Diélectrophorèse modulée en fréquence des vésicules et cellules : trajectoires en U prévisibles à la fréquence de croisement

Résumé

Nous avons dérivé un modèle complet pour la force diélectrophorétique (DEP) exercée sur des particules micro- et nanoscopiques lorsqu'elles sont exposées à des champs électriques modulés en fréquence (MF). En accordant la bande de fréquence de l'onde MF pour englober la fréquence de croisement f_X de la partie réelle du facteur de Clausius-Mossotti, notre théorie prédit une inversion systématique de la force DEP chaque fois que la fréquence instantanée traverse f_X. Expérimentalement, nous avons observé des demi-tours périodiques (U-turns) dans des vésicules multilamellaires (MLV), des cellules de leucémie T humaine (TL), des cellules de leucémie B (BL) et des globules rouges (RB) sous DEP-MF. Le suivi vidéo de ces U-turns fournit une méthode rapide, <30 secondes, et hautement précise pour déterminer f_X, utile pour les suspensions salines et de nanoparticules où le flux de solvant induit par champ électrique est minimisé. L'exactitude de f_X a été confirmée par deux expériences indépendantes : (1) mesure de la force DEP sur une vésicule unique sous DEP alternatif (AC) à diverses fréquences sinusoïdales et comparaison du f_X résultant avec celui obtenu par DEP-MF ; et (2) évaluation de la variation de f_X avec la conductivité du milieu environnant pour trois types cellulaires. La seconde approche a permis l'estimation simultanée des conductivités cytoplasmiques et des capacitances membranaires en utilisant un modèle monocouche affiné. Les conductivités cytoplasmiques étaient légèrement inférieures aux gammes précédemment rapportées, tandis que les capacitances membranaires correspondaient étroitement aux valeurs de la littérature.

Contexte

La polarisabilité cellulaire est dominée par les propriétés électriques de la membrane et du cytoplasme, qui varient avec la fréquence du champ appliqué. Ce spectre diélectrique dépendant de la fréquence permet la discrimination sans étiquette des phénotypes cellulaires via spectroscopie d'impédance, DEP AC, DEP à onde progressive (twDEP) et électrorotation [1–16]. Comparées aux méthodes de marquage par anticorps ou adhésives, ces techniques électriques évitent la modification cellulaire et l'activation potentielle, les rendant attractives pour le tri cellulaire non invasif.

La DEP survient dans un champ électrique non uniforme, générant une force proportionnelle au gradient de l'amplitude du champ et à la partie réelle du facteur de Clausius-Mossotti (CM). Le gradient de phase donne lieu au twDEP ou à l'électrorotation, qui fournissent des informations diélectriques complémentaires. Notre travail étend la DEP AC conventionnelle en introduisant des champs électriques MF, permettant une traversée continue de la fréquence de croisement f_X et permettant une caractérisation diélectrique rapide.

Dans les configurations DEP AC typiques, le champ est appliqué entre des électrodes microfabriquées fixes, limitant la flexibilité spatiale. Les pinces électroniques — où des aiguilles électrodes micromanipulées délivrent le champ — offrent une alternative polyvalente, sans contact. Cependant, les mesures diélectriques nécessitent des temps d'exposition courts (<30 s) pour réduire les effets de flux de solvant, ce qui est difficile avec les systèmes multi-électrodes. La DEP-MF résout cela en modulant la fréquence tout en gardant la géométrie d'électrode constante.

Notre système plug-in (Fig. 1) emploie deux aiguilles électrodes en tungstène, chacune de 0,5 µm de diamètre de pointe, positionnées à 100 µm l'une de l'autre. Les aiguilles sont pilotées par un générateur de forme d'onde arbitraire et un amplificateur de courant, et l'ensemble est monté sur un micromanipulateur patch-clamp sous un microscope inversé. Cette configuration permet une manipulation précise, sans contact, de vésicules ou cellules individuelles au-dessus du substrat.

L'onde MF est définie par E(r,t) = A(r)cos θ(t), avec la phase liée à la fréquence instantanée f(t) par θ̇ = 2πf(t). Nous utilisons une modulation MF à large bande : f(t) = f_c + Δf cos(2πf_m t), où la fréquence de modulation f_m est bien plus petite que la gamme de fréquence porteuse, satisfaisant la condition de limite à large bande (WBL) Δf/f_m ≫ 1.

Méthodes

Matériaux

Les MLV étaient préparées à partir de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC ; Avanti Polar Lipids). Une solution de DOPC 1 mL (20 mM) dans chloroforme/méthanol (2:1 v/v) était séchée sous azote et scellée sous vide >12 h. Le film mince était réhydraté avec de l'eau déionisée et incubé à 25 °C pendant plusieurs heures.

Les lignées cellulaires de leucémie T humaine (JKT-β-del) et leucémie B (CCRF-SB) étaient cultivées en RPMI 1640 supplémenté avec 10 % sérum fœtal bovin et 100 mM pyruvate de sodium à 37 °C, 5 % CO₂. Après 1 semaine, les cellules étaient pelletées (370 g, 3 min, deux fois) et resuspendues dans 1 mL RPMI 1640. Les suspensions étaient ensuite diluées dans du saccharose isotonic 200 mM pour atteindre les conductivités désirées.

Les globules rouges humains étaient isolés du sang total de volontaires sains (début vingtaine). Les cellules étaient suspendues dans un mélange RPMI 1640 hématocrite 3,1 % et diluées avec du saccharose 200 mM. Tous les essais RB étaient effectués dans les 10 min suivant la prise de sang.

Configuration expérimentale

La conductivité des suspensions était mesurée avec un multimètre SevenMulti (Mettler-Toledo). Le champ MF ou AC était généré par un générateur de forme d'onde Agilent 33220A et amplifié par un amplificateur de courant F30PV. Deux aiguilles en tungstène de 0,5 µm, séparées de 100 µm, délivraient le champ. La paire d'aiguilles était positionnée sur 50 µL de suspension sur une plaque chauffée (25 °C). L'imagerie était réalisée avec un microscope Nikon TE2000-U et une caméra CCD Retiga Exi (25 ips). La résolution de fréquence de la forme d'onde MF était vérifiée comme étant dans l'erreur expérimentale.

Les films supplémentaires S1–S3 démontrent la manipulation DEP AC de cellules diatomées dans l'eau déionisée : (S1) rotation à 30 kHz, (S2) poussée vers une paroi de verre à 100 kHz, et (S3) récupération à 20 MHz.

Résultats et discussion

Observation expérimentale d'une cellule leucémique subissant la DEP-MF

Les aiguilles plug-in permettent l'application du champ au-dessus du substrat, facilitant la sélection précise de cellules. Le film S4 montre une cellule diatomée triangulaire répondant à un saut de fréquence 100–500 kHz à intervalles de 0,5 s. Les films S5 et S6 présentent des trajectoires typiques en U-turn de cellules TL sous DEP-MF (modulation 0,25 Hz, 200 kHz ≤ f(t) ≤ 3 MHz). La Fig. 2 affiche une trajectoire 3D (x, y, t) où l'origine correspond à la pointe de l'aiguille. L'axe x s'aligne avec la tangente à la surface de l'électrode ; l'axe y reflète l'amplitude du U-turn.

Les U-turns comprennent trois phases : quitter l'aiguille, approcher après un U-turn, et rester sur la surface de l'électrode. Le flux de solvant empêche souvent le retour exact au même endroit, mais le moment du départ et de l'initiation du U-turn est clair. La période d'U-turn observée (≈4 s) correspond à la période de modulation de 0,25 Hz.

Étude théorique sur la DEP-MF

Pour une particule sphérique avec permittivité interne ε_in et conductivité σ_in et externe ε_out, σ_out, la force DEP est F_DEP(r,t) = p(r,t)·∇E(r,t), avec le moment dipolaire p(r,t) = 4πR³ε_out K_H {E(r,t) + (τ/Δτ) Ẽ(r,t)}, où K_H = (ε_in – ε_out)/(ε_in + 2ε_out), Δτ⁻¹ = τ₀⁻¹ – τ⁻¹, et τ₀ et τ sont les temps caractéristiques définis dans le texte. La moyenne sur un cycle AC donne la force DEP moyenne ⟨F_DEP⟩ = χ(f_AC)∇A_RMS², où χ(f) est proportionnelle à la partie réelle du facteur CM.

En remplaçant le champ AC par une onde MF et en invoquant la WBL, la force DEP moyennée devient ⟨F_DEP(r,t)⟩ = χ{f(t)}∇A_RMS², montrant que la direction de la force change chaque fois que f(t) traverse f_X. Cela explique les U-turns périodiques observés expérimentalement.

La résolution pour l'instant où f(t) = f_X donne f_X = f_c – Δf cos(πf_m Δt_n), où Δt_n est le temps mesuré depuis le départ de l'électrode jusqu'au U-turn. Ainsi, la méthode DEP-MF fournit une détermination rapide de f_X à partir de la trajectoire observée.

Comparaison des fréquences de croisement d'une MLV unique déterminées par DEP-MF et DEP-AC

En utilisant une suspension MLV sans sel, nous avons comparé f_X obtenu par DEP-MF (gamme MF 10–50 kHz, f_m = 0,1 Hz, période 10 s) et DEP-AC (sinusoïde 30–100 kHz). De la trajectoire MF, le temps de départ moyen était de 5,8 ± 0,2 s, donnant f_X = 35 ± 1 kHz. Les mesures de force DEP-AC via une aiguille mobile ont produit une courbe force-fréquence qui s'ajustait au modèle F_DEP(f) = [L + (2πfτ)²H] / [1 + (2πfτ)²], avec paramètres ajustés L = –21,02 pN, H = 19,03 pN, τ = 4,9 µs, donnant f_X = 34,15 kHz, en excellent accord avec le résultat MF.

Dépendances en conductivité des fréquences de croisement pour cellules biologiques

Nous avons appliqué la DEP-MF aux cellules TL, BL et RB dans des gammes de conductivité 60–160 mS m⁻¹ (Δf ≈ 700 kHz, f_m = 0,25 Hz). Pour chaque type cellulaire, nous avons mesuré les temps de départ de 10 cellules par goutte, moyennés sur deux gouttes, et déduit f_X en utilisant l'Éq. (10). La Figure 6 trace le f_X résultant versus σ_out. Les données étaient ajustées au modèle monocouche étendu f_X = [σ_out – (σ_out²)/(2σ_cyt)] / (√2 π R C_m) + f_X0, donnant des capacitances membranaires C_m et conductivités cytoplasmiques σ_cyt qui s'accordent avec les valeurs de la littérature (C_m ≈ 0,5–1,5 µF cm⁻², σ_cyt ≈ 0,3–0,8 S m⁻¹). La cohérence à travers les types cellulaires confirme la fiabilité de la DEP-MF pour la caractérisation diélectrique.

Conclusions

Notre théorie basée sur la WBL et expériences confirment que la DEP-MF produit des U-turns prévisibles à la fréquence de croisement, permettant une détermination rapide, <30 secondes, de f_X. Les mesures DEP-MF des MLV correspondent aux mesures directes de force DEP-AC, tandis que les données f_X dépendantes de la conductivité donnent des capacitances membranaires qui s'alignent avec la littérature. La DEP-MF offre donc une méthode robuste, sans contact, pour la spectroscopie diélectrique de vésicules et cellules, et peut être étendue aux particules sub-microniques et nanoscopiques dans des configurations sur puce pour la spectroscopie électrocinétique en temps réel.

Abréviations

AC:

Courant alternatif

BL:

Leucémie cellule B

CM:

Clausius-Mossotti

DEP:

Diélectrophorèse

DOPC:

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine

FM:

Modulé en fréquence

MLV:

Vésicule multilamellaire

RB:

Globule rouge

RMS:

Racine moyenne carrée

TL:

Leucémie cellule T

twDEP:

Diélectrophorèse à onde progressive

WBL:

Limite à large bande