération et la capacité d'autorenouvellement des cellules souches du CCU.

Basé sur nos résultats, les expressions de SOX2 et CCAT1 étaient augmentées dans les tissus et cellules CCU qui étaient liés à la taille de la tumeur, la MG et le FIGO avancé. Fonctionnellement prouvé, la sous-régulation de SOX2 et CCAT1 déclinait la prolifération, la migration, l'invasion et le nombre de cellules sphériques et augmentait l'apoptose des cellules souches du CCU. Similaire à notre étude, l'expression de SOX2 tend à augmenter dans le CCU [24, 25]. De plus, l'expression de SOX2 est aussi régulée positivement dans les cellules CCU dérivées des cellules souches cancéreuses [26]. La surexpression de SOX2 était suggérée comme liée aux caractéristiques clinicopathologiques des patientes avec plusieurs types de cancer, non limité au CCU. Par exemple, il a été suggéré que SOX2 régulé positivement se montre dans les patientes carcinome épidermoïde cervical stadiées FIGO I-II [27]. De plus, l'expression de SOX2 est liée à la MG dans le carcinome épidermoïde oral [28]. Quand il s'agit de la fonction moléculaire de SOX2 pour la progression du cancer, il y a un travail observationnel présentant que SOX-2 sous-régulé supprime la migration et l'invasion des cellules du carcinome épidermoïde cervical [29]. Pendant ce temps, une autre recherche a offert une preuve que SOX2 surexprimé améliore la clonogénicité, la prolifération et la tumorigénicité des cellules CCU in vitro et in vivo que les cellules témoins [30].

Concernant la relation de régulation entre SOX2 et CCAT1, une étude existante a présenté que le silence de SOX2 réduit marquantement le niveau d'ARNm CCAT1 [31]. Quant au rôle de CCAT1 dans les cancers, une étude a montré que l'expression de CCAT1 est marquantement élevée dans les tissus CCU versus dans les tissus normaux adjacents [11, 12]. Notamment, la surexpression de CCAT1 dans le CCU est positivement liée à la taille de la tumeur [12]. En termes de rôle de CCAT1 dans l'activité des cellules cancéreuses, il y a une recherche soulignant que CCAT1 surexprimé accélère la prolifération, la formation de colonies et l'invasion des cellules CCU [11]. Intéressant, une recherche précédente a démontré que la viabilité cellulaire, les capacités invasives et migratoires sont déclinées via l'invalidation de CCAT1 [12]. De toute façon, l'effet fonctionnel de SOX2 et CCAT1 dans d'autres cancers était similaire à celui dans le CCU.

Par la suite, notre recherche a révélé que CCAT1 pouvait se lier à miR-185-3p, le CCAT1 sous-régulé dans le CCU et la surexpression de miR-185-3p supprimaient la prolifération et les capacités d'autorenouvellement des cellules souches du CCU. Il est rapporté que CCAT1 et miR-185-3p sont négativement corrélés [13]. De plus, un résultat a rapporté qu'une réduction est vue dans l'expression de miR-185-3p dans les cas de carcinome nasopharyngé radiorésistant [22]. Concernant la fonction suppressive de miR-185-3p dans l'agressivité des cellules cancéreuses, une étude a révélé que la surexpression de miR-185-3p supprime les propriétés invasives et métastatiques des cellules du carcinome nasopharyngé [32]. De plus, Zou et al. ont suggéré que miR-185 restauré réprime la croissance et l'invasion des cellules du cancer du sein [33]. Il y a un article trouvant que la surexpression de miR-185 décline la prolifération, l'invasion et les capacités de formation de colonies des cellules du cancer du poumon non à petites cellules in vitro [34]. Il est présenté que la prolifération cellulaire in vitro, l'invasion et la migration ainsi que la croissance tumorale in vivo sont supprimées via la surexpression de miR-185-3p dans les cellules du cancer du poumon non à petites cellules [35]. De ces études, le rôle anti-tumoral de miR-185-3p dans l'étude présente était cohérent avec les recherches précédentes.

Pour avancer, nous avons dévoilé que miR-185-3p ciblait FOXP3, le gène surexprimé dans le CCU pour réguler les activités des cellules souches du CCU. En fait, FOXP3, le régulateur du marqueur de cellule souche cancéreuse SOX2 dans le cancer du côlon [36], a été investigué dans le CCU, montrant une surexpression dans les cellules CCU [19] [37]. Il a été prouvé que l'élévation de FOXP3 favorise la formation de sphères tumorales et stimule la souche des cellules du cancer du poumon non à petites cellules [38].

Conclusion

Collectivement, nous avons exploré pour la première fois que la transcription de SOX2 pouvait activer CCAT1, inhibant ainsi miR-185-3p et régulant FOXP3 pour favoriser la prolifération et l'autorenouvellement des cellules souches du CCU, ce qui est une voie potentielle pour traiter le CCU. De plus, cependant, des limitations dans cette étude présente existent encore dans la taille d'échantillon relativement petite dans l'expérience conçue. Ainsi, des recherches cliniques pourraient être menées davantage pour détecter l'efficacité pour le traitement du CCU.

Disponibilité des données et matériaux

Non applicable.

Abréviations

CCU :

Cancer du col de l'utérus

SOX2 :

Région déterminant le sexe boîte Y 2

CCAT1 :

Transcript-1 associé au cancer du côlon

miR-185-3p :

MicroARN-185-3p

FOXP3 :

Protéine boîte fourchue 3

lncARN :

ARN non codants longs

FIGO :

Fédération internationale de gynécologie et d'obstétrique

MG :

Métastase ganglionnaire

FBS :

Sérum fœtal bovin

DMEM :

Milieu Dulbecco modifié Eagle

RPMI :

Roswell Park Memorial Institute

IMDM :

Milieu modifié d'Iscove

SFC :

Cellules formant des sphères

FITC :

Fluorescéine isothiocyanate

PI :

Iodure de propidium

PFA :

Paraformaldéhyde

bFGF :

Facteur de croissance fibroblastique basique

EGF :

Facteur de croissance épidermique

RT-qPCR :

Réaction de polymérase en chaîne par transcription inverse quantitative

ChIP :

Immunoprécipitation de chromatine

WT :

Type sauvage

MUT :

Type mutant

NC :

Contrôle négatif

ANOVA :

Analyse de variance