Les échafaudages nHAC/PLGA hybrides à l'oxyde de graphène facilitent la prolifération des cellules MC3T3-E1

Contexte

L'ingénierie des tissus osseux combinant des échafaudages poreux tridimensionnels et des cellules osseuses a été largement étudiée comme une approche attrayante dans le traitement des tissus défectueux ou perdus [1]. Les échafaudages biodégradables, qui imitent la nature de l'os, jouent un rôle important pour accueillir les cellules, contrôler l'adhésion et la prolifération cellulaires et faciliter la régénération osseuse [2]. Jusqu'à présent, diverses méthodes, notamment l'électrofilage, l'intégration de la conception de la topologie informatique (CTD) et de la fabrication de forme libre solide (SFF) et la lyophilisation ont été appliquées pour fabriquer différentes structures poreuses tridimensionnelles (3D) [3,4,5 ,6,7]. L'électrofilage est capable de fabriquer des échafaudages nanofibreux ou microfibres avec des structures complexes (fibre alignée, en forme de ressort) et des compositions [7]. Cependant, son efficacité de production est un peu faible. L'intégration de CTD et SFF permet la conception d'échafaudages anatomiques 3D avec une architecture poreuse et une meilleure propriété mécanique. Mais cette méthode nécessite de solides connaissances professionnelles [4]. Par rapport à ces deux méthodes, la méthode de lyophilisation permet de fabriquer des structures poreuses avec un procédé beaucoup plus simple par la sublimation de la phase liquide congelée sous vide pour fabriquer une structure poreuse [8].

Les os naturels possèdent une architecture hiérarchique complexe avec deux composants principaux, le collagène et l'hydroxyapatite [9,10,11]. En ingénierie tissulaire osseuse, la fabrication d'un biomimétisme idéal de la matrice extracellulaire osseuse permettant l'adhésion et la prolifération cellulaires pour le traitement des dysfonctionnements reste un défi [12]. Des échafaudages biodégradables à base de nano-hydroxyapatite/collagène (nHAC) qui imitent l'os naturel pourraient offrir une meilleure biocompatibilité, affinité cellulaire et biorésorbabilité [13]. Cependant, les inconvénients du collagène, notamment ses propriétés mécaniques médiocres et sa dégradation rapide, restent un obstacle à son application en ingénierie tissulaire osseuse [14]. Les polymères aliphatiques biodégradables, tels que l'acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA), avec une résistance mécanique élevée, une biocompatibilité exceptionnelle, une biodégradabilité et une bonne solubilité dans les solvants organiques, sont des matériaux compensés idéaux pour la construction d'échafaudages poreux 3D pour l'ingénierie du tissu osseux [15 , 16]. Un échafaudage poreux hybride contenant du collagène et des polymères synthétiques combine les avantages du collagène et des polymères et surmonte leurs faiblesses, ce qui est largement utilisé pour la réparation et la régénération osseuses [17,18,19]. Par exemple, Liao et al. ont développé un échafaudage osseux préparé par nHAC et poly(acide lactique) (PLA) pour favoriser la régénération osseuse [17]. Niu et al. ont fabriqué des échafaudages composites nHAC/poly(acide L-lactique)/microsphères de chitosane pour améliorer la prolifération des ostéoblastes [19].

Récemment, l'oxyde de graphène (GO), une nouvelle feuille de carbone d'une épaisseur d'un atome [20, 21], a suscité un grand intérêt dans le domaine biologique car il possède une bonne biocompatibilité. Les échafaudages hybrides GO sont capables d'enrichir à la fois les propriétés mécaniques de l'échafaudage et les comportements cellulaires, tels que la propagation et la prolifération cellulaires [22, 23]. Luo et al. ont rapporté que l'incorporation de GO dans les nanofibres PLGA augmentait la prolifération et la différenciation ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses (CSM) [20]. Jing et al. ont rapporté que l'ajout de 1,0 % en poids de GO dans le polyuréthane thermoplastique pourrait faciliter la prolifération cellulaire des fibroblastes de souris suisses [24]. Par rapport à l'ajout d'agents de réticulation chimiques (génipine, glutaraldéhyde, carbodiimide, etc.. ) [25, 26], qui ont une certaine cytotoxicité, pour améliorer les propriétés mécaniques des échafaudages composites, la petite quantité d'échafaudages hybrides GO montre une bonne biocompatibilité. Par conséquent, l'hybridation du GO et du nHAC/PLGA pourrait être un nouvel échafaudage artificiel pour les tissus osseux.

Dans cette étude, les échafaudages poreux nano-hydroxyapatite/collagène/poly(acide lactique-co-glycolique)/oxyde de graphène (nHAC/PLGA/GO), qui contiennent différents rapports pondéraux de GO (0,0, 0,5, 1,0 et 1,5 wt %) ont été fabriqués et caractérisés. Les échafaudages d'hybridation présentent des structures poreuses. L'ajout de GO modifie la propriété hydrophile et la propriété mécanique des échafaudages d'hybridation. Pour étudier l'effet de l'échafaudage nHAC/PLGA/GO sur l'ingénierie des tissus osseux, les cellules MC3T3-E1 ont été cultivées sur les échafaudages d'hybridation poreux. Les résultats montrent que les échafaudages d'hybridation dopés GO à 1,5 % en poids facilitent l'adhésion, la croissance et la prolifération cellulaires, ce qui indique en outre que l'échafaudage nHAC/PLGA/GO peut être considéré comme un candidat prometteur dans l'ingénierie du tissu osseux.

Résultats et discussion

Structure des échafaudages composites nHAC/PLGA/GO

La figure 1 illustre le processus de fabrication des échafaudages nHAC/PLGA/GO. Les détails du processus de fabrication sont présentés dans la section expérimentale. Le nHAC a été synthétisé avant de fabriquer les échafaudages composites nHAC/PLGA/GO. L'image au microscope électronique à balayage (MEB) de la poudre nHAC montre sa nanostructure. Les spectres correspondants de spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDS) de nHAC sont également affichés (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1), qui révèle la présence de Ca, Cu, P, C et O. Les signaux de cuivre devraient être des contributions du échantillons à l'appui. Ainsi, le nHAC est composé de Ca, P, C, O, et le rapport molaire Ca:P de la poudre de nHAC est de 1,41, ce qui est inférieur à celui de l'hydroxyapatite (HA) (1,66). Cela indique que l'AH synthétisé est de type carence en calcium [27], ce qui entraînera une réduction de la dureté, du module d'élasticité et de la ténacité du nHAC. Pour augmenter les propriétés mécaniques de l'échafaudage composite, le PLGA et le GO ont été ajoutés à la poudre nHAC. La vue d'ensemble optique des échafaudages nHAC/PLGA/GO fabriqués avec différentes quantités de GO est illustrée à la Fig. 2a. L'échantillon est un cylindre d'un diamètre de 14 mm. Il est évident que les échafaudages composites sans GO sont de couleur blanche. Au fur et à mesure de l'augmentation du GO, les échafaudages composites deviennent de plus en plus sombres. Les morphologies détaillées des différents échafaudages nHAC/PLGA/GO sont révélées par SEM (Fig. 2b–e). Cela montre de manière significative que tous les échafaudages forment des structures poreuses et que les surfaces de quatre échafaudages différents sont assez rugueuses. Afin de caractériser les informations de ces trous, nous avons utilisé un testeur automatique de surface et de porosité pour évaluer. Les résultats de la distribution des trous ont été présentés sur la Fig. 2f. La taille des quatre trous d'échafaudage est comprise entre 0 et 200 nm. Et le nombre de trous dont les dizaines de nanomètres sont plus que ceux de quelques centaines de nanomètres dans quatre échafaudages. Il a été rapporté que la porosité des échafaudages de biomatériaux n'est pas négligeable pour la formation osseuse in vitro et in vivo [28]. Pour optimiser l'intégration dans les tissus environnants, les échafaudages pour l'ostéogenèse doivent imiter la morphologie, la structure et la fonction des os [4]. Ainsi, la structure poreuse 3D des échafaudages composites nHAC/PLGA/GO est essentielle pour la régénération osseuse. Les images SEM à grande échelle des quatre échafaudages composites sont également affichées (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2), qui illustre les structures d'ensemble de différentes surfaces.

Schéma de principe du processus de fabrication des échafaudages nHAC/PLGA/GO

un Image optique des échafaudages nHAC/PLGA/GO synthétisés avec une quantité différente de GO. b –e Images SEM de b nHAC/PLGA, c nHAC/PLGA/GO (0,5 poids %), d nHAC/PLGA/GO (1,0 % % % %) et e échafaudages nHAC/PLGA/GO (1,5 % en poids). f Distribution des trous de nHAC/PLGA/GO (0, 0,5, 1,0 et 1,5 % en poids)

Caractérisations physico-chimiques et mécaniques des échafaudages composites nHAC/PLGA/GO

Le mécanisme du processus de synthèse peut être révélé par les spectres de diffraction des rayons X (XRD) et de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) de diverses substances simples et composites (Fig. 3). Comme indiqué sur la figure 3a, la phase inorganique a été déterminée comme HA selon le fichier de diffraction de poudre (fiche PDF n° 09-0432) car aucun pic d'autres matériaux Ca-P n'était présent dans le modèle XRD. Par rapport à nHA, les pics de diffraction élargis de nHAC impliquaient une petite taille de grain et une faible cristallinité. Semblable à nHAC, le modèle de nHAC/PLGA/GO avec une quantité différente de GO avait également une faible cristallinité. Cependant, le pic de GO n'est pas apparu dans les composites nHAC/PLGA/GO, ce qui pourrait être dû à la faible quantité de GO par rapport à la masse. La figure 3b montre les spectres FT-IR de diverses substances simples et composites. À partir de la figure 3b, les bandes typiques du collagène peuvent être observées, telles que l'étirement N-H à 3336 cm ⁻¹ pour l'amide A; C–H étirement à 3079 cm ⁻¹ pour l'amide B; C=O étirement à 1656 cm ⁻¹ pour l'amide I; Déformation N–H à 1548 cm ⁻¹ pour l'amide II et pic d'absorption à 1238 cm ⁻¹ pour l'amide III. Au fur et à mesure de la formation de nHAC, l'amide A passe de 3336 cm ⁻¹ à environ 3411 cm ⁻¹ , l'amide B était affaibli, l'amide I, l'amide II, l'amide III passent de 1656, 1548 et 1238 cm ⁻¹ à 1654, 1542 et 1240 cm ⁻¹ , respectivement. Ainsi, il confirme la réaction chimique entre le collagène et le HA. De plus, les pics à 1033, 601 et 563 cm ⁻¹ sont les pics typiques pour (PO4) ³⁻ groupe, qui indique la nouvelle formation de HA sur le collagène en raison du HA marchand ne possédant que des pics caractéristiques de (PO4) ³⁻ à 1033, 603 et 565 cm ⁻¹ . Les pics caractérisés de PLGA autour de 2996 et 2944 cm ⁻¹ ont été affectés à −CH₂ , 1752 cm ⁻¹ a été attribué à C=O, 1183 et 1093 cm ⁻¹ ont été affectés à C–O, sont clairement visibles. Par rapport à l'échafaudage PLGA, les pics de l'échafaudage nHAC/PLGA se déplacent de 1752 et 1183 cm ⁻¹ à 1760 et 1187 cm ⁻¹ , respectivement, qui démontrent la réaction chimique entre la puissance PLGA et nHAC. Par rapport à l'échafaudage nHAC/PLGA, les pics des échafaudages nHAC/PLGA dopés GO sont passés de 1760 à 1762 cm ⁻¹ ; il y a un décalage vers le rouge qui démontre la réaction chimique entre GO et nHAC/PLGA.

un XRD et b Spectres FT-IR de différents composants

La nanostructure et les propriétés mécaniques des échafaudages nHAC/PLGA/GO avec différentes quantités de GO ont été caractérisées par un microscope à force atomique nanomécanique quantitatif (QNM-AFM) [29,30,31,32,33,34], qui est capable de fournit spontanément la morphologie et la rigidité et est largement utilisé pour détecter les propriétés mécaniques de divers matériaux, y compris l'os [30], les dents [35], la cornée [36], etc. La figure 4a–d montre la tomographie de quatre types de composites échafaudages. En raison de la limitation des zones de balayage, les images AFM ne montrent que la structure de surface locale. Ainsi, la structure poreuse n'est pas évidente. Cependant, les images AFM montrent également une morphologie de surface rugueuse similaire aux images SEM. La rugosité a un effet important sur la prolifération et la différenciation cellulaires. La surface à surface rugueuse était bénéfique à la prolifération et à la différenciation cellulaires [37,38,39]. Les profils de ligne (Fig. 4e–h) dérivés de la morphologie (Fig. 4a–d) montrent les différences de hauteur maximales seules dans différentes directions de ligne. Il est clairement démontré que les différences de hauteur maximales vont de ~ 200 à ~ 600 nm. La distribution de rigidité correspondante (Fig. 4i) montre que le module de Young de quatre échafaudages différents est de 7,53 ± 1,25, 8,34 ± 1,00, 9,15 ± 0,85 et 10,20 ± 1,28 GPa, respectivement. Pour montrer clairement les différences de rigidité, le graphique à barres correspondant est également donné (Fig. 4j). Bien que le module de Young des échafaudages nHAC/PLGA/GO avec quelques différences de quantité de GO ne soit pas significativement différent, par exemple, le nHAC/PLGA/GO avec une quantité de GO de 0,0 et 0,5 % en poids (7,53 ±1,25 et 8,34 ± 1,00 GPa), de 0,5 et 1,0 % en poids (8,34 ± 1,00 et 9,15 ± 0,85 GPa), de 1,0 et 1,5 % en poids (9,15 ± 0,85 et 10,20 ± 1,28 GPa), le module de Young des échafaudages nHAC/PLGA/GO avec un La différence de quantité de bits GO (0,0 % en poids et 1,5 % en poids) est significativement différente (7,53  ± 1,25 et 10,20 ± 1,28 GPa). Cela indique que la propriété mécanique de l'échafaudage nHAC/PLGA/GO augmente avec l'augmentation de la quantité de GO.

Images AFM de a nHAC/PLGA, b nHAC/PLGA/GO (0,5 poids %), c nHAC/PLGA/GO (1,0 % en poids) et d échafaudages nHAC/PLGA/GO (1,5 % en poids). e –h Profils de lignes dérivés des images morphologiques. je Répartition de la rigidité des quatre différents échafaudages mesurée par QNM-AFM. j Le graphique à barres du module de Young par rapport au montant GO. k Les angles de contact correspondants de quatre types d'échafaudages mesurés par la méthode de la goutte sessile

L'hydrophilie des échafaudages joue un rôle clé dans l'interaction avec les cellules. L'ajout de GO augmente non seulement les propriétés mécaniques des échafaudages composites, mais modifie également l'hydrophobie de quatre types d'échafaudages. La figure 4f montre les angles de contact de différents échafaudages nHAC/PLGA/GO. Les angles de contact des échafaudages nHAC/PLGA étaient d'environ 125,1° alors que pour nHAC/PLGA/GO avec une quantité de GO différente (0,5, 1,0 et 1,5 % en poids) étaient respectivement d'environ 113,4°, d'environ 103,4° et d'environ 101,4°. Au fur et à mesure que la quantité de GO augmente, les angles de contact des échafaudages composites diminuent légèrement en raison à la fois des groupes hydroxyle et des groupes chargés négativement, tels que les groupes acide carboxylique sur la surface GO [40]. Ainsi, GO peut fournir une bioactivité remarquable aux échafaudages 3D nHAC/PLGA.

En général, les échafaudages pour l'ingénierie tissulaire nécessitent non seulement la présentation d'une morphologie et de propriétés biocompatibles, mais également d'une structure poreuse et d'une résistance physique [41]. Les échafaudages 3D nHAC/PLGA/GO lyophilisés possèdent une structure poreuse en raison de la sublimation du solvant. Les groupes fonctionnels, y compris les espèces hydroxyle (OH), époxy (C-O-C) et carboxyle (COOH) sur les surfaces des échafaudages [40] induisent une bonne hydrophilie. L'ajout de PLGA et GO fournit une force physique suffisante. Ainsi, les échafaudages 3D nHAC/PLGA/GO pourraient être un candidat prometteur pour l'ingénierie tissulaire.

Culture cellulaire

Il est bien connu que les échafaudages utilisés pour le tissu osseux doivent être biocompatibles, prolifératifs cellulaires et exclusifs de la réponse immunitaire [21]. Le nHAC/PLGA/GO, qui contient les composants de l'os naturel (collagène et HA) et possède des propriétés mécaniques et une hydrophilie appropriées, devrait être un candidat idéal pour l'ingénierie tissulaire osseuse. Pour étudier la prolifération cellulaire de ces échafaudages, les cellules ostéoblastiques MC3T3-E1 ont été cultivées dans ce travail. La figure 5 montre la viabilité cellulaire en fonction du temps de culture évaluée par le test du kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8). La prolifération des cellules a été constamment augmentée pendant toute la période de culture pour tous les groupes. Plus précisément, la prolifération cellulaire de MC3T3-E1 sur les échafaudages nHAC/PLGA/GO (0,5 et 1,0 % en poids) est significativement diminuée au jour 1, tandis que celle sur les échafaudages nHAC/PLGA/GO (1,5 % en poids) est similaire à celle sur les échafaudages nHAC/PLGA/GO (1,5 % en poids) Échafaudages nHAC/PLGA. À mesure que le temps augmente, la prolifération cellulaire de MC3T3-E1 sur les échafaudages nHAC/PLGA/GO (1,5 % en poids) augmente considérablement aux jours 3, 5 et 7. Cependant, la prolifération cellulaire de MC3T3-E1 sur nHAC/PLGA/GO (0,5 et 1,0 % en poids) n'est pas significativement différent de celui des échafaudages nHAC/PLGA.

Comparaison des cellules MC3T3-E1 sur différentes surfaces d'échafaudages ; les doubles astérisques indiquent p < 0,01, nombre d'échantillons N = 4

La preuve de la croissance cellulaire, de la prolifération sur différents échafaudages a également été capturée par SEM. La figure 6 montre la morphologie de surface des cellules ostéoblastiques sur quatre échafaudages différents après avoir été cultivées pendant 1, 3, 5, 7 jours, respectivement. Au jour 1, toutes les cellules sont réparties uniformément et isolées sur quatre échafaudages différents. Au fil du temps (jours 3, 5 et 7), tous les groupes de cellules se développent, prolifèrent et commencent à s'intégrer sur différents échafaudages, formant une grande couche de cellules. Par rapport aux morphologies cellulaires sur différents échafaudages, les cellules sur les surfaces des échafaudages nHAC/PLGA/GO étaient beaucoup plus grandes et étirées que celles sur la surface des échafaudages nHAC/PLGA. Il n'y a pas de différence significative dans la situation de propagation des cellules, d'adhérence entre les cellules sur nHAC/PLGA/GO avec des quantités différentes (0,5, 1,0 et 1,5 % en poids) selon les images SEM.

un –p Images SEM de cellules MC3T3-E1 cultivées sur quatre échafaudages différents pendant 1, 3, 5 et 7 jours. Les barres d'échelle mesurent 50 μm dans toutes les images. L'astérisque blanc représente les cellules ostéoblastiques MC3T3-E1.

Test de cytotoxicité

La cytotoxicité de la GO est une préoccupation essentielle, pour son application dans le domaine de la biologie. Nous évaluons donc la cytotoxicité des quatre échafaudages dans le temps de 24 h. Les résultats ont été montrés dans la Fig. 7. La vitalité cellulaire des cellules de fibroblastes (NIH-3T3) dans nHAC/PLGA contient 0,5,1 et 1,5 % de GO équivaut à 99 101,11 et 97,86 % se rapportent à nHAC/PLGA, qui n'ont pas de différence significative. que nHAC/PLGA, indiquant que l'augmentation de l'oxyde de graphène est sûre à 0-1,5%.

L'activité relative des cellules HIH-373 dans nHAC/PLGA (0,5, 1, 1,5 % en poids) se rapporte à nHAC/PLGA

Le tableau 1 résume les propriétés mécaniques et les propriétés de culture cellulaire de quatre types d'échafaudages composites. Au fur et à mesure que le GO augmente, le module de Young des échafaudages augmente en conséquence. Cependant, seules les propriétés mécaniques de nHAC/PLGA et nHAC/PLGA/GO (1,5% en poids) sont nettement différentes. La viabilité cellulaire de quatre types d'échafaudages montre la même tendance avec la propriété mécanique, c'est-à-dire que les valeurs de DO de tous les groupes augmentent avec l'augmentation du temps de culture cellulaire, mais seuls les nHAC/PLGA et nHAC/PLGA/GO (1,5 wt %) groupes montrent une différence significative. Cela indique que la propriété mécanique des échafaudages est étroitement liée à la propriété de culture cellulaire. Les résultats peuvent être dus au fait que les cellules tissulaires peuvent ressentir et répondre à la rigidité de leurs substrats [42,43,44,45]. Le réglage des propriétés mécaniques des substrats peut favoriser les réponses cellulaires affectant les interactions cellule-surface ainsi que la croissance et la viabilité cellulaires [46,47,48,49]. Haugh et al. ont trouvé que la rigidité des échafaudages augmentait l'activité des cellules MC3T3-E1 (prolifération et migration cellulaire) [50]. Engler et al. ont démontré qu'un facteur physique important dans la réponse de nombreux types de cellules était la rigidité du substrat [51]. Ils ont découvert que les cellules musculaires lisses dérivent de l'aorte de rat (lignée A7R5), comme d'autres cellules dépendantes de l'ancrage, se propagent davantage et organisent leur cytosquelette et leurs adhérences focales beaucoup plus sur des substrats « rigides » que sur des substrats « mous ». La propriété mécanique affecte non seulement les comportements cellulaires mais aussi les activités tissulaires. Duncan et al. ont étudié la mécanotransduction et la contrainte mécanique de la réponse fonctionnelle sur l'os. Ils ont découvert que la charge mécanique peut inhiber la résorption osseuse et augmenter la formation osseuse in vivo [52]. Par conséquent, les échafaudages nHAC/PLGA/GO (1,5 % en poids) les plus rigides pourraient favoriser la prolifération des cellules MC3T3-E1.

La cytotoxicité de GO est une préoccupation essentielle pour son application dans le domaine de la biologie. Jusqu'à présent, deux arguments ont été soulevés. L'un prétend que le GO induirait une cytotoxicité et que son effet dépend de la concentration. Par exemple, Chatterjee et al. ont rapporté la réponse toxique avec une dépendance à la dose différentielle pour GO [53]. Pinto, et al. ont rapporté que seules de faibles concentrations de GO peuvent être incorporées en toute sécurité dans le PLA pour faciliter l'adhésion et la prolifération cellulaires [6]. Les autres affirment qu'une quantité encore plus élevée de GO aurait une bonne biocompatibilité et améliorerait à la fois les propriétés mécaniques des substrats et les comportements cellulaires. Shin, et al. ont étudié les myoblastes squelettiques C2C12 étaient améliorés sur les matrices hybrides PLGA-GO-collagène par rapport aux matrices PLGA, PLGA-collagène [54]. Et Luo, et al. ont rapporté que les échafaudages de nanofibres PLGA dopé GO peuvent améliorer la différenciation ostéogénique des CSM [22]. Dans cette étude, le GO a été sélectionné sur la base du premier argument. La quantité limitée est ajoutée dans les échafaudages composites pour la non-cytotoxicité et l'amélioration des propriétés mécaniques. La conjugaison de GO dans les échafaudages nHAC/PLGA a considérablement amélioré la croissance et la prolifération cellulaires. Bien que le nombre de cellules sur nHAC/PLGA et nHAC/PLGA avec une petite quantité de GO, par exemple, nHAC/PLGA/GO (0,5 % en poids), soit plus ou moins le même, le nombre de cellules sur nHAC/PLGA/GO (1,5 % en poids) d'échafaudage était plus élevé que celui des échafaudages nHAC/PLGA. Ces résultats indiquent que les échafaudages nHAC/PLGA/GO sont biofonctionnels avec la capacité d'améliorer la croissance et la prolifération des cellules MC3T3-E1. Par conséquent, l'excellente biocompatibilité et la biofonctionnalité permettent d'utiliser nHAC/PLGA/GO comme échafaudages efficaces pour la régénération osseuse.

La nature du biomatériau et le processus de fabrication sont très importants pour les propriétés de l'échafaudage [28]. Jusqu'à présent, les biomatériaux ont été largement étudiés, notamment les métaux [55], les céramiques [56], le verre [57], les polymères synthétisés chimiquement [58], les polymères naturels [59] et les combinaisons de ces matériaux pour former des composites [60] . La modification des composants des échafaudages composites induira la propriété des échafaudages. Par exemple, pour fabriquer l'échafaudage biomimique de l'os naturel, le collagène de type I a été utilisé dans cette étude. Actuellement, la famille du collagène comprend plus de 20 types différents de collagène existant dans la peau, les os, le cartilage, etc. En remplaçant le collagène de type I par d'autres types, il est possible de fabriquer différents échafaudages composites à des fins différentes. Par exemple, le collagène de type II est l'un des collagènes formant des fibrilles et le type prédominant de collagène dans le cartilage. La coordination du collagène de type II dans les échafaudages peut faciliter la régénération osseuse du cartilage [61]. De plus, le collagène avec un recuit approprié peut renforcer davantage les échafaudages, ce qui peut induire un nouveau matériau composite avec des structures fonctionnelles. Outre la nature des biomatériaux, le traitement détermine également le fonctionnement des échafaudages, tels que les différentes méthodes de traitement. La chimie et le traitement des matériaux déterminent les propriétés fonctionnelles maximales ainsi que la façon dont les cellules interagissent avec l'échafaudage. Les échafaudages de propriétés et d'exigences en ingénierie du tissu osseux ont été largement étudiés, y compris la dégradation [62], les propriétés mécaniques [63], l'administration de cytokines [64] et les combinaisons d'échafaudages et de cellules [65].

Conclusions

En résumé, des échafaudages nHAC/PLGA/GO avec différentes quantités de GO (0,0, 0,5, 1,0 et 1,5 % en poids) ont été fabriqués par la méthode de lyophilisation. Les échafaudages nHAC/PLGA/GO fabriqués présentent une structure poreuse. De plus, les propriétés mécaniques et l'hydrophilie des échafaudages sont améliorées grâce à l'ajout de PLGA et de GO. L'étude in vitro montre que les échafaudages poreux facilitent l'adsorption, la croissance et la prolifération des cellules. Ces échafaudages nHAC/PLGA/GO pourraient être un candidat prometteur pour les applications de tissus osseux.

Méthodes

Matériaux

Le collagène de type 1 lyophilisé purifié a été obtenu auprès de Tianjin Saining Biological Engineering Technology Co., Ltd. PLGA avec un rapport lactide:glycolide de 75:25 et un Mw de 95 000 g/mol a été acheté auprès de Shandong Medical Appliance Factory (Chine). GO a été acheté auprès de Shanghai Aladdin biochemical Polytron Technologies Inc. Les cellules ostéoblastiques MC3T3-E1 ont été fournies par la banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences de Shanghai. Le sérum bovin fœtal (FBS), l'antibiotique-antimycotique, la CCK-8 et le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) ont été obtenus auprès de Tianjin Nobuo Letter Technology Co., Ltd. 1,4-dioxane, solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 0,1 M, PH 7,4) et tous les autres produits chimiques étaient de qualité analytique et utilisés tels qu'ils ont été reçus sans autre purification.

Préparation des échafaudages nHAC Power et composites nHAC/PLGA/GO

La méthode de composition de la poudre nHAC a été rapportée précédemment [66,67,68]. En bref, le collagène a été dissous dans de l'acide acétique (0,5 mol/L) formant une solution à la concentration de 4 g/L. Le CaCl₂ et H₃ Bon de commande₄ (Ca/P =  1,66) les solutions ont ensuite été ajoutées séparément par gouttes. Le taux de goutte est de 100 gouttes par minute. La solution a été doucement agitée et titrée à 37 °C avec une solution d'ammoniaque jusqu'à pH 9. Après 24 h, le dépôt de nHAC a été récolté par centrifugation et lyophilisation. Pour la préparation des échafaudages composites nHAC/PLGA/GO, GO a été uniformément dispersé dans du dioxane à l'aide d'un concasseur à ultrasons, formant une concentration finale de 0,0, 0,5, 1,0 et 1,5 g/L, respectivement. Le PLGA a ensuite été ajouté dans des solutions de GO, formant une concentration finale de 10 % (m/v). Les solutions de GO/PLGA ont ensuite été agitées doucement à température ambiante pendant 12 h. La solution finale a été formée en ajoutant la puissance nHAC dans la solution GO/PLGA à un rapport pondéral nHAC:PLGA de 1:1. La solution nHAC/PLGA/GO formée a ensuite été agitée et soumise aux ultrasons pendant 4 h. Après avoir été congelés à − 20 °C pendant la nuit, les échafaudages composites nHAC/PLGA/GO ont été obtenus par lyophilisation pour éliminer le dioxane.

Caractérisations

Les échafaudages composites étaient recouverts d'or et ont été observés au MEB (JSM-7100F). Nous pulvérisons de l'or pendant 20 s pour la préparation d'échantillons en microscopie électronique. La topographie et les propriétés mécaniques des matrices ont été caractérisées par microscopie à force atomique (AFM, Multimode VIII, Bruker, Allemagne) dans l'air. L'analyse des images a été effectuée à l'aide du logiciel d'analyse Gwyddion et Nanoscope. L'analyse de la composition des échafaudages composites nHAC/PLGA/GO a été réalisée par un spectrophotomètre FT-IR (VECTOR22, Bruker, Allemagne). Tous les spectres ont été enregistrés en mode d'absorption dans la plage de longueurs d'onde de 1 000 à 2 200 cm ⁻¹ avec une résolution de 4,0 cm ⁻¹ et 16 fois la numérisation. Les angles de contact des échantillons ont été mesurés à l'aide d'un système de mesure d'angle de contact par la méthode de la goutte sessile (EasyDrop, modèle DAS30, kruss, Allemagne). Les diagrammes XRD ont été mesurés à l'aide du diffractomètre à rayons X (D8 DISCOVER). Le rayonnement Cu-Kα (λ = 0.154 nm) est de 40 kV et 30 mA. La vitesse de balayage des mesures est de 8°min ⁻¹ sur la plage 2θ de 5 à 80° à température ambiante. La porosité des échafaudages a été mesurée par un analyseur automatique de surface et de porosité (ASAP 2460, Micromeritics, GA, USA).

Culture cellulaire

Les cellules ostéoblastiques MC3T3-E1 ont été incubées dans du DMEM additionné de 10 % de FBS et de 3 % de solution antibiotique-antimycosique à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un incubateur cellulaire. L'attachement initial et la prolifération ont été testés en utilisant CCK-8 selon les instructions du fabricant, dans lequel le nombre de cellules viables était directement proportionnel aux produits de réaction métabolique obtenus dans le test CCK-8 [69]. Brièvement, les cellules ostéoblastiques MC3T3-E1 ont été ensemencées à une densité de 2,5 × 10 ⁴ cellules par puits sur les matrices nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0,5 % en poids), nHAC/PLGA/GO (1,0 % en poids) et nHAC/PLGA/GO (1,5 % en poids) intégrées dans une culture cellulaire à 48 puits assiette. Les cellules ont été incubées avec la solution de CCK-8 au cours des 2 dernières heures des périodes de culture (1, 3, 5 et 7 jours) pour la prolifération à 37 °C dans l'obscurité. L'absorbance a été mesurée à la longueur d'onde de 450 nm à l'aide d'un lecteur ELISA (DNM-9602).

Les échantillons de cellules pour la mesure SEM ont été fixés avec du formaldéhyde, et les échantillons ont ensuite été déshydratés à travers une série graduée d'éthanol (30, 50, 75, 95 et 100 %) pendant 15 minutes à chaque concentration. Ensuite, les échantillons ont été séchés par séchage au point critique avec un analyseur de dioxyde de carbone (Hitachi, HCP-2). Finally, the samples with gold coating were observed by SEM.

Cytotoxicity Test

The fibroblasts cells concentration was adjusted to 1 × 10 ⁴ /ml and was inoculated into 96-well plates at 200 ul per well. Then, the well plates were incubated at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for 24 h. The samples (nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%), nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) and nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)) were powdered to make a 100 mg/ml suspension. The experiment group with 100 ul suspension and control group with equal volume of DMEM complete medium were incubated for 24 h and were further incubated for 4 h after the CCK-8 was added to the incubator. The cell viability was obtained by measuring the absorbance at the wavelength of 450 nm using an ELISA reader. The cell viability was calculated by using the following formula,

Where A (experiment) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution and power samples solution; A (blank) represents absorbance of wells with medium and CCK-8 solution without cells and A (control) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution without power samples solution.

Analyse statistique

Quantitative results were expressed as the mean value from at least triplicate samples ± standard deviation (SD). Student’s t test was used to the statistical analysis. A value of p  < 0.05 was considered statistically significant. Data are marked ** to indicate p  < <0.01.

Abréviations

3D:

Three-dimensional

AFM :

Microscopie à force atomique

CCK-8:

Cell counting kit-8

CTD:

Computational topology design

DMEM :

Dulbecco’s modified Eagle media

EDS :

X-ray spectroscopy

FBS :

Sérum fœtal bovin

FT-IR:

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

GO:

Graphene oxide

HA:

Hydroxyapatite

MC3T3-E1:

Osteoblast cells

MSC :

Cellules souches mésenchymateuses

nHAC:

Nano-hydroxyapatite/collagen

NIH-3T3:

Fibroblast cells

PBS:

Phosphate-buffered saline

PLA:

Poly(lactic acid)

PLGA:

poly(lactic-co-glycolic acid)

QNM-AFM:

Quantitative nano-mechanical atomic force microscope

SD:

Standard deviation

SEM :

Microscope électronique à balayage

SFF:

Olid free-form fabrication

XRD :

Diffraction des rayons X