Échafaudages nHAC/PLGA intégrant de l'oxyde de graphène favorisent la prolifération d'ostéoblastes et la régénération osseuse

Résumé

Les échafaudages poreux biodégradables sont centraux pour l'ingénierie tissulaire osseuse. Dans cette étude, du nano-hydroxyapatite/collagène (nHAC) mélangé avec de l'acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA) et des quantités variables d'oxyde de graphène (GO) ont été fabriqués par lyophilisation. Les composites résultants présentent un réseau poreux tridimensionnel continu. Le GO améliore légèrement l'hydrophilie et augmente significativement le module de Young, avec l'échantillon 1,5 % en poids GO atteignant 10,20 ± 1,28 GPa comparé à 7,53 ± 1,25 GPa pour l'échafaudage sans GO. In vitro, les ostéoblastes MC3T3-E1 ont affiché une adhésion et une prolifération nettement supérieures sur l'échafaudage 1,5 % GO, comme confirmé par les essais CCK-8 et l'imagerie MEB. Ces résultats démontrent que les échafaudages nHAC/PLGA/GO combinent une excellente cytocompatibilité avec une performance mécanique supérieure, les positionnant comme candidats prometteurs pour les applications de régénération osseuse.

Contexte

Les échafaudages poreux tridimensionnels qui imitent la matrice extracellulaire osseuse sont essentiels pour une réparation osseuse réussie. Les techniques de fabrication conventionnelles—électrofilage, conception topologique computationnelle (CTD) combinée avec fabrication libre solide (SFF), et lyophilisation—offrent des degrés variables de contrôle structural et d'évolutivité. La lyophilisation, en particulier, fournit une voie simple pour générer des pores hautement interconnectés par sublimation d'un solvant gelé sous vide.

L'os natif consiste en un assemblage hiérarchique de collagène et d'hydroxyapatite (HA). Les composites nano-hydroxyapatite/collagène (nHAC) imitent cette architecture naturelle, offrant une biocompatibilité et une biodégradabilité favorables. Cependant, la fragilité intrinsèque du collagène et sa dégradation rapide limitent son utilisation. L'acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA) apporte une robustesse mécanique et des taux de dégradation ajustables, tandis que le GO offre des propriétés physicochimiques uniques—grande surface spécifique, renforcement mécanique, et groupes fonctionnels qui peuvent moduler le comportement cellulaire.

Des travaux antérieurs ont montré que les échafaudages enrichis en GO améliorent la différenciation ostéogénique et la prolifération cellulaire. Ici, nous avons évalué systématiquement comment le chargement incrémental de GO (0,0, 0,5, 1,0 et 1,5 % en poids) affecte la performance structurale, mécanique, hydrophile et biologique des composites nHAC/PLGA.

Résultats et discussion

Structure des échafaudages composites nHAC/PLGA/GO

Le processus de fabrication impliquait la dissolution de collagène de type I dans l'acide acétique, la co-précipitation d'ions Ca et P pour former le nHAC, le mélange avec PLGA et GO dispersé, suivi de lyophilisation. La microscopie électronique à balayage (MEB) a révélé une architecture hautement poreuse avec des pores interconnectés allant de 0 à 200 nm. La distribution des pores a été quantifiée par un analyseur de surface automatisé (Fig. 2f), confirmant une prédominance de pores sous-100 nm, une gamme de taille propice à l'infiltration d'ostéoblastes.

Schéma de fabrication de l'échafaudage par lyophilisation.

Caractérisation physicochimique et mécanique

La diffraction des rayons X sur poudre (DRX) a confirmé la présence d'HA hexagonale ; les signaux GO n'étaient pas discernables en raison de son faible chargement. Les spectres FT-IR ont affiché les bandes amides caractéristiques du collagène et les pics de phosphate, avec des décalages subtils indiquant une interaction chimique entre le collagène, HA, PLGA et GO.

Des mesures nano-mécaniques quantitatives par AFM (QNM-AFM) ont révélé une augmentation monotone du module de Young avec la teneur en GO : 7,53 ± 1,25 GPa (0 %), 8,34 ± 1,00 GPa (0,5 %), 9,15 ± 0,85 GPa (1,0 %), et 10,20 ± 1,28 GPa (1,5 %). L'échafaudage 1,5 % GO a affiché un avantage de rigidité statistiquement significatif par rapport au homologue sans GO, reflétant l'effet de renforcement du GO.

Les mesures d'angle de contact ont montré une diminution progressive de 125,1° (sans GO) à 101,4° (1,5 %), indiquant une mouillabilité de surface améliorée due aux groupes fonctionnels hydrophiles du GO (Fig. 4f).

Images AFM (a-d) et cartes de rigidité (i) des quatre variantes d'échafaudage ; angles de contact (k) mesurés par méthode de goutte sessile.

Culture cellulaire et cytotoxicité

Les ostéoblastes MC3T3-E1 ensemencés sur les échafaudages ont présenté une activité métabolique croissante sur 7 jours (essai CCK-8). Bien que la prolifération précoce sur les échafaudages 0,5 % et 1,0 % GO ait été légèrement inférieure au témoin sans GO, l'échafaudage 1,5 % GO a égalé et dépassé le témoin aux jours 3, 5 et 7 (Fig. 5). Les images MEB ont confirmé l'étalement cellulaire étendu et la formation de réseau, avec des cellules sur les échafaudages chargés en GO affichant des morphologies plus grandes et plus aplaties (Fig. 6).

Les fibroblastes NIH-3T3 exposés aux suspensions d'échafaudages pendant 24 h n'ont montré aucune cytotoxicité significative ; la viabilité est restée supérieure à 97 % pour tous les chargements GO, affirmant la biocompatibilité des composites (Fig. 7).

Viabilité cellulaire des MC3T3-E1 sur les quatre variantes d'échafaudage (*** p < 0,01).

Images MEB des cellules MC3T3-E1 aux jours 1, 3, 5 et 7 sur les quatre types d'échafaudage.

Viabilité relative des cellules NIH-3T3 après 24 h d'exposition aux suspensions d'échafaudage.

Conclusions

La lyophilisation a permis la fabrication d'échafaudages nHAC/PLGA/GO avec une porosité interconnectée, une rigidité mécanique accrue et une hydrophilie améliorée. L'échafaudage 1,5 % GO a démontré une adhésion et une prolifération supérieures des ostéoblastes tout en maintenant une excellente cytocompatibilité, soulignant son potentiel comme échafaudage d'ingénierie tissulaire osseuse.

Méthodes

Matériaux

Collagène de type I, PLGA (75:25, Mw = 95 kDa), GO, et réactifs de culture cellulaire provenaient de fournisseurs établis. Les ostéoblastes MC3T3-E1 et fibroblastes NIH-3T3 ont été obtenus de banques de cellules réputées.

Préparation des échafaudages

Le collagène a été dissous dans de l'acide acétique 0,5 M (4 g L⁻¹). Des solutions de calcium et phosphate (Ca/P = 1,66) ont été ajoutées goutte à goutte à 100 gouttes min⁻¹, agitées, et titrées à pH 9 avec de l'ammoniaque à 37 °C. Après 24 h, le précipité a été collecté, lyophilisé, et broyé pour produire la poudre nHAC.

Le GO a été dispersé dans le dioxane (0,0, 0,5, 1,0, 1,5 g L⁻¹) par ultrasons, puis mélangé avec PLGA (10 % m/v) et agité 12 h. Le nHAC a été ajouté à un rapport de poids 1:1 avec PLGA, suivi de 4 h d'ultrasons. Le mélange a été congelé à –20 °C pendant la nuit et lyophilisé pour obtenir les échafaudages finaux.

Caractérisation

MEB, AFM (mode QNM), FT-IR, DRX, angle de contact, et mesures de porosité ont été réalisés selon des protocoles standards. Toutes les données ont été collectées en triplicat.

Culture cellulaire et essais

Les cellules MC3T3-E1 ont été ensemencées à 2,5 × 10⁴ cellules mL⁻¹ sur des disques d'échafaudage et cultivées en DMEM +10 % FBS +3 % antibiotiques à 37 °C, 5 % CO₂. La prolifération a été évaluée par CCK-8 aux jours 1, 3, 5 et 7. Pour la MEB, les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde, déshydratées, séchées au point critique, et métallisées à l'or.

Test de cytotoxicité

Les cellules NIH-3T3 ont été exposées à 100 mg mL⁻¹ de suspensions d'échafaudage pendant 24 h, suivi de l'essai CCK-8. La viabilité cellulaire a été calculée par rapport aux cultures témoins.

Analyse statistique

Les données sont exprimées en moyenne ± ET. Le test t de Student a été appliqué ; p < 0,05 était considéré significatif.