Amélioration de l'ostéoinductivité par des échafaudages en fibroïne de soie chargés en rhBMP-2 pour l'ingénierie tissulaire osseuse

Résumé

La demande croissante de formulations d'échafaudages en fibroïne de soie (FS) pour applications biomédicales a motivé cette étude. La FS a été réticulée via le glutaraldéhyde avec la protéine morphogénétique osseuse recombinante humaine-2 (rhBMP-2) à différents ratios : (i) 3 % FS sans rhBMP-2 (FS), (ii) 3 % FS avec quantité égale de rhBMP-2 (FS+BMP2), et (iii) 12 % FS avec 3 % de rhBMP-2 (4FS+BMP2). Ces solutions ont servi à la fabrication par électrofilage de nanofibres pour évaluer le potentiel ostéoinductif accru. Les courbes contrainte-déformation montrent qu'il n'y a pas de perte de résistance mécanique avec l'ajout de rhBMP-2, et que la résistance augmente avec la concentration en FS. L'association à la rhBMP-2 améliore la capacité de rétention d'eau, comme le révèlent les études de gonflement. La viabilité des cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) est supérieure sur les échafaudages conjugués, sans cytotoxicité. L'activité de la phosphatase alcaline (ALP) est plus élevée dans les échafaudages conjugués, in vitro et in vivo, confirmant l'ostéoinductivité accrue. Les échafaudages se révèlent efficaces pour la formation osseuse in vivo.

Contexte

La capacité de régénération osseuse permet la réparation des petites fractures. Cependant, cette capacité est limitée, nécessitant des autogreffes ou allogreffes. L'allogreffe peut provoquer des réactions immunologiques, tandis que l'autogreffe est limitée par la quantité d'os disponible. L'ingénierie tissulaire apparaît comme une alternative prometteuse pour surmonter ces limitations. Des cellules spécialisées (hMSCs, lignée MG63) sont cultivées sur un échafaudage préformé, formant un système greffe. L'échafaudage doit offrir ancrage, niche biochimique, résistance mécanique, ostéoinduction, biorésorption, porosité graduée et biocompatibilité. Les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) induisent la formation osseuse et sont proposées pour l'ingénierie tissulaire osseuse avec la matrice osseuse déminéralisée et les phosphates de calcium. La fibroïne de soie (FS) est un matériau prometteur grâce à ses propriétés mécaniques et biocompatibles remarquables. Aucune étude n'avait encore évalué les bénéfices associatifs des BMP avec des nanofibres de FS par électrofilage.

Nous rapportons ici la fabrication d'échafaudages nanofibreux en FS conjugués à la rhBMP-2, comparés à des échafaudages en FS pure pour élucider l'effet de la conjugaison sur l'ostéoinduction. La viabilité et la prolifération cellulaires ont été mesurées pour établir la puissance de l'échafaudage.

Méthodes

Préparation des solutions aqueuses de FS/BMP2

La FS a été isolée des cocons de Bombyx mori selon un protocole établi avec modifications. Les cocons ont été bouillis dans 100 mL de Na₂CO₃ 0,02 M pendant 20 min, rincés pour éliminer la séricine et la cire. La fibroïne extraite a été dissoute dans du bromure de lithium 9 M à 60 °C pendant 4 h, puis dialysée contre l'eau pendant 4 jours. La concentration finale était de 7 % p/v. Cette solution a été concentrée par dialyse contre du polyéthylène glycol (PEG 10 000 g/mol) à 25 %. Des solutions aqueuses diluées ont été préparées et stockées à 10 °C. La rhBMP-2 lyophilisée a été dissoute dans du PBS (pH 3,8), stérilisée (filtre 0,22 µm) et ajoutée aux solutions de fibroïne sous agitation. La réticulation au glutaraldéhyde a été utilisée pour associer la BMP à la fibroïne. Pour 10 mL de mélange réactionnel, 5 mL de FS 6 % et 5 mL de rhBMP-2 1 % ont été réticulés avec 200 µL de glutaraldéhyde et 40 µL d'HCl 12 N comme agent activateur. Trois solutions ont été préparées : (i) 3 % FS sans rhBMP-2 (FS), (ii) 3 % FS avec 0,5 % rhBMP-2 (FS+rhBMP2), (iii) 12 % FS avec 0,125 % rhBMP-2 (4SF+rhBMP2). Ces solutions ont servi à l'électrofilage.

Fabrication de l'échafaudage par électrofilage

Chaque solution a été chargée dans une seringue en verre de 5 mL avec une aiguille inox (25G, Ø 0,26 mm) connectée à une alimentation 5,5 kV CC. Le débit était maintenu à 0,4 mL/h via une pompe à seringue. Les fibres étaient collectées sur une feuille d'aluminium à 15 cm de l'embout pendant 4 h.

Microscopie électronique à balayage

L'examen morphologique a été réalisé par MEB (Zeiss EVO40) après metallisation or. Le diamètre des fibres a été déterminé en moyennant 10 fibres aléatoires par image.

Propriétés mécaniques

Des essais de compression ont évalué les propriétés mécaniques (Instron 3345). Des fibres de 0,2 mm de diamètre, obtenues par électrofilage prolongé, ont servi à déterminer la résistance à la traction et l'allongement à la rupture à partir des courbes contrainte-déformation à 25 °C et 50 % d'humidité.

Étude de gonflement

Le rapport de gonflement a été mesuré en plongeant chaque formulation dans du PBS (pH 7,4) à 37 °C. Les échantillons étaient pesés à intervalles réguliers jusqu'à l'équilibre. Le rapport de gonflement (%) = (Ws - Wo) / Wo, où Wo = poids sec initial, Ws = poids gonflé à chaque point.

Culture cellulaire

Des hMSCs ont été cultivées dans du DMEM avec 10 % sérum fœtal bovin et 1 % pénicilline à 37 °C, 5 % CO₂ jusqu'à 90 % de confluence. Les cellules ont été trypsinisées, centrifugées et resuspendues. Les échafaudages ont été stérilisés (éthanol, UV 30 min, lavage PBS), puis traités au DMEM avant ensemencement. 20 µL de suspension cellulaire ont été déposés goutte à goutte sur chaque échafaudage et sur un film plastique témoin. Incubation 21 jours avec renouvellement du milieu tous les deux jours.

Test d'adhésion cellulaire

L'adhésion a été évaluée en comptant les cellules non adhérentes après 1, 3 et 6 h. Le milieu a été récupéré et les cellules comptées à l'hémocytomètre. % Adhésion = (Ensemencement initial - cellules non adhérentes) / Ensemencement initial × 100.

Test de cytotoxicité

Le test MTT a mesuré l'effet toxique. Après incubation, les constructifs ont été mis en présence de solution MTT (1 mg/mL dans PBS, dilué 1:10) pendant 4 h. Les cellules viables transforment le MTT en sel de formazan, dissous par DMSO. L'absorbance a été lue à 570 nm.

Test de prolifération cellulaire

Le test de réduction du bleu d'Alamar (AB) a déterminé la prolifération. Les échafaudages ont été incubés avec le colorant dilué dans le DMEM pendant 4 h. La réduction a été mesurée spectrophotométriquement. % Réduction AB = [(εoxλ₂)(Aλ₁) - (εoxλ₁)(Aλ₂) / (εredλ₁)(A'λ₂) - (εredλ₂)(A'λ₁)] × 100.

Dosage de l'ALP

La production d'ALP par les hMSCs dans l'échafaudage a été mesurée selon le protocole du fabricant. Après lavage au PBS stérile (pH 7,4), les échafaudages ont été homogénéisés dans 1 mL de tampon Tris (1 M, pH 8,0) et soniqués 3 min sur glace. 25 µL de lysat ont été incubés avec 1 mL de solution de p-nitrophényl phosphate (16 mM) à 30 °C pendant 5 min. La lecture spectrophotométrique à 405 nm a permis de quantifier le p-nitrophénol produit.

Activité ALP in vivo

Neuf rats athymiques nus mâles (100-120 g) ont été disséqués bilatéralement au niveau des muscles abdominaux pour créer des loges. Un modèle de souris nues a été utilisé pour démontrer le potentiel ostéoinductif in vivo. Un morceau de chaque type d'échafaudage (5×5 mm) a été placé dans chaque loge, refermée par un fil non résorbable. Après 14 jours, les implants ont été récupérés par excision des muscles droits, conservés dans du PBS. Les tissus explantés ont été homogénéisés dans un tampon d'extraction pour libérer l'ALP. 50 µL d'aliquot ont servi au dosage de l'activité ALP.

Analyse statistique

Tous les essais ont été réalisés en triplicat. Les données sont présentées en moyenne ± écart-type. Une ANOVA à un facteur (logiciel Origin 6.0) a évalué les différences significatives (p ≤ 0,05).

Résultats

Morphologie de l'échafaudage

Les images MEB (Fig. 1) révèlent une structure nanofibreuse finement filée. Les diamètres moyens des fibres dans les échafaudages FS et FS+BMP2 sont similaires (100-900 nm), le diamètre dépendant du temps d'électrofilage. Les nanofibres de FS sont uniformes, tandis que la conjugaison à la BMP2 entraîne une non-uniformité du diamètre. La taille des pores apparaît homogène et indépendante de la concentration en fibroïne.

Propriétés mécaniques

Les courbes contrainte-déformation (Fig. 2) montrent que l'ajout de BMP ne modifie pas les propriétés mécaniques de l'échafaudage FS, mais l'augmentation de la concentration en FS améliore les propriétés tensiles, probablement grâce à la formation de liaisons inter-fibres lors de la réticulation. Les fibres de FS à faible concentration n'ont pas une meilleure résistance mécanique que celles à concentration plus élevée.

Étude de gonflement

Les rapports de gonflement en fonction du temps (Fig. 3) montrent un gonflement uniforme initial, atteignant l'équilibre vers 380 min. Les fibres liées à la rhBMP-2 absorbent plus d'eau que les fibres FS seules, suggérant une augmentation des poches hydrophiles due à l'association BMP2. Les fibres FS s'équilibrent à ~70 %, tandis que les fibres contenant BMP2 s'équilibrent à ~81 % d'eau.

Test d'adhésion cellulaire

L'adhésion des cellules à l'échafaudage est requise pour la croissance et l'induction de la différenciation. Les hMSCs adhèrent bien aux échafaudages. L'adhésion aux échafaudages 4SF-BMP2, SF-BMP2 et FS est représentée Fig. 4. L'ajout de BMP2 ne diminue pas la capacité d'adhésion. L'augmentation de la taille des pores (diminution de la concentration en FS) augmente l'adhésion. L'ANOVA différencie significativement les variations aux 3e et 6e heures, mais pas à la 1re heure.

Tests de cytotoxicité et de prolifération cellulaire

La viabilité cellulaire est significativement augmentée dans les échafaudages conjugués à la rhBMP-2, sans effet cytotoxique (Fig. 5). La prolifération cellulaire est bonne dans tous les échafaudages, avec une tendance croissante au fil du temps ; l'échafaudage SF+BMP2 présente la toxicité la plus faible à chaque point. L'ANOVA révèle une différence significative entre les trois formulations.

D'après la Fig. 6, la prolifération cellulaire est examinée. Les cellules prolifèrent bien dans les trois préparations, avec le meilleur résultat pour SF+BMP2 à chaque point. Les pores plus larges dans l'échafaudage SF+BMP2 offrent un espace maximal pour la croissance cellulaire. La significativité des différences entre groupes est établie par ANOVA.

Dosage de l'ALP

L'activité ALP est un marqueur standard de la propriété ostéoinductive de l'environnement cellulaire. Une activité ALP plus élevée est observée dans les constructifs SF+BMP2 comparés aux constructifs FS seuls (Fig. 7). Les échafaudages nanostructurés en FS présentent une ostéoinduction par eux-mêmes, mais l'échafaudage SF+BMP2 s'avère le meilleur. La concentration en ALP augmente au cours du temps, et les constructifs à plus forte concentration en FS présentent une activité ALP plus faible que ceux à concentration plus faible.

Activité ALP in vivo

La Fig. 8 montre l'activité ALP des explants pour (a) FS, (b) SF+rhBMP2, et (c) 4SF+rhBMP2. Comme prévu, les explants des traitements contenant la rhBMP-2 induisent une activité ALP plus élevée, tandis que les échafaudages sans rhBMP-2 produisent une activité plus faible.

Discussion

L'ingénierie tissulaire basée sur les échafaudages a prouvé son potentiel en médecine régénérative. Des études antérieures ont établi le rôle crucial de la microarchitecture et des propriétés physiques dans la traduction des constructions cellule-échafaudage in vitro en tissu osseux. Les propriétés mécaniques optimales (taille des pores, résistance à la traction) et la biocompatibilité sont essentielles pour la colonisation et l'organisation cellulaires. Ce travail décrit la fabrication et la caractérisation d'un échafaudage pour l'ingénierie tissulaire osseuse combinant les propriétés bénéfiques de la FS et de la rhBMP-2. La FS offre une plateforme solide et biocompatible, tandis que la rhBMP-2 incorporée induit la formation de nouveaux ostéocytes. La FS est largement étudiée pour la prolifération des cellules ostéoblastiques et la régénération tissulaire (ligament, tendon, cartilage, os, foie, peau, trachée, cornée, nerf, tympan, vessie).

Des solutions aqueuses de FS et FS+rhBMP2 ont été utilisées, les solvants organiques dégradant la FS. Les fibres électrofilées de FS présentent une structure homogène avec diamètre uniforme, une maille hautement poreuse avec pores interconnectés, conforme à notre étude. Aucune structure en perles n'a été observée. Le diamètre des fibres de FS pures diminue avec l'augmentation du mélange selon la littérature, mais nous n'avons pas observé de perte de diamètre due au mélange. L'uniformité des fibres est perturbée dans les fibres mélangées, possiblement en raison de l'association inégale de la rhBMP-2 sur les fibres de FS.

Une résistance mécanique adéquate est essentielle. Le mélange de FS pure augmente la flexibilité des nanofibres, et des études antérieures révèlent une amélioration similaire des propriétés mécaniques lors du mélange de FS avec d'autres matériaux. Notre échafaudage possède donc la résistance et la flexibilité nécessaires.

Les échafaudages doivent permettre l'adhésion cellulaire, faciliter la prolifération et l'ostéoinduction, et être peu cytotoxiques. Des études antérieures sur les échafaudages FS ont établi leur non-cytotoxicité et leur activité pro-proliférative, nos résultats sont en accord.

Grâce à ses propriétés ostéoinductives, la rhBMP-2 est utilisée en ingénierie tissulaire osseuse. Ces études révèlent que les cellules cultivées sur des échafaudages contenant la BMP2 possèdent une activité ALP plus élevée, biomarqueur de l'ostéoinduction. L'effet de l'association BMP2 est mieux contrasté avec la progression du temps d'incubation. Kim et al. ont utilisé des microsphères poreuses associées à la BMP2 et observé une amélioration similaire de l'ostéoinduction.

Conclusions

Nous avons fabriqué avec succès des échafaudages fibreux à base de FS contenant la rhBMP-2. Ces échafaudages sont homogènes, possèdent des propriétés mécaniques adéquates et une bonne biocompatibilité. L'association à la rhBMP-2 confère un potentiel ostéoinductif. Les échafaudages ont été évalués pour des applications in vivo et se révèlent adaptés à l'ingénierie tissulaire osseuse.

Abréviations

ALP :

Phosphatase alcaline

BTE :

Ingénierie tissulaire osseuse (Bone Tissue Engineering)

hMSCs :

Cellules souches mésenchymateuses humaines

rhBMP2 :

Protéine morphogénétique osseuse recombinante humaine-2

FS :

Fibroïne de soie