Aptasenseur fluorescent à oxyde de graphène haute sensibilité pour la détection rapide de cellules leucémiques CCRF-CEM

Résumé

Un aptasenseur fluorescent pratique, peu coûteux et hautement sensible pour la détection de la leucémie a été développé basé sur le complexe oxyde de graphène-aptaamer (GO-apt). L'oxyde de graphène (GO) peut absorber l'aptaamer Sgc8 marqué carboxyfluorescéine (FAM-apt) par empilement π-π et éteindre la fluorescence par transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET). En l'absence de cellules cibles Sgc8 CCRF-CEM, la fluorescence est presque entièrement éteinte. Inversement, lorsque les cellules CCRF-CEM sont ajoutées, la fluorescence éteinte peut être récupérée rapidement et significativement. Par conséquent, basée sur le changement des signaux de fluorescence, nous pouvons détecter le nombre de cellules CCRF-CEM dans une large gamme de 1 × 10² à 1 × 10⁷ cellules/mL avec une limite de détection (LOD) de 10 cellules/mL. Cette stratégie d'aptasenseur fluorescent basé sur l'oxyde de graphène peut être prometteuse pour la détection du cancer.

Contexte

La leucémie est une maladie hématologique maligne agressive et commune, menaçant la survie et la santé des êtres humains, surtout les enfants et adolescents [1, 2]. Elle affecte non seulement les cellules hématopoïétiques normales du corps mais aussi la moelle osseuse, ainsi que le système immunitaire [3,4,5]. Par conséquent, le diagnostic précoce de la leucémie pour le traitement et l'amélioration de la qualité de vie des patients est essentiel. Actuellement, la méthode couramment utilisée pour détecter la leucémie consiste à prélever des cellules sanguines périphériques et de la moelle osseuse, après quoi de nombreux types d'analyses [6] sont effectués, incluant la morphologie cellulaire, la cytologie chimique [7,8,9], l'immunophénotypage [10, 11], l'immunohistochimie [12, 13], et la cytométrie de flux basée sur aptamères [14, 15]. Ces méthodes peuvent détecter les cellules leucémiques, mais elles présentent encore de nombreux inconvénients tels que coût élevé, faible sensibilité et complexité. Il est donc très urgent de trouver une méthode peu coûteuse, hautement sensible et simple pour détecter la leucémie.

Les aptamères, qui sont de courts brins d'ADN simple brin (ssADN) ou d'ARN, ont été criblés par criblage in vitro d'évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) [16, 17]. Basées sur leurs structures tertiaires spéciales, les aptamères ont une affinité de liaison robuste et une haute spécificité avec les cibles, incluant petites molécules organiques, protéines, et même cellules [18,19,20]. De plus, les aptamères ont aussi les caractéristiques d'être facilement synthétisés et modifiés, donc ils sont largement utilisés comme sondes de détection du cancer [21]. Les nanomatériaux fonctionnalisés basés sur aptamères pour la détection du cancer sont aussi des sujets chauds ces dernières années [22, 23], tels que les points quantiques et nanoparticules de silice [24].

L'oxyde de graphène (GO), en tant que nouveau nanomatériau de carbone bidimensionnel planaire, a reçu une attention substantielle en raison de ses propriétés uniques incluant bonne solubilité aqueuse [25], grande surface spécifique, et excellente capacité d'extinction de fluorescence [26, 27]. Basé sur ces propriétés, le GO est considéré comme un excellent récepteur d'énergie dans le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET), ce qui donne au GO une large perspective d'application dans l'aptasenseur fluorescent [28]. De plus, le GO peut se lier aux aptamères par interactions d'empilement π-π, mais pas avec l'ADN double brin ou les complexes aptamère-cible [19, 29, 30]. Donc, le capteur aptamère basé sur le graphène peut améliorer la stabilité de l'aptamère comparé à la sonde aptamère libre [31].

Actuellement, de nombreuses recherches ont rapporté que la stratégie d'aptasenseur fluorescent basé sur l'oxyde de graphène pour la détection de cible est réalisable [21, 32]. Néanmoins, peu d'études ont été menées en utilisant un aptasenseur basé sur GO pour les cellules leucémiques, jusqu'à présent. Ici, nous avons conçu une nouvelle stratégie pour la détection 'turn-on' de cellules leucémiques basée sur GO et l'aptaamer Sgc8 marqué carboxyfluorescéine (FAM-apt). Le GO et l'aptamère étaient utilisés comme quenceur de fluorescence et agent cible, respectivement. En l'absence de cellules leucémiques, le GO peut interagir avec FAM-apt et éteindre presque toute la fluorescence, et le signal de détection s'éteint. Cependant, lorsque les cellules cibles sont présentes, les aptamères ciblent activement les cellules et se détachent du GO, résultant en une récupération de fluorescence dans le système de détection, et le signal de détection s'allume. Par conséquent, la concentration de cellules cibles peut être mesurée correspondamment selon le changement d'intensité de fluorescence.

Méthodes

Réactifs

Le FFAM-apt avec une séquence de 5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3' a été synthétisé par Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Dans ce travail, un tampon Tris-HCl auto-régulant était employé, incluant 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl₂, et 100 mM NaCl. Les aptamères utilisés dans cette expérience étaient dissous par tampon Tris-HCl. La poudre d'oxyde de graphène a été achetée chez Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Nanjing, Chine). Toutes les solutions étaient préparées avec de l'eau ultrapure de 18 MΩ purifiée d'un système de purification Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).

Cellules

CCRF-CEM (lignées cellulaires lymphoblastiques leucémiques aiguës humaines), Ramos (lignées cellulaires lymphome de Burkitt humaines), 293T (lignées cellulaires rein embryonnaire humaines), et H22 (lignées cellulaires carcinome hépatocellulaire murin) étaient achetées à la Banque de Cellules de l'Académie Chinoise des Sciences (Shanghai, Chine). Toutes les lignées cellulaires étaient cultivées à 5% dioxyde de carbone et 37 °C, et le milieu 1640 contenait 10% sérum bovin fœtal (FBS ; HyClone) et 100 U/mL pénicilline-streptomycine (Gibco, Grand Island, NY, USA).

Appareillage

Tous les spectres de fluorescence et intensités de fluorescence étaient mesurés et enregistrés par un spectrophotomètre de fluorescence F-7000 (Hitachi Company, Tokyo, Japon). Une cuvette en quartz de 700 µL était utilisée pour contenir la solution d'échantillon. En raison des longueurs d'onde de pic caractéristiques de la carboxyfluorescéine (FAM), l'intensité de luminescence était surveillée en excitant l'échantillon à 490 nm et mesurant l'émission à 518 nm.

Toutes les images de microscopie à force atomique (AFM) étaient prises par un microscope SPI3800N (Seiko Instruments Industry Co., Tokyo, Japon).

Le potentiel zêta du GO, FAM-apt, et complexe oxyde de graphène-aptaamer (GO-apt) était déterminé par un analyseur de taille de nanoparticules, potentiel zêta, et poids moléculaire absolu (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK).

Les spectres d'absorbance UV-visible du GO, FAM-apt, et GO-apt étaient enregistrés sur NanoDrop 2000 (Thermo, USA).

Préparation de l'aptasenseur fluorescent GO-apt

La poudre d'oxyde de graphène était dissoute et dispersée dans l'eau purifiée Milli-Q puis dispersée par ultrasons pour obtenir une solution noire homogène avec une concentration de 1 mg/mL. En diluant la solution stock par tampon Tris-HCl 20 mM, nous obtenions la concentration de 20 nM FAM-apt. Et après cela, 1 µL FAM-apt (10 µM) et 10 µL solution GO (1 mg/mL) comme préparés étaient mélangés et puis dilués avec tampon Tris-HCl à 500 µL.

Imagerie cellulaire

Les cellules CCRF-CEM et Ramos étaient cultivées pendant 12 h dans des plaques à 6 puits (5 × 10⁵ cellules par puits). Les cellules étaient lavées deux fois avec du tampon phosphate salin (PBS) froid et incubées avec la solution GO-apt à 4 °C dans l'obscurité pendant 30 min. Ensuite, les cellules étaient lavées trois fois et fixées pendant 20 min avec 4% polyoxyméthylène. Les cellules étaient lavées à nouveau avec PBS et colorées avec 4',6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI ; Life Co., USA) pendant 5 min dans l'obscurité. Finalement, les cellules étaient lavées trois fois avec PBS et examinées par microscopie de fluorescence (Nikon DS-Ri1 ; Japon).

Détections de cellules CCRF-CEM

Les cellules CCRF-CEM étaient collectées par centrifugation et suspendues dans 1 mL de PBS. Les différentes concentrations de cellules CCRF-CEM (0 à 1,0 × 10⁷/mL) étaient incubées avec un aptasenseur fluorescent GO-apt à 4 °C dans l'obscurité pendant 30 min. Après incubation, les cellules CCRF-CEM étaient détectées par spectroscopie de fluorescence dans la gamme de longueur d'onde 560–500 nm. La limite de détection (LOD) est estimée basée sur le calcul 3σ / S, où σ est l'écart-type pour la solution GO-apt (n = 10) et S est la pente de l'équation linéaire [33].

Essai de spécificité

Pour investiguer la spécificité de l'aptasenseur fluorescent basé sur GO, nous avons testé le système avec plusieurs cellules différentes, incluant les cellules Ramos, H22 et 293T. Chacun des systèmes de réaction de 100 µL incluait 1 × 10⁶ cellules.

Analyses statistiques

Chaque expérience était répétée trois fois. Les données étaient traitées par le logiciel SigmaPlot 12.5, et les analyses statistiques étaient effectuées en utilisant GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Le seuil de significativité dans toutes les analyses était P < 0,0001.

Résultats et Discussion

Principe de l'aptasenseur fluorescent GO-apt pour la détection de CCRF-CEM

Dans cette étude, le GO et FAM-apt étaient utilisés pour concevoir un aptasenseur fluorescent pour détecter les cellules CCRF-CEM. Le principe du capteur fluorescent pour la détection des cellules CCRF-CEM est montré en Fig. 1. En l'absence de cellules CCRF-CEM, les aptamères modifiés FAM sont adsorbés sur la surface du GO par empilement π-π. Puisque le GO et le fluorophore sont trop proches pour le transfert d'énergie, donc, en tant que quenceur, le GO éteint la fluorescence de FAM. En présence de cellules CCRF-CEM, la force de liaison faible du GO-aptaamer permet à l'aptamère de se détacher de la surface du GO et de se lier aux cellules, causant la restauration de la fluorescence. Par conséquent, le nombre de cellules CCRF-CEM peut être détecté correspondamment selon la récupération de l'intensité de fluorescence FAM.

Illustration schématique de l'aptasenseur fluorescent GO-apt pour la détection de cellules CCRF-CEM

Extinction et récupération de fluorescence

Ce processus continu d'extinction de fluorescence du GO et de retour de fluorescence en présence de cellules CCRF-CEM peut être observé par un spectrophotomètre de fluorescence. Tout le processus de détection basé sur les aptamères de fluorescence GO est montré en Fig. 2a. Le spectre de fluorescence de FAM-apt dans le tampon Tris-HCl 25 nM présente une forte intensité de fluorescence grâce à la présence du FAM (Fig. 2a, courbe a). Cependant, lors de l'ajout de GO, l'intensité de fluorescence était remarquablement réduite (Fig. 2a, courbe b), indiquant que le GO était capable d'éteindre efficacement la fluorescence lorsque GO et les aptamères étaient proches et adsorbés ensemble. Étonnamment, lorsque 5 × 10⁶ cellules CCRF-CEM étaient ajoutées, la fluorescence éteinte pouvait récupérer à temps (Fig. 2a, courbe c). Néanmoins, l'intensité de fluorescence de FAM-apt sans conjugaison GO n'avait pas de changement évident lorsque les cellules CCRF-CEM étaient ajoutées (Fig. 2a, courbe d). CCRF-CEM est une cellule non fluorescente (Fig. 2a, courbe e) ; donc, la récupération de fluorescence est principalement due à la dissociation de l'aptamère de la surface du graphène et l'exposition du groupe fluorescent. Ces expériences d'extinction et récupération de fluorescence illustrent clairement que le complexe CCRF-CEM-aptaamer (CEM-apt) peut empêcher FAM-apt d'être éteint par GO, et CEM a une affinité de liaison plus forte pour son aptamère que GO. Grâce à la différence de structure entre l'aptamère simple brin et le complexe CEM-aptaamer, les aptamères sur la surface du GO peuvent interagir avec CEM et se transformer en complexe CEM-aptaamer. Ce phénomène indique aussi clairement que la liaison du complexe CEM-aptaamer à l'aptamère est plus faible que celle du GO, permettant ainsi à l'aptamère de se détacher de la surface du GO. Puisque le FAM-apt est situé loin de la surface du GO et l'efficacité de transfert d'énergie est réduite, la fluorescence est restaurée. L'analyse statistique des spectres d'émission de fluorescence de l'aptamère Sgc8 marqué FAM et CCRF-CEM a été effectuée à différentes conditions (Fig. 2b).

Faisabilité de la détection de cellules CEM par Go-apt. a Spectres d'émission de fluorescence de FAM-apt et cellules CCRF-CEM à différentes conditions : (a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM-apt + CCFF-CEM, et (e) CCRF-CEM ; FAM-apt (20 nM) ; GO (25 µg/mL) ; CCRF-CEM (1 × 10⁶ cellules). Excitation 490 nm. b Analyse statistique des spectres d'émission de fluorescence de FAM-apt et CCRF-CEM à différentes conditions. NS non significatif. ****P < 0,0001

Caractérisations de l'aptasenseur fluorescent GO-apt

Pour vérifier la conception, du GO uniforme et décentralisé a été obtenu. De la Fig. 3a, nous savons qu'une feuille de GO avec une épaisseur de 1,17 nm possède une apparence bidimensionnelle typique par AFM. Cependant, GO-apt avec une épaisseur de 1,94 nm montrait que FAM-apt a été absorbé sur la surface du GO avec succès. Le potentiel zêta de FAM-apt et GO était de -11,35 et -23,90 mV, respectivement, mais quand GO interagit non-covalentment avec FAM-apt, la valeur absolue du potentiel zêta augmentait (Fig. 3b). Ces résultats indiquaient que les aptasenseurs ont été construits avec succès. De la Fig. 3c, nous savons que GO affichait une forte absorption à 234 nm qui est attribuée aux transitions π-π* des liaisons C=C aromatiques. FAM-apt est caractérisé par des bandes d'absorption de la séquence ADN (260 nm) et FAM (503 nm), alors que l'ajout de GO dans la solution de FAM-apt cause un décalage vers le rouge et l'absorbance de FAM à 503 nm est augmentée. La raison possible est que FAM-apt est adsorbé sur la surface du GO, indiquant des interactions électroniques entre les deux systèmes π du GO et des colorants dans l'état fondamental. Par conséquent, les résultats indiquaient que GO-apt a été construit avec succès.

Caractérisation de GO-apt. a Images AFM de GO et CEM-apt. b Potentiel zêta de surface de FAM-apt, GO, et CEM-apt. Barres d'erreur indiquent ± ET (n = 3). c Spectres d'absorbance UV-visible de (a) GO, (b) FAM-apt, et (c) GO-apt

Microscopie de fluorescence des cellules

Pour visualiser directement la spécificité du FAM-apt détaché se liant au niveau cellulaire, nous avons incubé les cellules CCRF-CEM et Ramos avec Go-apt et les avons analysées par microscopie de fluorescence. Conformément aux expériences spectrales de fluorescence, FAM-apt peut se détacher de Go-apt et se lier aux cellules CCRF-CEM pour coloration fluorescente, mais pas aux cellules Ramos (Fig. 4).

Micrographies de fluorescence de cellules CCRF-CEM et Ramos après mélange avec GO-apt. Noyaux colorés avec DAPI. Barres d'échelle indiquent 25 µm

Optimisation des conditions expérimentales pour la détection de CCRF-CEM

Afin d'obtenir l'excellente performance de l'aptasenseur fluorescent, le temps d'extinction et récupération de fluorescence étaient optimisés. Les comportements cinétiques de FAM-apt et GO, ainsi que FAM-apt en solution GO homogène avec cellules CCRF-CEM, étaient investigués en surveillant l'intensité de fluorescence en fonction du temps d'extinction et récupération (Fig. 5a, b). Comme montré en Fig. 5a, l'extinction de fluorescence de FAM-apt en fonction du temps d'incubation en présence de GO peut être observée. Le FAM-apt s'adsorbe rapidement à la surface du GO et, après cela, subit le transfert d'énergie, et en même temps, l'intensité de fluorescence est significativement réduite et tend à ralentir après 2 min. En contraste, CEM-apt est formé et la libération de la surface du GO est plus lente. L'intensité de fluorescence atteignait un plateau quand le temps d'incubation était supérieur à 30 min (Fig. 5b). Ces expériences temps-dépendantes montrent que GO, en tant que quenceur excellent, éteint rapidement la fluorescence FAM-apt et regagne progressivement la fluorescence en présence de CEM.

Optimisation des conditions expérimentales. a Extinction de fluorescence de FAM-apt (20 nM) dans tampon Tris-HCl par GO en fonction du temps. b Restauration de fluorescence de FAM-apt en solution GO par CCRF-CEM (1 × 10⁶) en fonction du temps. c Effet de la concentration GO sur l'intensité de fluorescence de FAM-apt en l'absence (courbe a) et en présence (courbe b) de 1 × 10⁶ cellules CCRF-CEM. d Le taux d'intensité de fluorescence (F/F₀) de FAM-apt par 1 × 10⁶ cellules CCRF-CEM en fonction de la concentration GO. Excitation 490 nm

Afin de rendre l'aptasenseur fluorescent plus sensible à la détection de CCRF-CEM, le système de réaction utilisé pour optimiser la concentration GO devient indispensable. La Figure 5c, qui illustre clairement notre stratégie, montre l'effet de différentes concentrations de GO sur l'intensité de fluorescence de FAM-apt en l'absence (Fig. 5c, courbe a) et en présence (Fig. 5c, courbe b) de CCRF-CEM. Comme nous l'avons vu de Fig. 5c, lors de l'ajout de GO, le signal de fond de fluorescence est significativement réduit. La Figure 5d montre la fluorescence restaurée de FAM-apt par 1 × 10⁶ cellules CEM en fonction de la concentration GO. De Fig. 5d, nous pouvons trouver que quand la concentration GO est 20 µg/mL, le ratio de F/F₀ (où F₀ et F sont les intensités de fluorescence de FAM à 518 nm en l'absence et présence de CCRF-CEM, respectivement) obtient la valeur la plus haute, qui est 13,0354. Par conséquent, 20 µg/mL était considéré comme la concentration GO optimale.

Détection de CCRF-CEM avec l'aptasenseur fluorescent GO-apt

Afin d'obtenir de bons résultats expérimentaux, les conditions expérimentales optimales étaient utilisées pour détecter CCRF-CEM. La Figure 6a montre qu'avec l'augmentation du nombre de CCRF-CEM de 0 à 1 × 10⁷, l'intensité de fluorescence augmente aussi en conséquence. De plus, le F/F₀ montre une dépendance linéaire claire sur le nombre de CCRF-CEM dans la gamme de 1 × 10²–1 × 10⁷ (Fig. 6b). L'équation de régression linéaire est Y(F/F₀) = 3,2608 × log C − 5,1892 (où C est le nombre de CCRF-CEM) avec le coefficient de régression R² = 0,9922. La limite de détection est considérée comme moins de dix cellules. Par conséquent, la détection par aptasenseur fluorescent basé sur GO a une large gamme de détection et peut être utilisée comme biosenseur idéal pour détecter CCRF-CEM. Comparé aux autres méthodes, cette méthode a une sensibilité plus élevée (Tableau 1) [34,35,36,37,38,39].

Détection de cellules CEM par Go-apt. a Spectres d'émission de fluorescence de l'aptasenseur fluorescent GO-apt en présence de différentes concentrations de cellules CCRF-CEM. b Relation linéaire entre le taux d'intensité de fluorescence (F/F₀) et la concentration de cellules CCRF-CEM

Spécificité de l'aptasenseur fluorescent GO-apt

Pour investiguer la spécificité des adaptateurs fluorescents GO-apt, plusieurs cellules différentes étaient utilisées pour tester le système, telles que cellules Ramos, H22 et 293T. Chacun des systèmes de réaction de 100 µL incluait 1 × 10⁶ cellules. La Figure 7 montre que CCRF-CEM obtient une intensité de fluorescence plus élevée que les autres groupes témoins. Les résultats indiquent aussi clairement que l'aptasenseur fluorescent conçu embrasse une haute spécificité.

Spécificité de l'aptasenseur fluorescent pour CEM. Le taux d'intensité de fluorescence (F/F₀) de l'aptasenseur fluorescent GO-apt en présence de cellules CEM, Ramos, H22 et 293T, respectivement (1 × 10⁶), où F₀ et F sont l'intensité de fluorescence sans et avec cellules de détection à 518 nm. Excitation 490 nm

Conclusions

Nous avons développé un aptasenseur fluorescent pratique, peu coûteux et hautement sensible pour la détection de cellules CCRF-CEM. Cette stratégie utilise astucieusement l'interaction de liaison non-covalente par empilement π-π entre le graphène et l'ADN simple brin et la performance supérieure du graphène pour éteindre la fluorescence. Comparé à l'aptamère, la liaison du complexe CEM-aptaamer au GO est faible, donc la fluorescence éteinte par le graphène peut être progressivement restaurée. Sous conditions optimisées, la limite de détection est considérée comme moins de 100 cellules. Par conséquent, basée sur sa performance excellente, l'aptasenseur fluorescent a une large perspective dans la détection de cellules tumorales.

Historique des modifications

Abréviations

AFM

Microscopie à force atomique

CEM-apt

Complexe CCRF-CEM-aptaamer

FAM-apt

Aptaamer Sgc8 marqué FAM

FRET

Transfert d'énergie de résonance de fluorescence

GO

Oxyde de graphène

GO-apt

Complexe oxyde de graphène-aptaamer

PBS

Tampon phosphate salin