Détection avancée du miRNA-335-5p par électrodes interdigitées pour évaluer la sévérité de l'anévrisme de l'aorte abdominale

Résumé

L'anévrisme de l'aorte abdominale (AAA) correspond à l'élargissement de la portion inférieure de l'aorte abdominale ; l'identification d'un outil de détection précoce est urgente pour le diagnostic. Dans cette étude, une surface de détection à électrodes interdigitées (IDE) a été utilisée pour identifier le miRNA-335-5p, qui reflète la formation des AAA. L'uniformité du matériau silice a été observée par profilométrie 3D, et la surface chimiquement modifiée hautement conductrice a amélioré la détection via le mode I-V. Le miRNA-335-5p ciblé a été détecté de manière dose-dépendante ; sur la base de la régression linéaire et des analyses 3σ, la sensibilité a été déterminée à 1 fM avec une sonde biotinylée. La haute spécificité a été démontrée en discriminant la séquence cible des séquences non complémentaires et à un ou trois mésappariements. Ces résultats démontrent la détection haute performance du miRNA-335-5p avec une bonne reproductibilité pour déterminer la sévérité de l'AAA.

Introduction

Les anévrismes de l'aorte abdominale (AAA) sont des maladies mortelles définies par un diamètre de l'aorte abdominale > 3 cm ou supérieur à la normale. Cette pathologie survient avec l'athérosclérose ou l'accumulation de plaque, affaiblissant la paroi de l'aorte et provoquant une saillie vers l'extérieur, semblable à un ballon. Avec le temps, la paroi artérielle s'élargit, comparable au vieillissement des tuyaux d'arrosage. La pression du sang pompé à travers l'aorte fait saillir cette zone affaiblie, formant un anévrisme. L'AAA se forme lorsque la portion affaiblie entraîne des complications. La rupture d'anévrismes même petits peut causer la mort. Actuellement, les examens physiques, angiographies par tomodensitométrie, IRM et échographies sont utilisés pour le diagnostic. Cependant, il n'existe pas de méthodes de détection spécifiques pour l'AAA, qui est souvent identifié incidentellement lors d'autres examens. Ce retard entraîne des problèmes de santé inutiles. Pour y remédier, les chercheurs doivent développer des méthodes de détection précoce, et une stratégie potentielle est le développement d'un système de détection.

La détection précoce, rapide et sensible des maladies de manière quantitative est un objectif vital pour le diagnostic clinique. Les plateformes de biosensing actuelles répondent à plusieurs exigences mais nécessitent des réglages de laboratoire et une formation appropriés. Ainsi, la plupart ne sont pas portables, ce qui est requis pour une détection idéale au point de soin. De plus, pour aider les médecins à prendre des décisions précises et rapides, une analyse des variations des niveaux de biomarqueurs est hautement souhaitable. Les biomarqueurs circulants exprimés dans des zones spécifiques devraient être étudiés pour diagnostiquer l'AAA et suivre l'évolution du traitement. L'identification de ces biomarqueurs aidera au diagnostic et au suivi des patients après traitement. Pour répondre à ces besoins, cette étude propose de générer des capteurs pour les biomarqueurs appropriés de l'AAA. Le capteur (électrode interdigitée) proposé a le potentiel d'une analyse haute performance avec une large gamme de biomarqueurs. C'est un système di-électrode avec des espaces et des doigts alternés fonctionnant sous mesures diélectriques.

Les biomarqueurs peuvent être toute biomolécule : ADN, ARN, protéines, glucides, lipides et leurs formes modifiées. Les chercheurs ont proposé que différents biomarqueurs, comme les ARN non codants, sont exprimés dans le système cellulaire mais ne sont pas traduits en protéines. Les ARN non codants ont généralement de courtes séquences. Différentes classes (microARN, ARN ribosomiaux, ARN de transfert, etc.) ont été rapportées. Les miARN fonctionnent principalement dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle de l'expression génique, entraînant souvent le silencement des gènes. Récemment, l'importance des miARN pour la prédiction de l'AAA a été décrite, avec une réduction de l'expression du miRNA-335-5p chez les patients AAA. La combinaison de facteurs cliniques et de l'expression des microARN améliore drastiquement la prédiction et la précision. Les chercheurs se sont concentrés sur le miRNA-335-5p, qui affiche une plage significativement minimale chez les individus à AAA à croissance rapide. Une diminution du taux de miRNA-335-5p renforce la confiance dans la détection de l'AAA croissant. En d'autres termes, une sortie négative (taux plus élevés) de miR-335-5p indique la sévérité de l'AAA et minimise le dépistage laborieux. Cette découverte a été démontrée par Wanhainen et al. et révèle que les miARN sont des biomarqueurs utiles pour le dépistage de l'AAA et l'élimination du risque d'AAA à croissance rapide. L'étude actuelle démontre l'application de la détection du miRNA-335-5p par un capteur à électrodes interdigitées (IDE) pour déterminer la sévérité de l'AAA chez les individus affectés.

Matériaux et méthodes

Réactifs et biomolécules

Streptavidine, 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI), solution tampon phosphate (PBS) de Sigma-Aldrich, USA. Éthanolamine de Fisher Scientific, UK. Tous les oligonucléotides ont été synthétisés commercialement par Apical Scientific Sdn. Bhd., Malaisie.

Conception du masque sur chrome

Le motif du capteur diélectrique a été conçu avec AutoCAD. Dimensions souhaitées : longueur 7500 µm, largeur 4100 µm, 20 paires doigt-espace, taille d'espace 85 µm, taille d'électrode 100 µm, épaisseur d'électrode 40 nm, longueur de doigt 4000 µm. Le motif a été imprimé sur un photomasque vierge et collé sur le verre chromé. Ce verre a été fixé sous un système d'exposition UV pour le transfert de motif. Un substrat dioxyde de silicium déposé avec une fine couche d'aluminium a été placé en face opposée au verre chromé et exposé à la lumière UV pendant 10 s. Le motif a été transféré suivi du développement avec le révélateur de résist.

Fabrication de l'électrode interdigitée

L'électrode de surface a été produite par un procédé microélectronique conventionnel : (i) wafer 4 pouces avec oxyde natif ; (ii) nettoyage par gravure oxyde tamponnée (BOE) et solution piranha ; (iii) croissance d'une couche d'oxyde 2800 Å par oxydation thermique humide 1 h à 1000 °C ; (iv) division du wafer en quatre ; (v) dépôt de couche métallique avec couche d'adhésion pour la couche conductrice ; couche d'aluminium (40 nm) par évaporation thermique ; (vi) dépôt de photorésist positif par centrifugation ; (vii) pré-cuisson 90 °C 60 s ; (viii) alignement avec masque chrome et exposition UV 10 s ; (ix) rinçage dans révélateur RD6 15 s pour éliminer les zones non exposées, formant le motif IDE avec oxyde ; (x) cuisson dure 90 °C 120 s ; (xi) gravure à l'eau régale pour éliminer les zones exposées des deux couches ; (xii) motif de surface produit, photorésist restant lavé à l'acétone. Puis analyse par profilométrie 3D nanoprofilométrie (Hawk 3D-profilometry, USA) pour observer l'image nette des espaces entre électrodes. Mesures de courant (A) par Keithley 6487 avec balayage linéaire 0–2 V par pas de 0,1 V (20 s).

Fonctionnalisation chimique de surface : stratégie streptavidine-biotine tétravalente

La surface silice a été lavée avec 1 M KOH (pH 9,0) pour l'activer. Modifiée par CDI (0,5 M) 1 h, puis réaction avec 100 nM streptavidine (1 h), diluée du stock dans 10 mM PBS (pH 7,4). Les espaces non réactifs ont été bloqués avec 1 M éthanolamine (1 h). Ensuite, la streptavidine tétravalente a réagi avec 1 µM de sonde miRNA-335-5p biotinylée (10 min) à température ambiante. Après chaque modification, la surface a été lavée au PBS.

Conception des séquences sonde et cible à partir du miRNA-335-5p

Le miRNA-335-5p complet (5′-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3′), code d'accès MIMAT0000765, a été récupéré. La région cible pour cette étude : 5′-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3′. La sonde pour capturer cette région : 5′-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3′. À l'extrémité 3′, la biotine a été taguée pour interagir avec la streptavidine immobilisée. La structure secondaire du miRNA-335-5p complet a été prédite par le logiciel mfold en ligne.

Interactions sonde-cible : séquences miRNA-335-5p

Après fixation de la sonde biotinylée sur la surface streptavidine, la séquence cible miRNA-335-5p a interagi (10 min) à température ambiante, de bas femtomolaire à bas nanomolaire (1 fM à 1 nM, dilutions sérielles 10x en PBS). Les attaches ont été testées indépendamment des concentrations faibles aux fortes, et après formation du duplex, la surface a été lavée avec 5 volumes de PBS, puis mesurée.

Mesures I-V

Les caractérisations électriques ont été effectuées par mesures I-V avec un picoampèremètre Keithley 6487 avec alimentation tension/courant. Les mesures ont été enregistrées aux tensions mentionnées sur la surface nue puis après chaque modification chimique. De même, pour l'analyse interactive entre sonde et cible à chaque concentration, la mesure a été réalisée après lavage avec 10 volumes de réaction. Toutes les modifications, interactions et mesures ont été maintenues en conditions humides.

Résultats et discussion

Fabrication du capteur IDE et analyse de surface

L'étude utilise le miRNA-335-5p comme outil pour élucider la sévérité de l'AAA par analyse interactive sur un capteur IDE (Fig. 1). Pour l'analyse interactive avec la sonde et la cible conçues à partir du miRNA-335-5p complet, une surface IDE a été conçue et fabriquée par techniques photolithographiques conventionnelles. Des modifications de surface étape par étape ont été réalisées et mesurées par ampèremètre (Fig. 2b, c). L'alignement du masque pour la fabrication de l'IDE et l'uniformité ont été confirmés par analyse nanoprofilométrique 3D haute résolution. Cette observation confirme que la fabrication et la distance entre chaque doigt sont bien alignées (Fig. 2d). Les IDE ont une taille d'électrode ~100 µm avec espacement ~85 µm, formant un grand réseau intercalé avec des millions de biomarqueurs en série/parallèle. Pour assurer le succès des IDE fabriqués, nous avons utilisé différents dispositifs nus pour déterminer la reproductibilité sous le système diélectrique. Ce système mesure les vibrations moléculaires entre les di-électrodes causées par le moment dipolaire (Fig. 2c). Cet IDE diélectrique est un système bien accepté, largement utilisé pour différentes analyses biomoléculaires et chimiques. Dans cette étude, toutes les modifications chimiques de surface et analyses interactives ont été mesurées par le mode courant I-V.

Assemblage moléculaire de surface à haute densité : stratégie streptavidine-biotine

Les attaches moléculaires de haute densité sur la surface de détection ou bio-puces sont cruciales et dépendent fortement de la fonctionnalisation de surface. Cette étude visait à déterminer la surface appropriée pour un grand nombre d'accommodations moléculaires, obligatoire pour l'expression génique, la découverte et l'analyse moléculaire. Pour ces applications, la génération de surfaces de systèmes analytiques nécessite un couplage approprié des molécules pour les immobiliser dans des formats adéquats. Ces surfaces matérielles ont été étudiées pour investiguer le mécanisme d'interaction de surface, car elles sont bon marché et offrent des degrés variés de densités de compactage, morphologie et épaisseur. Cette découverte facilitera l'attache appropriée des molécules et préviendra la perte d'activité biomoléculaire. De plus, l'orientation correcte de l'immobilisation biomoléculaire est conservée avec une confirmation structurale secondaire appropriée.

Pour atteindre une haute densité moléculaire, nous avons d'abord lavé soigneusement la surface silice avec une solution alcaline et l'avons modifiée par CDI. Pour capturer de hauts niveaux de sondes biotinylées sur la surface CDI, nous avons immobilisé la sonde avec de la streptavidine. La streptavidine est une protéine tétravalente avec quatre sites de liaison à la biotine, considérée comme une molécule à haute affinité en sciences biologiques. La surface IDE avait un niveau de courant de 2,08E-10 A, qui est passé à 9,2E-06 A après fixation du CDI, indiquant que la surface IDE modifiée par CDI est appropriée. L'ajout de streptavidine a encore augmenté le courant à 2,36E-05 A. Avec cette stratégie, nous avons immobilisé un plus grand nombre de sondes biotinylées conçues à partir du miRNA-335-5p complet sur la surface IDE (Fig. 3a). Les interactions biotine ont été réalisées après l'étape de blocage pour masquer les zones non réactives. Les changements de courant ont été déterminés à chaque modification (Fig. 3b). Comme le montre Fig. 3c, après ajout d'éthanolamine, les changements de courant étaient de 2,53E-05 A, et lors de l'ajout de 1 nM de séquence de capture biotinylée, le niveau de courant a diminué à 1,29E-08 A. Ce changement confirme l'immobilisation de la sonde de capture sur la surface de détection IDE. Généralement, un oligonucléotide simple brin porte une charge plus négative avec le squelette phosphate 5-carbone exposé (sonde), alors que la charge nette de l'éthanolamine est neutre. Cette grande différence de charge a entraîné une variation apparente du courant mesuré (Fig. 3c). Ce paramètre a été inversé à nouveau lors de la formation du duplex avec la cible, en raison de la réduction de l'exposition du squelette phosphate et des charges positives additionnelles provenant des bases nucléiques de la chaîne miARN (Fig. 4a).

Analyse interactive dose-dépendante sur l'IDE

Après fixation de la sonde biotinylée sur la surface de détection, l'analyse interactive cible a été réalisée avec différentes doses, de la gamme femtomolaire basse à nanomolaire basse. Pour valider cette gamme, une analyse préliminaire avec 1 nM de séquences cibles miRNA-335-5p a été effectuée. Après ajout de 1 nM de cible sur la surface modifiée par la sonde, le niveau de courant est passé de 1,29E-08 A à 1,29E-07 A (Fig. 4a), indiquant l'hybridation entre la sonde de capture et la séquence cible. Après confirmation, pour déterminer la limite de détection, nous avons titré la séquence cible de 1 fM à 1 nM, déposée indépendamment sur les surfaces modifiées par la sonde. Les changements de courant ont été détectés avant et après immobilisation. Les différences de courant pour les hybridations 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM et 1 nM étaient respectivement de 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21 et 11,61E-08 A. Sur la base des résultats, des changements de courant clairs dose-dépendants ont été détectés à toutes les concentrations testées (Fig. 4b).

Haute performance analytique : sensibilité, spécificité, reproductibilité

Sur la base des résultats avec incréments dépendants de la concentration, une analyse de régression linéaire a été réalisée. La sensibilité de détection a été estimée par le calcul 3σ, et s'est établie à 1 fM (Fig. 5a, b). La concentration inférieure à 1 fM montrait le signal de fond et des valeurs plus basses. De plus, une analyse de spécificité a été réalisée pour discriminer les séquences cibles des séquences non complémentaires et à un ou trois mésappariements. La sonde conçue a montré une réaction plus forte avec les séquences complémentaires parfaites du miRNA-335-5p qu'avec les autres (Fig. 6a). Une séquence à un mésappariement a donné une réponse de courant plus élevée que les séquences non complémentaires et à trois mésappariements, en raison de la formation partielle de duplex par la séquence à un mésappariement sur la sonde. Des analyses de reproductibilité ont été menées avec toutes les modifications chimiques et biologiques sur la surface IDE en triplicata, et les données ont été moyennées. Les données moyennes indiquent qu'il n'y avait pas de changements significatifs entre les différentes expériences (Fig. 6b). Pour soutenir les performances de l'IDE, les caractéristiques des méthodes actuellement disponibles ont été comparées (Tableau 1).

Conclusions

Le développement d'une méthode analytique utilisant des biomarqueurs biologiques aide au diagnostic de l'AAA lors des examens physiques. Dans cette recherche, la détection médiatisée par le miRNA-335-5p pour prédire la sévérité de l'AAA a été développée, car le miRNA-335-5p s'est avéré exprimé avec l'AAA. La sortie de la détection IDE générée a affiché des niveaux de détection de bas en haut pour faciliter la prédiction de la sévérité. Le niveau de détection le plus bas était de 1 fM avec haute spécificité et reproductibilité pour l'analyse haute performance. La méthode streptavidine-biotine tétravalente utilisée a donné de bons résultats et peut être utilisée pour d'autres analyses de biomarqueurs.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données sont pleinement disponibles sans restriction.

Abréviations

AAA :

Anévrisme de l'aorte abdominale

CDI :

1,1'-Carbonyldiimidazole

PBS :

Solution tampon phosphate

IDE :

Électrode interdigitée

UV :

Ultraviolet