Un aptacapteur fluorescent à base d'oxyde de graphène pour la détection d'activation de CCRF-CEM

Contexte

La leucémie est une maladie hématologique maligne agressive et courante, qui constitue une menace pour la survie des êtres humains et la santé, en particulier pour les enfants et les adolescents [1, 2]. Elle affecte non seulement les cellules hématopoïétiques normales du corps, mais aussi la moelle osseuse, ainsi que le système immunitaire [3,4,5]. Par conséquent, le diagnostic précoce de la leucémie pour le traitement et l'amélioration de la qualité de vie des patients est essentiel. À l'heure actuelle, la méthode couramment utilisée pour détecter la leucémie consiste à prélever des cellules du sang périphérique et de la moelle osseuse, après de nombreux types d'analyses [6], notamment la morphologie cellulaire, la cytochimie [7,8,9], l'immunophénotype [10, 11], l'immunohistochimie [12, 13], et une cytométrie en flux basée sur les aptamères [14, 15], ont été réalisées. Ces méthodes peuvent détecter les cellules leucémiques, mais elles présentent encore de nombreux inconvénients tels qu'un coût élevé, une faible sensibilité et une complexité. Par conséquent, il est très urgent de trouver une méthode peu coûteuse, très sensible et simple pour détecter la leucémie.

Les aptamères, qui sont de l'ADN simple brin court (ADNsb) ou ARN, ont été criblés par criblage in vitro de l'évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) [16, 17]. Sur la base des structures tertiaires spéciales, les aptamères ont une affinité de liaison robuste et une spécificité élevée avec des cibles, y compris de petites molécules organiques, des protéines et même des cellules [18,19,20]. De plus, les aptamères ont également la particularité d'être facilement synthétisés et modifiés de sorte qu'ils sont largement utilisés comme sondes de détection du cancer [21]. Les nanomatériaux fonctionnalisés à base d'aptamères pour la détection du cancer sont également des points chauds ces dernières années [22, 23], comme les points quantiques et les nanoparticules de silice [24].

L'oxyde de graphène (GO), en tant que nouveau nanomatériau de carbone planaire bidimensionnel, a reçu une attention considérable en raison de ses propriétés uniques, notamment une bonne solubilité aqueuse [25], une grande surface spécifique et une excellente capacité d'extinction de fluorescence [26, 27]. Sur la base de ces propriétés, GO est considéré comme un excellent récepteur d'énergie dans le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET), ce qui fait que GO a une large perspective d'application dans l'aptacapteur de fluorescence [28]. De plus, GO peut se lier aux aptamères par π -π interactions d'empilement, mais pas avec l'ADN double brin ou les complexes aptamère-cible [19, 29, 30]. Par conséquent, le capteur d'aptamère à base de graphène peut améliorer la stabilité de l'aptamère par rapport à la sonde d'aptamère libre [31].

À l'heure actuelle, de nombreuses recherches ont rapporté que la stratégie de l'aptacapteur fluorescent à base d'oxyde de graphène pour la cible de détection est réalisable [21, 32]. Néanmoins, jusqu'à présent, peu d'études ont été menées à l'aide d'un aptacapteur à base de GO pour les cellules leucémiques. Ici, nous avons conçu une nouvelle stratégie pour la détection de signal « activation » des cellules leucémiques basée sur GO et l'aptamère Sgc8 marqué à la carboxyfluorescéine (FAM-apt). Le GO et l'aptamère ont été utilisés comme extincteur de fluorescence et agent cible, respectivement. En l'absence de cellules leucémiques, GO peut interagir avec FAM-apt et éteint presque toute la fluorescence, et le signal de détection est désactivé. Cependant, lorsque les cellules cibles sont présentes, les aptamères ciblent activement les cellules et tombent de GO, entraînant une récupération de fluorescence dans le système de détection et le signal de détection activé. Par conséquent, la concentration de cellules cibles peut être mesurée de manière correspondante en fonction du changement d'intensité de fluorescence.

Méthodes

Réactifs

Le FFAM-apt avec une séquence de 5'-FAM-AT CTAACTGCTGGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3' a été synthétisé par Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Dans ce travail, un tampon Tris-HCl autorégulant a été utilisé, y compris 20 mM de Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM de MgCl₂ , et 100 mM de NaCl. Les aptamères utilisés dans cette expérience ont été dissous par du tampon Tris-HCl. La poudre d'oxyde de graphène a été achetée auprès de Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Nanjing, Chine). Toutes les solutions ont été préparées avec de l'eau ultrapure de 18 MΩ purifiée à partir d'un système de purification Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).

Cellules

Les lignées cellulaires CCRF-CEM (lignées cellulaires de lymphoblaste leucémique leucémique humain), Ramos (lignées cellulaires de lymphome de Burkitt humain), 293T (lignées cellulaires de rein embryonnaire humain) et H22 (lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire murin) ont été achetées auprès de la Cell Bank of the Chinese Académie des sciences (Shanghai, Chine). Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 °C, et le milieu de 1640 contient 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; HyClone) et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine (Gibco, Grand Island, NY, États-Unis).

Appareil

Tous les spectres de fluorescence et l'intensité de fluorescence ont été mesurés et enregistrés par un spectrophotomètre à fluorescence F-7000 (Hitachi Company, Tokyo, Japon). Une cuvette en quartz de 700 μL a été utilisée pour contenir la solution échantillon. En raison des longueurs d'onde de pic caractéristiques de la carboxylfluorescéine (FAM), l'intensité de la luminescence a été surveillée en excitant l'échantillon à 490 nm et en mesurant l'émission à 518 nm.

Toutes les images de microscopie à force atomique (AFM) ont été prises par un microscope SPI3800N (Seiko Instruments Industry Co., Tokyo, Japon).

Le potentiel zêta du complexe GO, FAM-apt et oxyde de graphène-aptamère (GO-apt) a été déterminé par un analyseur de la taille des nanoparticules, du potentiel zêta et du poids moléculaire absolu (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Royaume-Uni).

Les spectres d'absorbance UV-visible de GO, FAM-apt et GO-apt ont été enregistrés sur NanoDrop 2000 (Thermo, USA).

Préparation de l'Aptasensor Fluorescent GO-apt

La poudre d'oxyde de graphène a été dissoute et dispersée dans de l'eau purifiée Milli-Q puis dispersée par ultrasons pour obtenir une solution noire homogène avec la concentration de 1 mg/mL. En diluant la solution mère par 20 mM de tampon Tris-HCl, nous avons obtenu la concentration de 20 nM de FAM-apt. Et après cela, 1 μL de FAM-apt (10 μM) et 10 μL de solution GO (1 mg/mL) telles que préparées ont été mélangés puis dilués avec du tampon Tris-HCl à 500 μL.

Imagerie cellulaire

Les cellules CCRF-CEM et Ramos ont été cultivées pendant 12 h dans des plaques à six puits (5 × 10 ⁵ cellules par puits). Les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) et incubées avec une solution GO-apt à 4 °C dans l'obscurité pendant 30 min. Ensuite, les cellules ont été lavées trois fois et fixées pendant 20 minutes avec du polyoxyméthylène à 4 %. Les cellules ont été à nouveau lavées avec du PBS et colorées avec du dichlorhydrate de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; Life Co., USA) pendant 5 minutes dans l'obscurité. Enfin, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et examinées par microscopie à fluorescence (Nikon DS-Ri1 ; Japon).

Détections de cellules CCRF-CEM

Les cellules CCRF-CEM ont été collectées par centrifugation et mises en suspension dans 1 mL de PBS. Les différentes concentrations de cellules CCRF-CEM (0 à 1.0 × 10 ⁷ /mL) ont été incubés avec un aptacapteur fluorescent GO-apt à 4 °C dans l'obscurité pendant 30 min. Après incubation, les cellules CCRF-CEM ont été détectées par spectroscopie de fluorescence dans la gamme de longueurs d'onde de 560 à 500 nm. La limite de détection (LOD) est estimée sur la base des 3σ / S calcul, où σ est l'écart type pour la solution GO-apt (n = 10) et S est la pente de l'équation linéaire [33].

Dosage de spécificité

Pour étudier la spécificité de l'aptasensor fluorescent à base de GO, nous avons testé le système avec plusieurs cellules différentes, notamment des cellules Ramos, des cellules H22 et des cellules 293T. Chacun des systèmes de réaction de 100 μL comprenait 1 × 10 ⁶ cellules.

Analyses statistiques

Chaque expérience a été répétée trois fois. Les données ont été traitées par le logiciel SigmaPlot 12.5, et des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Le seuil de signification dans toutes les analyses était P < 0,0001.

Résultats et discussion

Principe du capteur fluorescent GO-apt pour la détection de CCRF-CEM

Dans cette étude, GO et FAM-apt ont été utilisés pour concevoir un aptacapteur fluorescent pour détecter les cellules CCRF-CEM. Le principe du capteur fluorescent pour la détection des cellules CCRF-CEM est illustré à la Fig. 1. En l'absence de cellules CCRF-CEM, les aptamères modifiés par FAM sont adsorbés sur la surface GO par π -π empilement. Puisque GO et le fluorophore sont trop proches du transfert d'énergie, donc, en tant qu'extincteur, GO éteint la fluorescence de FAM. En présence de cellules CCRF-CEM, la faible force de liaison de l'aptamère GO permet à l'aptamère de tomber de la surface GO et de se lier aux cellules, provoquant la restauration de la fluorescence. Par conséquent, le nombre de cellules CCRF-CEM peut être détecté de manière correspondante en fonction de la récupération de l'intensité de fluorescence FAM.

Illustration schématique de l'aptacapteur fluorescent GO-apt pour la détection des cellules CCRF-CEM

Extinction et récupération de la fluorescence

Ce processus continu d'extinction de la fluorescence de GO et de retour de la fluorescence en présence de cellules CCRF-CEM peut être observé par un spectrophotomètre à fluorescence. L'ensemble du processus de détection basé sur les aptamères à fluorescence GO est illustré à la figure 2a. Le spectre de fluorescence du FAM-apt en tampon Tris-HCl 25 nM présente une forte intensité de fluorescence grâce à la présence du FAM (Fig. 2a, courbe a). Cependant, lors de l'ajout de GO, l'intensité de fluorescence était remarquablement réduite (Fig. 2a, courbe b), indiquant que GO était capable d'éteindre efficacement la fluorescence lorsque GO et les aptamères étaient proches les uns des autres et adsorbés ensemble. Étonnamment, lorsque 5 × 10 ⁶ Des cellules CCRF-CEM ont été ajoutées, la fluorescence éteinte a pu récupérer dans le temps (Fig. 2a, courbe c). Néanmoins, l'intensité de fluorescence de FAM-apt sans conjugaison GO n'a pas de changement évident lorsque les cellules CCRF-CEM ont été ajoutées (Fig. 2a, courbe d). CCRF-CEM est une cellule non fluorescente (Fig. 2a, courbe e) ; par conséquent, la récupération de la fluorescence est principalement due à la dissociation de l'aptamère de la surface du graphène et à l'exposition du groupe fluorescent. Ces expériences d'extinction et de récupération de fluorescence ont clairement illustré que le complexe CCRF-CEM-aptamère (CEM-apt) peut empêcher FAM-apt d'être éteint par GO, et que CEM a une affinité de liaison plus forte avec son aptamère que GO. Grâce à la différence de structure entre l'aptamère simple brin et le complexe CEM-aptamère, les aptamères sur la surface GO peuvent interagir avec le CEM puis se transformer en complexe CEM-aptamère. Ce phénomène indique également clairement que la liaison du complexe CEM-aptamère à l'aptamère est plus faible que celle de GO, permettant ainsi à l'aptamère de tomber de la surface de GO. Étant donné que le FAM-apt est situé loin de la surface GO et que l'efficacité du transfert d'énergie est réduite, la fluorescence est restaurée. L'analyse statistique des spectres d'émission de fluorescence de l'aptamère Sgc8 marqué au FAM et du CCRF-CEM a été réalisée dans différentes conditions (Fig. 2b).

Faisabilité de la détection Go-apt des cellules CEM. un Spectres d'émission de fluorescence des cellules FAM-apt et CCRF-CEM dans différentes conditions :(a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM- apt + CCFF-CEM, et (e) CCRF-CEM ; FAM-apt (20 nM) ; GO (25 μg/mL) ; CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ cellules). Excitation 490 nm. b Analyse statistique des spectres d'émission de fluorescence de FAM-apt et CCRF-CEM à différentes conditions. NS non significatif. ****P < 0,0001

Caractérisations de l'Aptasensor fluorescent GO-apt

Pour vérifier la conception, un GO uniforme et décentralisé a été obtenu. D'après la figure 3a, nous savons qu'une feuille GO d'une épaisseur de 1,17 nm possède un aspect bidimensionnel typique selon l'AFM. Cependant, le GO-apt avec une épaisseur de 1,94 nm a montré que le FAM-apt avait été absorbé avec succès par la surface du GO. Le potentiel zêta de FAM-apt et GO était de − 11,35 et − 23,90 mV, respectivement, mais lorsque GO interagit de manière non convalente avec FAM-apt, la valeur absolue du potentiel zêta a augmenté (Fig. 3b). Ces résultats ont indiqué que les aptacapteurs ont été construits avec succès. D'après la figure 3c, nous savons que GO a affiché une forte absorption à 234 nm qui est attribuée au π -π * transitions des liaisons aromatiques C=C. FAM-apt est caractérisé par des bandes d'absorption de la séquence d'ADN (260 nm) et FAM (503 nm), tandis que l'ajout de GO dans la solution de FAM-apt provoque un décalage vers le rouge et l'absorbance de FAM à 503 nm est augmentée. La raison possible est que FAM-apt est adsorbé sur la surface GO, indiquant des interactions électroniques entre les deux π systèmes de GO et les colorants à l'état fondamental. Par conséquent, les résultats ont indiqué que GO-apt a été construit avec succès.

Caractérisation de GO-apt. un Images AFM de GO et CEM-apt. b Potentiel zêta de surface de FAM-apt, GO et CEM-apt. Les barres d'erreur indiquent ± SD (n = 3). c Spectres d'absorbance UV-visible de (a) GO, (b) FAM-apt et (c) GO-apt

Microscopie à fluorescence des cellules

Pour visualiser directement la spécificité de la liaison FAM-apt tombée au niveau cellulaire, nous avons incubé des cellules CCRF-CEM et Ramos avec Go-apt, puis les avons analysées par microscopie à fluorescence. Conformément aux expériences spectrales de fluorescence, FAM-apt peut tomber de Go-apt, puis se lier aux cellules CCRF-CEM pour une coloration fluorescente, mais pas aux cellules Ramos (Fig. 4).

Micrographies à fluorescence de cellules CCRF-CEM et Ramos après mélange avec GO-apt. Les noyaux ont été colorés au DAPI. Les barres d'échelle indiquent 25 μm

Optimisation des conditions expérimentales pour la détection de CCRF-CEM

Afin d'obtenir les excellentes performances de l'aptacapteur fluorescent, le temps d'extinction et de récupération de la fluorescence a été optimisé. Les comportements cinétiques du FAM-apt et du GO, ainsi que du FAM-apt dans une solution homogène de GO avec des cellules CCRF-CEM, ont été étudiés en surveillant l'intensité de fluorescence en fonction du temps d'extinction et de récupération (Fig. 5a, b). Comme le montre la figure 5a, l'extinction de la fluorescence de FAM-apt en fonction du temps d'incubation en présence de GO peut être observée. Le FAM-apt s'adsorbe rapidement à la surface du GO et, après cela, subit un transfert d'énergie, et en même temps, l'intensité de fluorescence est considérablement réduite et a tendance à ralentir après 2 min. En revanche, CEM-apt est formé et la libération de la surface GO est plus lente. L'intensité de fluorescence a atteint une plate-forme lorsque le temps d'incubation était supérieur à 30 min (Fig. 5b). Ces expériences dépendantes du temps montrent que GO, en tant qu'excellent extincteur, éteint rapidement la fluorescence FAM-apt et regagne progressivement la fluorescence en présence de CEM.

Optimisation des conditions expérimentales. un Trempe de fluorescence du FAM-apt (20 nM) dans du tampon Tris-HCl par GO en fonction du temps. b Restauration de fluorescence de FAM-apt en solution GO par CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ ) en fonction du temps. c Effet de la concentration de GO sur l'intensité de fluorescence de FAM-apt en l'absence (courbe a) et en présence (courbe b) de 1 × 10 ⁶ Cellules CCRF-CEM. d Le taux d'intensité de fluorescence (F /F ₀ ) de FAM-apt par 1 × 10 ⁶ Cellules CCRF-CEM en fonction de la concentration en GO. Excitation 490 nm

Afin de rendre l'aptacapteur fluorescent plus sensible à la détection de CCRF-CEM, le système réactionnel utilisé pour optimiser la concentration en GO devient indispensable. La figure 5c, qui illustre clairement notre stratégie, montre l'effet de différentes concentrations de GO sur l'intensité de fluorescence de FAM-apt en l'absence (Fig. 5c, courbe a) et en présence (Fig. 5c, courbe b) de CCRF -CEM. Comme nous l'avons vu sur la figure 5c, lors de l'ajout de GO, le fond du signal de fluorescence est considérablement réduit. La figure 5d montre la fluorescence restaurée du FAM-apt de 1 × 10 ⁶ Cellules CEM en fonction de la concentration en GO. D'après la figure 5d, nous pouvons constater que lorsque la concentration en GO est de 20 μg/mL, le rapport de F /F ₀ (où F ₀ et F sont les intensités de fluorescence de FAM à 518 nm en l'absence et en présence de CCRF-CEM, respectivement) obtient la valeur la plus élevée, qui est de 13,0354. Par conséquent, 20 μg/mL ont été considérés comme la concentration optimale en GO.

Détection CCRF-CEM avec capteur fluorescent GO-apt

Afin d'obtenir de bons résultats expérimentaux, des conditions expérimentales optimales ont été utilisées pour détecter CCRF-CEM. La figure 6a montre qu'avec l'augmentation du nombre de CCRF-CEM de 0 à 1 × 10 ⁷ , l'intensité de fluorescence est également augmentée en conséquence. De plus, le F /F ₀ montre une dépendance linéaire claire sur le nombre de CCRF-CEM dans la gamme de 1 × 10 ² –1 × 10 ⁷ (Fig. 6b). L'équation de régression linéaire est Y (F /F ₀ ) = 3.2608 × log C - 5.1892 (où C est le nombre de CCRF-CEM) avec le coefficient de régression R ² = 0.9922. La limite de détection est considérée comme inférieure à dix cellules. Par conséquent, la détection d'aptamère par fluorescence basée sur GO a une large plage de détection qui peut être utilisée comme biocapteur idéal pour détecter CCRF-CEM. Par rapport aux autres méthodes, cette méthode a une sensibilité plus élevée (tableau 1) [34,35,36,37,38,39].

Détection optimale des cellules CEM. un Spectres d'émission de fluorescence de l'aptacapteur fluorescent GO-apt en présence de différentes concentrations de cellules CCRF-CEM. b Relation linéaire entre le taux d'intensité de fluorescence (F /F ₀ ) et la concentration des cellules CCRF-CEM

Spécificité de l'Aptasensor Fluorescent GO-apt

Pour étudier la spécificité des adaptateurs fluorescents GO-apt, plusieurs cellules différentes ont été utilisées pour tester le système, telles que les cellules Ramos, les cellules H22 et les cellules 293T. Chacun des systèmes de réaction de 100 μL comprenait 1 × 10 ⁶ cellules. La figure 7 montre que CCRF-CEM obtient une intensité de fluorescence plus élevée que les autres groupes de contrôle. Les résultats ont également clairement indiqué que l'aptacapteur fluorescent conçu était très spécifique.

Spécificité de l'aptacapteur fluorescent pour CEM. Le taux d'intensité de fluorescence (F /F ₀ ) d'un aptasensor fluorescent GO-apt en présence de cellules CEM, de cellules Ramos, de cellules H22 et de cellules 293T, respectivement (1 × 10 ⁶ ), où F ₀ et F sont l'intensité de fluorescence sans et avec les cellules de détection à 518 nm. Excitation 490 nm

Conclusions

Nous avons développé un aptacapteur fluorescent pratique, peu coûteux et très sensible pour la détection des cellules CCRF-CEM. Cette stratégie utilise intelligemment l'interaction de liaison non covalente par le π -π l'empilement entre le graphène et l'ADN simple brin et les performances supérieures de la fluorescence par extinction du graphène. Par rapport à l'aptamère, la liaison du complexe CEM-aptamère à GO est faible, de sorte que la fluorescence désactivée par le graphène peut être progressivement restaurée. Dans des conditions optimisées, la limite de détection est considérée comme inférieure à 100 cellules. Par conséquent, sur la base de ses excellentes performances, l'aptacapteur fluorescent a une large perspective dans la détection des cellules tumorales.

Historique des modifications

Abréviations

AFM :

Microscopie à force atomique

CEM-apt :

Complexe CCRF-CEM-aptamère

FAM-apt :

Aptamère Sgc8 labellisé FAM

FRET :

Transfert d'énergie par résonance de fluorescence

GO :

Oxyde de graphène

GO-apt :

Complexe oxyde de graphène-aptamère

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate