SOX2 régule l'axe lncRNA CCAT1/MicroRNA-185-3p/FOXP3 pour affecter la prolifération et l'auto-renouvellement des cellules souches du cancer du col de l'utérus

Introduction

Le cancer du col (CC) est la quatrième cause majeure de mortalité chez la femme avec environ 570 000 cas et 311 000 décès dans le monde en 2018 [1]. Cette maladie complexe est impliquée dans une variété de facteurs, y compris les effets génétiques et l'infection virale [2]. Avec le développement du co-test du virus du papillome humain et de la vaccination contre le virus du papillome humain, les procédures de diagnostic précoce de la dysplasie cervicale et du cancer entraînent une réduction de l'incidence, de la morbidité et de la mortalité des CC [3]. Pour les patients CC précoces, la chirurgie est recommandée, comme la chirurgie préservant la fertilité, la biopsie conique, la trachélectomie radicale, le curage ganglionnaire pelvien, la radiothérapie pelvienne et la curiethérapie [4]. En raison de métastases ou de récidives chez les patients CC avancés, le pronostic reste sombre [5]. Par conséquent, il est toujours urgent d'identifier de nouveaux marqueurs pronostiques et des stratégies thérapeutiques efficaces pour améliorer le traitement de la CC.

La région déterminant le sexe Y-box 2 (SOX2) est un membre essentiel de la famille des facteurs de transcription SOX et se manifeste principalement dans les cellules souches embryonnaires et adultes et également exprimée dans les cellules souches tumorales [6]. Il a révélé que SOX2 module la radiorésistance dans CC par la voie de signalisation hedgehog [7]. Une autre étude a démontré que SOX2 est crucial pour maintenir la sous-population de cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires CC [8]. Les ARN longs non codants (lncRNAs) sont une classe de molécules d'ARN de 200 nucléotides de long [9]. Le transcrit-1 associé au cancer du côlon LncRNA (CCAT1) est situé sur le chromosome humain 8q24.21 et considéré comme un « point chaud » qui entraîne des mutations génétiques dans le cancer du côlon [10]. Une étude a rapporté que CCAT1 accélère la prolifération cellulaire et l'invasion des CC [11]. Selon Jia et al., CCAT1 améliore considérablement la prolifération, la migration et l'invasion des cellules CC [12]. De plus, une autre étude a révélé que CCAT1 augmente le degré malin de la maladie intestinale inflammatoire en ruinant la barrière intestinale en réduisant le microARN-185-3p (miR-185-3p) [13]. Le miARN peut inverser le contrôle de l'expression du gène en réduisant l'ARNm et en supprimant la traduction [14]. Des expériences in vitro dans une étude antérieure ont révélé que miR-185-3p module la radiorésistance du carcinome nasopharyngé [15]. Une autre étude a impliqué que miR-185 participe à la résistance au cisplatine du cancer de l'ovaire in vivo et in vitro [16]. La protéine Forkhead box 3 (FOXP3) est un facteur de transcription appartenant à la famille des protéines FOX, qui se trouve d'abord dans les cellules T régulatrices (Treg) et joue un rôle vital dans le maintien et le processus des cellules Treg [17]. Une étude rapporte que FOXP3 est lié à la lymphangiogenèse du CC [18]. Une autre étude révèle que le niveau de FOXP3 est fortement lié au stade de la fédération internationale de gynécologie et d'obstétrique (stade FIGO) et à la taille de la tumeur du CC [19]. Dans cette étude, nous avons donc examiné les effets de l'axe SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 sur la prolifération et la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches CC.

Matériaux et méthodes

Approbation éthique et consentement à participer

Les expériences impliquant des êtres humains ont été mises en œuvre dans le respect des principes exprimés dans la Déclaration d'Helsinki. L'étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel du premier hôpital de l'université de Jilin. Tous les participants ont signé un document de consentement éclairé.

Sujets à étudier

De décembre 2016 à décembre 2018, 39 cas de tissus CC et de tissus normaux adjacents correspondants ont été prélevés sur des patients CC et conservés dans de l'azote liquide. Les critères d'inclusion étaient les suivants :(1) Les patients ont été confirmés comme CC par la pathologie des biopsies dans les canaux transcervicaux et cervicaux, la cytologie des frottis cervicaux, le test à l'iode cervical, le spéculum vaginal et la résection des vertèbres cervicales. (2) Les patients n'ont pas reçu de radiothérapie et de chimiothérapie 2 semaines avant l'opération. Les critères d'exclusion étaient les suivants :(1) patients subissant une radiothérapie ou une chimiothérapie, (2) patients en désaccord avec la collecte de l'échantillon et (3) patients présentant des troubles du système immunitaire.

Sélection et culture cellulaires

Les lignées cellulaires CC (SiHa, HeLa, CaSki, HCC94 et C33A) et la lignée cellulaire immortalisée épithéliale cervicale humaine H8 ont été achetées auprès de Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Les cellules CC SiHa, HeLa et HCC94 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à haute teneur en glucose contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), tandis que les cellules CaSki, C33A et H8 dans le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 contenant 10 % FBS (37℃ et 5% CO₂ ). Les cellules ont été détachées et repiquées tous les 2 jours.

Tri des cellules souches CC (CD44 ⁺ Cellules HeLa)

Les cellules souches CC ont été séparées de la lignée cellulaire CC HeLa par culture en suspension cellulaire. Les cellules CC HeLa ont été cultivées avec du milieu de Dulbecco modifié d'Iscove (IMDM) sans sérum dans une boîte de Pétri à ultra-faible adhérence pendant 21 jours, le milieu étant échangé de manière semi-quantitative tous les 3 à 5 jours. Certaines cellules ont été suspendues dans des sphères et des cellules formant des sphères HeLa (SFC) ont été obtenues. La propriété des cellules sphériques a été identifiée et analysée. Les cellules ont été détachées par la trypsine et ajustées à 1 × 10 ⁶ cellules/mL. Les cellules ont été additionnées d'anticorps CD44 et triées par cytométrie en flux. Les cellules HeLa avec CD44 positif étaient des cellules souches tumorales HeLa, tandis que les cellules CD44 négatives étaient des cellules non souches HeLa. Les cellules souches CC ont été cultivées dans du DMEM/F12 et additionnées de 20 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF), de 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF) et de B27. Le milieu contenait 1 % de pénicilline et de streptomycine [20].

Traitement cellulaire

CD44 ⁺ Des cellules HeLa ont été transfectées avec sh-SOX2, sh-SOX2 contrôle négatif (NC), sh-CCAT1, sh-CCAT1 NC, miR-185-3p mimic, mimic NC, sh-CCAT1 et miR-185-3p inhibiteur ainsi que sh-CCAT1 et inhibiteur NC. Toutes les séquences oligonucléotidiques ont été fournies par GenePharma (Shanghai, Chine). Détachées par la trypsine, les cellules ont été ensemencées dans une plaque 6 puits avec 3 × 10 ⁶ cellules/puits. Lorsqu'elles ont atteint 60 % de confluence, les cellules ont été remplacées par un milieu sans sérum et incubées pendant 1 h. La transfection a été facilitée par le réactif de transfection Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Californie, États-Unis).

Réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR)

L'ARN dans les tissus et les cellules a été extrait par Trizol (Invitrogen). L'ARN (1 μg) a été inversé en ADNc par le kit RTase du virus de la leucémie murine Moloney (Invitrogen). L'ADNc a été ajouté au système de PCR en temps réel. Les amorces ont été conçues par Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Chine) (tableau 1). U6 était le contrôle de charge de miR-185-3p, tandis que la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) de SOX2, CCAT1 et FOXP3. Les résultats ont été analysés par 2 ^−ΔΔCt méthode.

Dosage Western Blot

La protéine totale dans les cellules et les tissus a été extraite. La concentration en protéines a été déterminée par des kits d'acide bicinchoninique (AmyJet Scientific, Wuhan, Hubei, Chine). La protéine a été mélangée avec du tampon de charge et bouillie pendant 5 minutes, suivie d'un bain de glace et d'une centrifugation. La protéine a été traitée par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide à 10 % et transférée sur une membrane. La membrane a été bloquée avec du lait écrémé à 5 % pendant 1 h, sondée avec des anticorps primaires SOX2 (1 : 1000, Jiangsu Rui sitan Co., Ltd., Jiangsu, Chine), FOXP3 (1 : 1000, Abcam Inc., Cambridge, MA , USA), GAPDH (1 :1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) et re-sondé avec un anticorps secondaire marqué par la peroxydase de raifort, recouvert d'un film conservateur et exposé. L'imageur Bio-rad Gel Doc EZ (Bio-rad, Californie, États-Unis) a été adopté pour le développement. Les images de protéines ont été analysées par le logiciel ImageJ2x.

Kit de comptage cellulaire (CCK)-8 Dosage

Le test CCK-8 a été mis en œuvre avec les kits (Beyotime, Shanghai, Chine). Cellules (1 × 10 ⁴ ) ont été ensemencés dans une plaque à 96 puits et incubés. Cultivées pendant 0, 24, 48 et 72 h, les cellules ont été additionnées de 10 L/puits de solution de CCK-8 et écloses pendant 1 h. La valeur de densité optique a été déterminée avec un lecteur de microplaques pleine longueur d'onde Multiskan Spectrum à 450 nm. Six puits ont été prélevés pour compter la valeur moyenne. La courbe de croissance cellulaire a été tracée avec le temps en ordonnée et la viabilité cellulaire relative en ordonnée. La valeur de la densité optique représentait la prolifération cellulaire.

Cytométrie en flux

Cellules (1 × 10 ⁶ ) ont été centrifugés à 1500 tr/min, suspendus avec 200 L de tampon de liaison, incubés avec 5 L d'iodure de propidium (PI) et 5 L d'isothiocyanate d'annexine V-fluorescéine (FITC) à tour de rôle et ajoutés avec 400 L de tampon. Le taux d'apoptose cellulaire a été vérifié par un cytomètre en flux (BD Biosciences, NJ, USA).

Test de grattage

Les cellules transfectées ont été détachées et préparées en suspension cellulaire. Suspensions cellulaires (1 × 10 ⁶ cellules/mL) ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits et cultivées à 80-90% de confluence. Des rayures transversales et longitudinales sur la plaque à 6 puits ont été réalisées uniformément par une pointe de pipette aseptique de 10 L le long de la règle. Le milieu d'origine a été remplacé par un milieu complet et les cellules ont été cultivées en continu. La migration des cellules a été observée au microscope à 0 h et 72 h et photographiée sur le même site.

Test de Transwell

Les cellules transfectées ont été trypsinisées, centrifugées à 1000 g et rincées au DMEM. Une chambre Transwell entièrement hydratée a été placée dans une plaque à 24 puits contenant 10 % de FBS-DMEM (600 ml/puits). Suspension cellulaire (5 × 10 ⁵ cellules/mL, 200 L) a été ajouté dans la chambre supérieure Transwell (revêtue de 1:8 Matrigel 80 L), tandis que 500 L 20% FBS-DMEM à la chambre inférieure. Les cellules ont été cultivées en continu pendant 24 h, fixées avec 500 L de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et colorées avec une solution de coloration au cristal violet à 0,1 %. Ensuite, les cellules à la surface et au bord de la chambre supérieure ont été essuyées avec un coton-tige. Cinq champs ont été sélectionnés au hasard et les cellules ont été comptées sous un microscope Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon, Japon).

Dosage de formation de sphère

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits à faible adsorption contenant un milieu de suspension sans sérum avec 200 cellules/puits. Après 2 w, le taux de formation de sphères de cellules a été observé sous un microscope Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon), et le taux de formation de sphères a été calculé comme nombre moyen de sphères/nombre de cellules ensemencées × 100 %.

Test d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Le test ChIP a été opéré avec le kit ChIP (Upstate, NY, USA). Des anticorps SOX2 (1:1000, Re-stem Biotech, Jiangsu, Chine) et IgG de lapin normal (12-370, Millipore, USA) ont été utilisés pour immunoprécipiter le complexe protéine-ADN réticulé. CD44 ⁺ Les cellules HeLa ont été fixées avec 1 % de PFA et incubées pour produire une réticulation ADN-protéine. Ensuite, l'ADN a été coupé en fragment de chromatine de 200 à 300 pb par ultrasons. L'ADN de chromatine précipité a été récupéré et analysé par RT-qPCR.

Test d'extraction d'ARN

Les plasmides de type sauvage (WT) et de type mutant (MUT) miR-185-3p marqués à la biotine (50 nM) ont été transfectés dans CD44 ⁺ cellules HeLa, respectivement. Les cellules ont été écloses avec un lysat cellulaire spécifique (Ambion, Austin, Texas, USA) après 48 h de transfection. Le lysat cellulaire (50 mL) a été sous-emballé. Le lysat résiduel a été éclos avec des billes de streptavidine M-280 (Sigma, St. Louis, MO, USA) préalablement enrobées d'ARNt sans RNase et de levure (Sigma). Ensuite, les cellules ont été nettoyées deux fois avec du lysat froid, trois fois avec un tampon à faible teneur en sel et une fois avec un tampon à haute teneur en sel. Une sonde miR-185-3p antagoniste a été mise en place en tant que NC. L'ARN total a été extrait par Trizol, et le niveau de CCAT1 a été testé par RT-qPCR.

Dosage du gène rapporteur double luciférase

Les sites de liaison potentiels El et E2 de SOX2 sur la région du promoteur CCAT1 ont été prédits par https://jaspar.genereg.net/. La séquence promotrice CCAT1 contenant SOX2 et le site de liaison CCAT1 E1 a été synthétisée, et les vecteurs CCAT1 3'UTR WT (E1-WT) et CCAT1 3'UTR MUT (E1-MUT) ont été formés. Les vecteurs ont été clonés dans pmirGLO (Beyotime). Après cela, CCAT1-WT/pmirGLO ou CCAT1-MUT/pmirGLO a été co-transfecté avec sh-SOX2 ou sh-SOX2 NC en CD44 ⁺ Cellules HeLa, respectivement, pendant 2 jours puis lysées. L'activité luciférase a été testée par un système de détection de luciférase (Takara, Dalian, Chine).

Le site Web de bioinformatique a été utilisé pour prédire et analyser les sites de liaison de CCAT1 et miR-185-3p. Les sites de liaison de CCAT1 et miR-185-3p ont été vérifiés par double dosage du gène rapporteur de la luciférase. CCAT1 3'UTR contenant le site de liaison miR-185-3p a été composé. CCAT1 3′UTR WT et CCAT1 3′UTR MUT ont été construits et co-transfectés avec des mimiques NC et miR-185-3p en CD44 ⁺ Cellules HeLa pendant 2 j. Ensuite, les cellules ont été lysées et l'activité luciférase a été testée par un système de détection de luciférase (Takara). La même méthode a été appliquée pour vérifier la relation de ciblage entre miR-185-3p et FOXP3.

Analyse statistique

Toutes les données ont été évaluées par le logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Les données de mesure ont été indiquées en tant que moyenne ± écart type. Le test t a été appliqué pour l'écart entre deux groupes et l'analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie du test de comparaisons multiples de Tukey pour l'écart entre les groupes. La variable de classification a été évaluée par le test exact de Fisher. Un p une valeur inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.

Résultats

L'expression de miR-185-3p diminue, tandis que les expressions SOX2, CCAT1 et FOXP3 augmentent dans les tissus CC, et les expressions SOX2 et CCAT1 sont liées à la taille de la tumeur, au ganglion lymphatique Métastase (LNM) et stade FIGO

Lors de la détection du rôle de l'axe SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 sur la capacité de prolifération et d'auto-renouvellement des cellules souches CC, les expressions miR-185-3p, SOX2, CCAT1 et FOXP3 dans les tissus CC et les tissus normaux adjacents ont été testé par RT-qPCR et test western blot. Il s'est manifesté que (Fig. 1a–c) l'expression de miR-185-3p était réduite, tandis que les expressions SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient augmentées dans les tissus CC.

L'expression de miR-185-3p diminue, tandis que les expressions SOX2, CCAT1 et FOXP3 augmentent dans les tissus CC. un Comparaison de l'ARNm SOX2, CCAT1, miR-185-3p et expression de l'ARNm FOXP3 dans CC et les tissus normaux adjacents. b Bandes protéiques de l'expression des protéines SOX2 et FOXP3 dans le CC et les tissus normaux adjacents. c Comparaison de l'expression des protéines SOX2 et FOXP3 dans le CC et les tissus normaux adjacents. *p < 0,05 par rapport aux tissus normaux adjacents. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne  ±  écart-type, et les comparaisons entre deux groupes ont été évaluées par le test t

La relation entre l'expression de SOX2/CCAT1 et les caractéristiques clinicopathologiques de CC a été analysée (tableau 2). Les SOX2 et CCAT1 surexprimés dans le CC étaient liés à la taille de la tumeur, au stade LNM et FIGO, ce qui indique que les expressions SOX2 et CCAT1 étaient plus élevées chez les patients présentant une plus grande taille de tumeur, le LNM et le stade FIGO avancé des patients CC.

L'expression miR-185-3p réduit, tandis que les expressions SOX2, CCAT1 et FOXP3 augmentent dans CD44 ⁺ Cellules HeLa

Ensuite, les expressions miR-185-3p, SOX2, CCAT1 et FOXP3 dans les lignées cellulaires immortalisées épithéliales cervicales humaines H8 et CC SiHa, CasKi, HeLa, HCC94 et C33A ont été testées. Il a été suggéré que (Fig. 2a–c) l'expression de miR-185-3p était dégradée, tandis que SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient élevées dans les lignées cellulaires CC. Parmi eux, SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les cellules HeLa présentait la plus grande différence d'expression par rapport aux cellules H8 ; ainsi, les cellules HeLa ont été triées et triées; Les HeLa-SFC ont été obtenues par des cultures en suspension cellulaire et l'expression de CD44 à la surface cellulaire avant et après le tri a été identifiée par cytométrie en flux. Les résultats ont souligné que le taux positif de CD44 dans les HeLa-SFC était nettement plus élevé que celui avant le tri, suggérant un tri réussi des cellules souches CC (Fig. 2d). Les cellules souches triées ont été nommées CD44 ⁺ Cellules HeLa. Ensuite, les expressions miR-185-3p, SOX2, CCAT1 et FOXP3 ont été testées dans HeLa et CD44 ⁺ Cellules HeLa (Fig. 2e–g). Il s'est avéré que les expressions SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient régulées à la hausse et que miR-185-3p était régulé à la baisse dans CD44 ⁺ Cellules HeLa.

L'expression miR-185-3p diminue, tandis que les expressions SOX2, CCAT1 et FOXP3 s'élèvent en CD44 ⁺ Cellules HeLa. un Comparaison de l'expression de l'ARNm SOX2, CCAT1, miR-185-3p et FOXP3 dans les lignées cellulaires H8 et CC. b Bandes protéiques de l'expression des protéines SOX2 et FOXP3 dans les lignées cellulaires H8 et CC. c Comparaison de l'expression des protéines SOX2 et FOXP3 dans les lignées cellulaires H8 et CC. d Détection du taux d'expression de CD44 dans les cellules HeLa avant et après tri par cytométrie en flux. e Comparaison de l'expression de l'ARNm SOX2, CCAT1 et miR-185-3p entre les cellules HeLa et CD44 ⁺ Cellules HeLa. f Bande protéique de l'expression de la protéine SOX2 dans les cellules HeLa et CD44 ⁺ Cellules HeLa. g Comparaison de l'expression de la protéine SOX2 entre les cellules HeLa et CD44 ⁺ Cellules HeLa. ^p <0,05 par rapport aux cellules H8. ^& p <0,05 par rapport aux cellules HeLa. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne   ± écart type, les comparaisons entre deux groupes ont été évaluées par un test t et les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par une ANOVA à un facteur suivie du test post hoc de Tukey.

La régulation à la baisse SOX2 et la régulation à la baisse CCAT1 diminuent la prolifération, la migration, l'invasion et le taux de formation de sphères et augmentent l'apoptose de CD44 ⁺ Cellules HeLa

Par la suite, SOX2 et CCAT1 ont été réduits au silence dans CD44 ⁺ cellules HeLa pour explorer leurs effets sur la prolifération et l'auto-renouvellement des cellules souches CC. Détecté par le test CCK-8, la cytométrie en flux, le test de rayure, le test Transwell et l'expérience de formation de sphères, la prolifération, la migration, l'invasion et le taux de formation de sphères ont été supprimés et l'apoptose de CD44 ⁺ Les cellules HeLa ont été favorisées par l'inhibition de SOX2 et CCAT1 (Fig. 3a–i). Il était indicatif que le silence SOX2 ou CCAT1 inhibait la prolifération et l'auto-renouvellement des cellules souches CC.

La régulation négative de SOX2 et la régulation négative de CCAT1 diminuent le taux de prolifération, de migration, d'invasion et de formation de sphères et augmentent l'apoptose de CD44 ⁺ Cellules HeLa. un Le test CCK-8 a testé la courbe de croissance cellulaire dans des cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. b La cytométrie en flux a détecté l'apoptose cellulaire dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. c Comparaison du taux d'apoptose cellulaire dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. d Migration cellulaire dans des cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2 testées par scratch test. e Comparaison de la migration cellulaire dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. f Détection de la capacité d'invasion des cellules dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2 par test Transwell. g Comparaison de la capacité d'invasion des cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. h Une expérience de formation de sphères a testé la capacité d'auto-renouvellement dans des cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. je Comparaison du taux de formation de sphères dans les cellules traitées avec sh-CCAT1 ou sh-SOX2. un p <0,05 vs le groupe sh-SOX2 NC. b p <0,05 vs le groupe sh-CCAT1 NC. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne  ±  écart-type, et les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey

MiR-185-3p appauvri inverse le rôle de régulation à la baisse de CCAT1 dans CD44 ⁺ Cellules HeLa

Ensuite, nous avons examiné si miR-185-3p était impliqué dans le processus de CCAT1 régulant la prolifération et l'auto-renouvellement des cellules souches CC. CD44 ⁺ HeLa a été transfecté avec miR-185-3p mimic ou co-transfecté avec sh-CCAT1 et miR-185-3p inhibiteur. Les résultats ont montré que la régulation à la hausse de miR-185-3p réduisait considérablement le taux de prolifération, de migration, d'invasion et de formation de sphères tout en augmentant le taux d'apoptose de CD44 ⁺ Cellules HeLa. Les cellules traitées avec l'inhibiteur miR-185-3p pourraient inverser le rôle de CCAT1 régulé à la baisse dans la prolifération, la migration, l'invasion, l'apoptose et la formation de sphères cellulaires de CD44 ⁺ Cellules HeLa (Fig. 4a–i).

Le miR-185-3p surexprimé supprime la prolifération, la migration, l'invasion et le taux de formation de sphères et augmente l'apoptose de CD44 ⁺ Cellules HeLa. un Le test CCK-8 a testé la courbe de croissance cellulaire dans des cellules traitées avec miR-185-3p mimic. b La cytométrie en flux a détecté l'apoptose cellulaire dans les cellules traitées avec miR-185-3p mimic. c Comparaison du taux d'apoptose cellulaire dans les cellules traitées avec miR-185-3p mimic. d Migration cellulaire dans des cellules traitées avec miR-185-3p mimic testé par scratch test. e Comparaison de la migration cellulaire dans les cellules traitées avec miR-185-3p mimic. f Détection de la capacité d'invasion des cellules traitées avec miR-185-3p mimic par test Transwell. g Comparaison de la capacité d'invasion des cellules traitées avec miR-185-3p mimic. h L'expérience de formation de sphères a testé la capacité d'auto-renouvellement dans des cellules traitées avec miR-185-3p mimic. je Comparaison du taux de formation de sphères dans les cellules traitées avec miR-185-3p mimic. un p <0,05 vs le groupe sh-SOX2 NC. b p <0,05 vs le groupe sh-CCAT1 NC. c p <0,05 vs le groupe NC mimé. d p < 0,05 par rapport au groupe NC sh-CCAT1 + inhibiteur. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne  ±  écart-type, et les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey

SOX2 faiblement exprimés et CCAT1 faiblement exprimés diminuent l'expression FOXP3 et augmentent l'expression miR-185-3p dans CD44 ⁺ Cellules HeLa

Ensuite, nous avons examiné l'expression de SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans CD44 ⁺ Cellules HeLa après transfection de sh-SOX2, sh-CCAT1, miR-185-3p imitent et co-transfection d'inhibiteur de sh-CCAT1 et miR-185-3p. Les expressions SOX2, CCAT1 et FOXP3 étaient réduites, tandis que l'expression miR-185-3p était élevée dans les cellules traitées avec sh-SOX2. Les expressions de CCAT1 et FOXP3 ont été réduites et l'expression de miR-185-3p a été améliorée dans les cellules traitées avec sh-CCAT1. L'expression de miR-185-3p était élevée et l'expression de FOXP3 était diminuée dans les cellules introduites avec miR-185-3p mimic. L'expression de FOXP3 était élevée et l'expression de miR-185-3p était réduite dans les cellules successivement transfectées avec sh-CCAT1 et l'inhibiteur miR-185-3p (Fig. 5a–d).

SOX2 faiblement exprimé et CCAT1 faiblement exprimé diminuent l'expression de FOXP3 et augmentent l'expression de miR-185-3p dans CD44 ⁺ Cellules HeLa. un Expression de SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les groupes sh-SOX2 NC et sh-SOX2. b Expression de SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les groupes sh-CCAT1 NC et sh-CCAT1. c Expression de SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les groupes mimic NC et miR-185-3p. d Expression de SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dans les groupes inhibiteurs sh-CCAT1 + inhibiteur NC et sh-CCAT1 + miR-185-3p. un p <0,05 vs le groupe sh-SOX2 NC. b p <0,05 vs le groupe sh-CCAT1 NC. c p <0,05 vs le groupe NC mimé. d p < 0,05 par rapport au groupe NC sh-CCAT1 + inhibiteur. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne  ±  écart-type, et les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey

SOX2 se lie à CCAT1 qui affecte l'expression de miR-185-3p, et FOXP3 est un gène cible de miR-185-3p

Les sites de liaison potentiels du facteur de transcription de la région du promoteur CCAT1 ont été déterminés et analysés par le site Web https://jaspar.genereg.net/, et il a montré que SOX2 et CCAT1 avaient des sites de liaison potentiels dans la région du promoteur CCAT1 (Fig. 6a). ChIP-qPCR a rapporté que (Fig. 6b) :contrairement au groupe IgG, davantage de fragments du promoteur CCAT1 étaient enrichis dans le groupe SOX2 au site de liaison E1, ce qui prouvait que SOX2 était lié au promoteur CCAT1 au site E1 et que SOX2 était impliqué dans la régulation du CCAT1. Le double test du gène rapporteur de la luciférase a montré que (Fig. 6c) :l'activité de la luciférase a été supprimée dans les cellules co-transfectées avec sh-SOX2 et E1-WT, indiquant que SOX2 pouvait se lier à CCAT1.

SOX2 peut se lier à CCAT1 qui affecte l'expression de miR-185-3p, et FOXP3 est un gène cible de miR-185-3p. un Prédiction des sites de liaison dans les régions promotrices SOX2 et CCAT1 par les sites bioinformatiques. b L'expérience ChIP-qPCR a vérifié la relation de liaison entre SOX2 et CCAT1. c Le site de liaison de SOX2 et CCAT1 vérifié par double dosage du gène rapporteur de la luciférase. d Prédiction des sites de liaison dans CCAT1 et miR-185-3p par des sites bioinformatiques. e Vérification de la liaison de CCAT1 et miR-185-3p par double dosage du gène rapporteur de la luciférase. f La relation de liaison entre CCAT1 et miR-185-3p dans les cellules vérifiée par le test ARN pull-down. g Prédiction de la relation de ciblage entre miR-185-3p et FOXP3 par site bioinformatique. h Identification de la relation de ciblage entre miR-185-3p et FOXP3 par double dosage du gène rapporteur de la luciférase. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne  ±  écart-type, et les comparaisons entre deux groupes ont été évaluées par le test t

Le site Web de Jefferson a prédit que CCAT1 pourrait se lier à miR-185-3p (Fig. 6d). Le double test du gène rapporteur de la luciférase a indiqué que (Fig. 6e) l'activité de la luciférase était diminuée dans les cellules introduites avec miR-185-3p mimic et CCAT1-WT, suggérant que miR-185-3p pourrait se lier à CCAT1. Un essai de pull-down d'ARN a été utilisé pour vérifier si CCAT1 pouvait se lier avec miR-185-3p. Les résultats ont révélé que (Fig. 6f) le niveau d'enrichissement de CCAT1 dans les cellules traitées avec Bio-miR-185-3p-WT a augmenté de façon marquée, tandis que le niveau d'enrichissement de CCAT1 dans les cellules traitées avec Bio-miR-185-3p-MUT a montré pas de différence significative. Ce résultat a démontré que CCAT1 pouvait adsorber miR-185-3p, affectant ainsi l'expression de miR-185-3p.

La relation cible entre miR-185-3p et FOXP3 a été prédite par le site Web de Jefferson (Fig. 6g). Le double test du gène rapporteur de la luciférase a vérifié que (Fig. 6h) l'activité relative de la luciférase des cellules a considérablement diminué après que FOXP3-WT et miR-185-3p ont mimé co-transfecté en CD44 ⁺ Les cellules HeLa, tandis que FOXP3-MUT co-transfecté avec miR-185-3p mimique n'a pas affecté l'activité relative de la luciférase des cellules, suggérant que miR-185-3p ciblait FOXP3.

Discussion

Le CC est la quatrième tumeur maligne fréquente chez la femme dans le monde, suivi des cancers du sein, du colon et du poumon [3]. Il a rapporté que les cellules CC avec une expression positive de SOX2 présentent les caractéristiques des cellules souches cancéreuses [21]. Une étude a rapporté que CCAT1 est un lncRNA oncogène essentiel lié à CC et exerce un rôle facilitant dans la croissance et l'invasion des cellules CC [11]. Une autre étude révèle que miR-185-3p pourrait prédire la radiosensibilité du carcinome nasopharyngé et réguler la croissance et l'apoptose des cellules cancéreuses [22]. Il a rapporté que l'auto-anticorps circulant contre FOXP3 reflète la progression continue de la lésion cervicale et peut être un biomarqueur potentiel pour le pronostic précoce du CC [23]. L'étude actuelle a été conçue pour explorer comment l'axe SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 influence la prolifération et la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches CC.

Sur la base de nos résultats, les expressions SOX2 et CCAT1 ont augmenté dans les tissus et les cellules CC qui étaient liées à la taille de la tumeur, au LNM et à la FIGO avancée. Functionally proved, down-regulating SOX2 and CCAT1 declined proliferation, migration, invasion and sphere cells number and increased apoptosis of CC stem cells. Similar to our study, SOX2 expression trends to increase in CC [24, 25]. Moreover, SOX2 expression is also up-regulated in CC cells derived from cancer stem cells [26]. Overexpressed SOX2 was suggested to link with clinicopathological characteristics of patients with several types of cancer, not limited to CC. For example, it was suggested that up-regulated SOX2 shows in cervical squamous cell carcinoma patients staged in FIGO I-II [27]. Moreover, SOX2 expression is linked to LNM in oral squamous cell carcinoma [28]. When it comes to the molecular function of SOX2 for cancer progression, there is an observational work presenting that down-regulated SOX-2 suppresses cell migration and invasion of cervical squamous cell carcinoma [29]. Meanwhile, another research has offered a proof that up-regulated SOX2 enhances CC cell clonogenicity, proliferation and tumorigenicity in vitro and in vivo than control cells [30].

Concerning to the regulatory relation between SOX2 and CCAT1, an existed study has presented that silencing SOX2 markedly reduces CCAT1 mRNA level [31]. As to the role of CCAT1 in cancers, a study has showed that CCAT1 expression is markedly elevated in CC tissues versus in the adjacent normal tissues [11, 12]. Of note, CCAT1 overexpression in CC is positively related to the tumor size [12]. In terms of the role of CCAT1 in cancer cell activity, there is a research highlighting that overexpressed CCAT1 accelerates CC cell proliferation, colony formation and invasion [11]. Interestingly, a previous research has demonstrated that the cell viability, invasive and migratory abilities are declined via knocking down CCAT1 [12]. Anyway, the functional effect of SOX2 and CCAT1 in other cancers was similar to that in CC.

Afterward, our research revealed that CCAT1 could bind to miR-185-3p, the down-regulated CCAT1 in CC and overexpressing miR-185-3p suppressed the proliferation and self-renewal abilities of CC stem cells. It is reported that CCAT1 and miR-185-3p are negatively correlated [13]. Furthermore, a result reported that a reduction is seen in miR-185-3p expression in radioresistant nasopharyngeal carcinoma cases [22]. Regarding to the suppressive function of miR-185-3p in cancer cell aggressiveness, a study has revealed that up-regulation of miR-185-3p suppresses the invasive and metastatic properties of nasopharyngeal carcinoma cells [32]. Furthermore, Zou et al. have suggested that restored miR-185 represses breast cancer cell growth and invasion [33]. There is a article finding that up-regulation of miR-185 declines the proliferation, invasion and colony formation capacities of non-small cell lung cancer cells in vitro [34]. It is presented that in vitro cell proliferation, invasion and migration as well as in vivo tumor growth are suppressed via miR-185-overexpressing in non-small cell lung cancer cells [35]. From those studies, the anti-tumor role of miR-185-3p in the present study was consistent with previous researches.

To proceed, we unveiled that miR-185-3p targeted FOXP3, the overexpressed gene in CC to regulate CC stem cell activities. In fact, FOXP3, the regulator of SOX2 cancer stem-like cell marker in colon cancer [36], has been investigated in CC, showing an up-regulation in CC cells [19] [37]. It was evidenced that elevating FOXP3 promotes the formation of tumor spheres and stimulates the stemness of non-small cell lung cancer cells [38].

Conclusion

Collectively, we explored for the first time that SOX2 transcription could activate CCAT1, thereby inhibiting miR-185-3p and regulating FOXP3 to promote the proliferation and self-renewal of CC stem cells, which is a potential avenue to treat CC. Additionally, however, limitations in this present study still exist in the relatively small trial size in the designed experiment. Thus, clinical researches might be further carried out to detect the efficacy for the treatment of CC.

Disponibilité des données et des matériaux

Non applicable.