Biosenseur électrochimique ADN ultra-sensible pour détermination rapide du sexe de l'arowana asiatique

Résumé

Cette étude introduit un biosenseur électrochimique ADN ultra-sensible qui identifie le sexe de l'arowana asiatique (Scleropages formosus) avec une limite de détection à l'attomolaire. Le capteur utilise des microsphères acryliques fonctionnalisées avec des groupes succinimide et des nanoparticules d'or colloïdales (AcMP-AuNP) immobilisées sur une électrode sérigraphiée au carbone. Une sonde ADN aminée est ancrée de façon covalente aux AcMP, et l'hybridation de l'ADN cible d'arowana est quantifiée par voltampérométrie de pouls différentiel (DPV) en utilisant l'acide anthraquinone-sulfonique comme marqueur redox. Dans des conditions optimisées, le capteur atteint une limite de détection de 1,0 × 10⁻¹⁸ M et une gamme linéaire de 1,0 × 10⁻¹⁸ – 1,0 × 10⁻⁸ M (R² = 0,99) en une heure, en faisant un outil léger et rentable pour le diagnostic sur site en pisciculture.

Contexte

L'arowana asiatique (Scleropages formosus) est une espèce d'eau douce prisée pour sa valeur ornementale et sa signification culturelle à travers l'Asie du Sud-Est et certaines parties de l'Océanie. En raison de sa forte demande commerciale, les populations sauvages ont été fortement exploitées, conduisant à son classement comme espèce en danger par la CITES et la Liste rouge de l'UICN. La détermination précise du sexe au stade juvénile est cruciale pour les programmes d'élevage et la régulation du marché, mais les méthodes visuelles traditionnelles sont peu fiables et chronophages, et les approches PCR conventionnelles sont laborieuses et nécessitent une infrastructure de laboratoire sophistiquée.

Les avancées récentes dans les biosenseurs à base de nanomatériaux offrent une alternative prometteuse. En intégrant des microsphères polymères acryliques avec des nanoparticules d'or, nous pouvons créer une plateforme conductive à haute surface qui améliore le chargement des sondes et le transfert d'électrons, améliorant ainsi la sensibilité et réduisant le temps d'analyse.

Méthodes

Appareillage et électrodes

Les mesures DPV ont été effectuées sur un potentiostat Autolab PGSTAT 12 utilisant une électrode sérigraphiée au carbone (SPE) modifiée avec AcMP et AuNP. Une électrode auxiliaire en platine et une électrode de référence Ag/AgCl (3,0 M KCl) ont été employées. Les solutions étaient soniquées dans un bain Elma S30H pour assurer l'homogénéité.

Produits chimiques

Les réactifs clés comprenaient le 2-2-diméthoxy-2-phénylacétophénone (DMPP), le 1,6-hexanediol diacrylate (HDDA), l'acrylate de n-butyle (nBA), le chlorure d'or(III) trihydraté et le NAS. Les nanoparticules d'or colloïdales ont été synthétisées selon Grabar et al. (1995). Les sondes ADN ont été préparées dans un tampon K-phosphate 0,05 M (pH 7,0) et hybridées dans un tampon Na-phosphate 0,05 M (pH 7,0) contenant 1,0 mM AQMS et 2,0 M NaCl.

Synthèse des microsphères acryliques

Les AcMP ont été produites via photopolymérisation UV en une étape initiée par un mélange contenant HDDA, nBA, DMPP et NAS dans une émulsion aqueuse. Après 10 min de sonication et 600 s de polymérisation UV sous N₂, les microsphères ont été collectées par centrifugation, lavées trois fois avec du tampon K-phosphate et séchées à l'air.

Fabrication du biosenseur ADN utilisant les microsphères acryliques

La surface de la SPE a d'abord été déposée par goutte avec une dispersion d'AcMP à 3 mg/mL, puis avec des AuNP colloïdaux à 5 mg/mL. L'électrode modifiée a été incubée dans une solution de sonde ADN d'arowana aminée à 5 µM pendant 6 h, suivie d'un rinçage minutieux. L'hybridation avec l'ADNc cible (5 µM) en présence de 1 mM AQMS et 2 M NaCl a duré 1 h avant l'analyse DPV dans un tampon K-phosphate 0,05 M à température ambiante.

Procédure de fabrication du biosenseur électrochimique ADN d'arowana basé sur électrode modifiée AcMP-AuNP.

Optimisation du biosenseur électrochimique ADN d'arowana

L'immobilisation de la sonde a été optimisée en variant les temps d'incubation (1–18 h) et d'hybridation (10–100 min). La température, le pH, la force ionique et la valence des cations ont été examinés systématiquement pour maximiser la réponse DPV. Les conditions optimales étaient : 6 h d'incubation de la sonde, 30 min d'hybridation à 25 °C, pH 7,0, tampon Na-phosphate 0,05 M, 2 M NaCl et 1 mM AQMS.

Extraction d'ADN et analyse de l'ADN d'arowana

Quinze échantillons de tissus d'arowana ont été extraits à l'aide du kit QIAquick PCR Purification. L'ADN génomique a été amplifié par PCR et vérifié sur gels d'agarose 1,5 %. Les mêmes extraits ont été testés avec le biosenseur ; des courants DPV au-dessus de la ligne de base indiquaient l'ADN mâle, tandis que les courants à la ligne de base correspondaient à l'ADN femelle. La significativité statistique a été évaluée par un test t (confiance 95 %).

Résultats et discussion

Les images MEB ont confirmé des AcMP uniformes et sphériques avec une distribution de taille étroite. La caractérisation électrochimique de la SPE modifiée a démontré un processus redox réversible, contrôlé par diffusion, avec une relation linéaire entre le courant de pic et la racine carrée du taux de balayage (R² = 0,996). La réponse DPV a montré une augmentation marquée du courant seulement après hybridation avec l'ADN complémentaire, confirmant la spécificité de la sonde.

Image MEB de microsphères polymères acryliques.

Distribution de taille des microsphères acryliques préparées par photopolymérisation.

Les études d'optimisation ont révélé que l'immobilisation de la sonde atteignait un plateau après 6 h, tandis que l'hybridation atteignait l'équilibre en 30 min à température ambiante. Une température supérieure à 25 °C accélérait l'hybridation mais risquait la dénaturation, donc 25 °C a été choisi comme optimal. La dépendance au pH a montré un signal DPV maximal au pH neutre 7,0 ; un pH plus bas ou plus élevé réduisait l'efficacité d'hybridation. Parmi les cations testés, Na⁺ a fourni la meilleure amélioration, probablement due à une précipitation minimale et un blindage électrostatique favorable. L'analyse de la force ionique a identifié 2 M NaCl et 0,05 M de tampon Na-phosphate comme tampon d'hybridation optimal.

Voltammogrammes cycliques de 1,0 mM K₃Fe(CN)₆ dans tampon Na-phosphate 0,05 M (pH 7,0) à divers taux de balayage pour une SPE modifiée contenant le matériau AcMP-AuNP.

Graphique des courants de pic d'oxydation versus racine carrée du taux de balayage (a) et versus log du taux de balayage (b).

Signal DPV de l'électrode ADN AcMP-AuNP avant et après hybridation avec ADN complémentaire (a) et non-complémentaire (b) ; comparaison avec électrodes modifiées seulement avec AcMP (f), seulement AuNP (e), et composite AcMP-AuNP (d).

Effets du temps d'immobilisation de la sonde ADN (a) et du temps d'hybridation (b) sur la réponse du biosenseur.

Effet de la température sur le temps d'hybridation.

Réponse DPV versus pH (5,5–8,0).

Effet des cations (Ca²⁺, Na⁺, K⁺, Fe³⁺) sur la réponse DPV.

Influence de la concentration du tampon Na-phosphate (a) et de la force ionique (b) sur la réponse du biosenseur.

Courbe d'étalonnage montrant une réponse linéaire de 1,0 × 10⁻¹⁸ M à 1,0 × 10⁻⁸ M (R² = 0,99) et spectre DPV représentatif.

Détermination du sexe du poisson arowana avec le biosenseur ADN

Lorsqu'appliqué à des échantillons de terrain, les assignations de sexe du biosenseur correspondaient aux résultats PCR, confirmant sa fiabilité pour une utilisation rapide sur site.

Conclusions

Le biosenseur électrochimique ADN développé offre une sensibilité exceptionnelle, une large gamme dynamique et une faible limite de détection pour l'ADN d'arowana. Sa capacité de détection rapide au niveau attomolaire, combinée à un format léger et jetable, le rend idéal pour l'intégration dans des dispositifs point-d'utilisation qui peuvent soutenir les opérations de pisciculture en permettant l'identification précoce du sexe et de la couleur.