Fabrication, caractérisation et cytotoxicité de nanoparticules de carbonate de calcium dérivées de coquilles d'or conjuguées de forme sphérique pour des applications biomédicales

Contexte

La production de nanoparticules monodisperses est devenue significative dans les applications électroniques, optiques, biomédicales et magnétiques [1,2,3,4]. Leur évolution et celle des biomatériaux ont favorablement amélioré les produits pharmaceutiques [5], les systèmes biomédicaux [6], les systèmes d'administration de médicaments [7], les cosmétiques et le traitement de l'eau [7,8,9]. Dans le même ordre d'idées, le développement de matériaux conjugués biocompatibles, biogéniques et non toxiques pourrait apporter des contributions précieuses aux domaines des biosciences et de la biomédecine [10]. De plus, les bio et nanomatériaux conjugués métalliques biocompatibles pourraient contribuer à davantage de progrès scientifiques pour des applications biomédicales telles que l'ingénierie tissulaire [5], la thérapeutique [11] et l'administration de médicaments [12]. Cela a été démontré dans des travaux récents de manière élaborée, comme l'utilisation d'hydrogel hybride collagène-or auto-assemblant injectable [13], de nanoconjugués colloïdaux or-collagène core-shell [14] et de nano-médicaments co-assemblés sans support pour la thérapie antitumorale. [15]. Un certain nombre d'études ont également documenté que les nanoparticules métalliques peuvent produire des électrodes enzymatiques dans des biocapteurs électrochimiques avec des matériaux inorganiques non poreux en silice [16]. En outre, les nano-hybrides d'oxyde de graphène et d'albumine synthétisés ont également montré leur avantage potentiel pour une thérapie photodynamique améliorée [17]. Dans l'ensemble, cela n'a fait que susciter plus d'intérêt avec d'autres applications possibles telles que l'imagerie biomédicale et les systèmes biosensoriels [16, 18].

Le carbonate de calcium en tant que minéral brut naturel a été utilisé dans un large éventail d'applications, notamment biomédicales, industrielles et nanotechnologiques [10, 19, 20, 21]. L'aragonite en tant que polymorphe de carbonate de calcium existe abondamment dans la coquille de coque (Anadara granosa ), un mollusque populaire, également trouvé en Malaisie [22]. L'aragonite est biogène contrairement aux autres polymorphes de carbonate de calcium de la calcite et de la vatérite, constituant jusqu'à 95-98% de la coquille de coque. Le carbonate de calcium, un matériau inorganique du polymorphe de l'aragonite, existe naturellement et couramment dans les coquilles de coque [23]. Le polymorphe de l'aragonite a de plus en plus attiré l'attention dans le domaine de la recherche en raison de ses propriétés de biocompatibilité et de son potentiel prometteur dans le développement de systèmes d'administration de médicaments anticancéreux [24] et d'imagerie biomédicale [25, 26]. Actuellement, la plupart des études de recherche antérieures ont révélé principalement deux méthodes de production de carbonate de calcium [26]. Ils comprennent la co-précipitation ou la double décomposition et la carbonatation du CO₂ gaz à travers l'hydroxyde de calcium dans des conditions contrôlées, qui, malheureusement, ne produit pas de carbonate de calcium biogénique [26,27,28]. Par conséquent, les produits contiennent un mélange de calcite et de vatérite en grandes quantités qui ne conviennent pas à un usage biomédical en raison de leur non-biocompatibilité et des rapports de toxicité élevés [26].

Cependant, avec l'utilisation croissante de la nanotechnologie dans les applications biomédicales, la présente étude se concentre sur la synthèse de nanoparticules de carbonate de calcium dérivées de coques contrôlées (CSCaCO₃ NPs) avec une taille et une forme uniques utilisant la dodécyl diméthyl bétaïne (BS-12) [29]. Ceci est inspiré des travaux antérieurs qui utilisent le BS-12 comme catalyseur de bio-minéralisation dans la synthèse de CSCaCO₃ NPs qui peuvent être facilement manipulées pour des bio-applications, des nanoparticules rentables et relativement pures [30]. La morphologie et la taille des nanoparticules synthétisées sont cruciales pour déterminer leurs propriétés physico-chimiques, en mettant l'accent sur les nanoparticules métalliques compte tenu de leurs vastes applications biomédicales potentielles [31]. Les nanoparticules d'or (AuNP) ont été continuellement utilisées en raison de leurs propriétés optiques, de leur gamme de tailles et de couleurs différentes qui dépendent des variations des maxima d'absorption ou de la méthode de synthèse employée [32]. La taille et la forme des AuNP affectent leurs caractéristiques d'absorption et d'émission dans le spectre visible de la lumière, les faisant varier du visible au proche infrarouge. Par conséquent, en raison de leur synthèse [33], de leurs propriétés physico-chimiques [34], de leur biocompatibilité [35] et de leur fonctionnalisation de surface [36], ils peuvent être manipulés pour des applications différentes et particulières [37]. En outre, il a également été indiqué que dans les diagnostics médicaux, ils ne sont pas complètement utilisés et leur valeur peut-être obscure [37].

Ainsi, peut-être qu'après une fonctionnalisation appropriée, ils pourraient être repensés pour l'imagerie du cancer [38], le traitement du cancer [39], l'administration de médicaments [40] et les gadgets sensoriels [41]. Un revêtement est essentiel pour fabriquer un biomatériau nano-hybride doté de propriétés fonctionnalisées telles que des nanoparticules d'or (AuNP) conjuguées à des nanosphères poreuses de carbonate de calcium [16, 42]. Le nanomatériau conjugué or-carbonate de calcium ou hybride nano-composite résultant, qui pourrait conserver les traits parentaux avantageux tels que la biocompatibilité, la bonne solubilité et la dispersibilité en solution [16]. Les nanoparticules d'or conjuguées qui présentent un fort changement de couleur et une résonance plasmonique de surface localisée (LSPR) pourraient être d'excellents candidats pour les systèmes de récepteurs multiples potentiels tels que les aptamères, les peptides et les anticorps [35, 43, 44, 45]. La fabrication de polymères conjugués solubles dans l'eau et ses applications dans les biocapteurs, l'imagerie par fluorescence et l'administration de médicaments ont été réalisées avec succès [46,47,48]. Cependant, les nanoparticules ou nanomatériaux conjugués ont progressivement amélioré des avantages tels que la photo stabilité [48, 49] et une faible cytotoxicité [50] au fil des ans, à l'exception d'une préparation plus conviviale [51] et de caractéristiques de séparation [48].

Ci-joint, les AuNPs et CSCaCO₃ Les nanoparticules sont synthétisées de manière contrôlée et utilisées pour fabriquer et caractériser des nanoparticules de carbonate de calcium dérivées de coquilles d'or conjuguées biogéniques (Au-CSCaCO₃ NPs) dont le diamètre varie de 19 à 51 nm. Initialement, la préparation des AuNPs s'inspire de la méthode classique de Turkevich [52] et des nanoparticules dérivées de coque de coque en utilisant l'approche synthétique de dodécyl diméthyl bétaïne [26]. Les modifications des paramètres synthétiques tels que la concentration pourraient efficacement diminuer ou augmenter leur taille. Par conséquent, le nanomatériau synthétisé a été caractérisé et étudié pour la cytotoxicité. L'Au-CSCaCO₃ Les avantages supplémentaires de la préparation des NP sont ; synthèse facile et rentabilité.

Méthodes/Expérimental

Matériaux et réactif chimique

Le sel d'or (acide tétrachloroaurique contenant une solution d'or à 49 %) et le citrate trisodique ont été achetés auprès de prima nexus Sdn Bhd (Malaisie). La coquille de coque fraîche a été obtenue sur le marché local (Pasar borong, Seri Kembangan, Selangor, Malaisie). La dodécyl diméthyl bétaïne (BS-12) et le colorant vert d'indocyanine (ICG) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne). Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), sérum de veau fœtal (FBS), combinaison d'antibiotiques (glutamine 100 mmol/L, pénicilline 100 U/mL et streptomycine 100 μg/mL), solution saline tamponnée au phosphate (PBS), diméthylsulfoxyde (DMSO) ) et le MTT (colorant au bromure de 3-diméthylthiazo-2, 5-diphynyltétrazolium) ont été achetés auprès de Naclai tesque, Inc., Kyoto, Japon. Tous les autres réactifs utilisés étaient de qualité analytique.

Synthèse de nanoparticules d'or

La synthèse a été réalisée en utilisant une méthode précédemment décrite par Verma et al. [53] avec de légères modifications dans les concentrations, 1% d'acide tétrachloroaurique contenant une solution d'or à 49%. Environ 0,1 % de la solution d'or a été préparée et diluée dans une série de concentrations de 15, 25 et 20 mM dans différentes fioles coniques, respectivement. Les solutions ont ensuite été chauffées à 100 °C sur une plaque chauffante couplée à l'agitation magnétique (position 6, WiseStir ® Korea). Ensuite, environ 1% de citrate trisodique a été ajouté à la solution bouillante sous agitation magnétique continue jusqu'à ce qu'une transition de couleur (la solution d'or jaunâtre devienne incolore puis au noir puis finalement au rouge brillant) soit observée. Le chauffage a été éteint au bout de 15 min et laissé refroidir à température ambiante. Les nanoparticules d'or synthétisées ont ensuite été stockées à - 4 °C pour une utilisation ultérieure. La réaction a été montrée dans l'équation ci-dessous :

Préparation et synthèse de nanoparticules de carbonate de calcium dérivées de coques de coque (CSCaCO₃ NP)

Trois kilogrammes de coquilles de coques fraîchement obtenues ont été soigneusement nettoyés, lavés et lavés. La poudre de coque de coque a été produite selon la méthode décrite par Islam et al. [54]. La coque de coque nettoyée a été séchée dans un four (Memmert UM500, GmbH Co, Allemagne) à 50 °C pendant 7 jours. Les coques de coques ont été broyées en poudre à l'aide d'un mélangeur (Blender HCB, 550, USA) et tamisées avec un tamis de laboratoire en acier inoxydable (Endecott Ltd., made in London, England) avec une ouverture de 90 μm pour obtenir une poudre de la taille du micron. La poudre a été séchée pendant 7 jours à 74 °C dans le four. La poudre a ensuite été emballée dans un sac en plastique hermétique en polyéthylène pour une utilisation ultérieure. Les nanoparticules de carbonate de calcium dérivées de la coque de coque ont été synthétisées selon l'approche décrite par Islam et al. [55], avec de légères modifications de la méthode et des paramètres de synthèse. Deux grammes de poudre de coque de coque ont été introduits dans une fiole conique de 250 ml, suivis de 50 ml d'eau déminéralisée double, et une concentration de 0,5 ml de BS-12 a été ajoutée dans la fiole conique. Le mélange dans la fiole conique a été vigoureusement agité à 1 000 tr/min, à une température de 50 °C pendant 135 min en utilisant une plaque chauffante multiple systématique et un agitateur magnétique avec un petit barreau magnétique. L'échantillon préparé a été séparé du liquide mère à l'aide d'un papier filtre à double anneau de taille 125 mm (Filtres Fioroni, Chine). Le résidu a ensuite été soigneusement lavé pour éliminer l'excès de BS-12. Les produits finaux, CSCaCO₃ poudre de NP, ont été emballés dans un conteneur de nettoyage à sec et séchés pendant 3 jours (Oven Memmert UM500, GmbH Co, Allemagne) à 74 °C. Le conteneur a été correctement emballé et scellé avec un film Para après l'ajout de plusieurs petites billes de marbre à l'intérieur. Le conteneur a été placé sur un broyeur à billes à rouleaux programmable (BML-6, Wisemix ® Korea) à une vitesse de 200 tr/min pendant 5 jours. L'échantillon a été stocké dans du polyéthylène hermétique dans un four pour une utilisation ultérieure.

Synthèse de nanoparticules de carbonate de calcium dérivées de coquilles d'or conjuguées (Au-CSCaCO₃ NPs) et incoopération de colorant proche infrarouge (NIR)

Dans cette procédure, 0,2 g de CSCaCO₃ Des NP et 5 mg de colorant vert d'indocyanine (ICG) proche infrarouge (NIR) ont été dispersés dans 20 ml de solution de colloïde d'or (pH 7) (solution AuNPs), comme décrit de manière similaire par Cai et al. [16], dans une fiole conique vide et propre. D'autres modifications de synthèse ont été apportées, où l'échantillon a été soniqué pendant 20 minutes et incubé sur un agitateur magnétique avec une petite barre magnétique à 200 tr/min pendant 3 jours. L'échantillon a été ultra-centrifugé à une vitesse de 10 000 tr/min pendant 10 min pour obtenir un Au-CSCaCO₃ vert clair-violacé. NP composite. Le surnageant a été décanté et le culot lavé avec une série d'eau désionisée. Le matériau composite préparé a été séché au four pendant 4 jours et stocké dans un four en polyéthylène hermétique pour une analyse plus approfondie.

Caractérisation de nanoparticules de carbonate de calcium dérivées d'une coquille d'or conjuguée (Au-CSCaCO₃ NP)

La taille des particules et la morphologie du nanomatériau ont été analysées au microscope électronique à transmission (MET). Le nanomatériau a été dispersé dans de l'alcool absolu et soniqué pendant 40 min. Environ 5 μl de la solution d'échantillon en suspension ont été pipetés sur un support d'échantillon à poignée en cuivre. L'échantillon a été visualisé sous MET (Hitachi H-7100). Le microscope électronique à balayage à émission de champ (FESEM) (modèle JOEL 7600F) fonctionnait à une tension de 5 KV et était équipé d'une unité de spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDX). Ceci a été utilisé pour caractériser les caractéristiques de surface de l'Au-CSCaCO₃ NPs. Le matériau a été dispersé dans de l'alcool absolu et soniqué pendant 1 h. Environ 50 μl de la solution d'échantillon en suspension ont été pipetés sur un support d'échantillon à poignée en cuivre, séchés pendant la nuit et numérisés à l'aide des faisceaux d'électrons. En outre, le spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) a également été utilisé pour l'analyse fonctionnelle du nanomatériau conjugué synthétisé; le nanomatériau a été calibré à 1 % en poids dans Ker (FTIR modèle 100, Perkin Elmer) dans la plage de 400 à 4000 cm ⁻¹ . De plus, l'analyse de la taille du nano conjugué synthétisé et du potentiel zêta a été effectuée à l'aide de zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments). Le matériau a été mis en suspension dans de l'eau déminéralisée et soniqué pendant 50 min ; la suspension homogène a été déposée dans la cuvette du zétasiseur et examinée pour la taille des particules et le potentiel zêta. La présence de différents analytes du nanocomposite conjugué a été surveillée à l'aide d'un spectrophotomètre Uv-Vis (UV - 2600) à différentes longueurs d'onde allant de 300 à 800 nm.

Études de culture cellulaire et de cytotoxicité

La lignée cellulaire d'adénocarcinome du sein humain (JCRB :MCF-7) et la lignée cellulaire de fibroblastes de souris (JCRB :NIH3T3) ont été cultivées dans du DMEM (hyperglycémie) supplémenté avec 10 % de FBS et une combinaison d'antibiotiques (glutamine 100 mmol/L, pénicilline 100 U/ mL et streptomycine 100 μg/mL). Les flacons de culture (culture Eppendorf T-25 et T-75) ont été incubés dans du dioxyde de carbone à 5 % à 37 °C, et des cellules à 80-90% de confluence ont été utilisées pour l'ensemencement et le processus de traitement.

Ensemencement et traitement des cellules

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques stériles à 96 puits à une densité de 5 × 10 ³ cellules par puits et incubées pendant 24 h pendant la nuit. Les milieux dans chaque puits ont été retirés et les cellules ont été traitées et co-cultivées en réplicats avec une suspension nano composite conjuguée (Au-CSCaCO₃ NP) pendant une période de 24, 48 et 72 h. Une fois l'exposition au traitement terminée, les milieux dans les puits ont été aspirés et lavés avec du PBS avant d'être remplacés par un autre milieu frais avant les traitements expérimentaux.

Préparation de Au-CSCaCO₃ IP pour le traitement

Solution mère d'Au-CSCaCO₃ Des NP à une concentration de 1 mg/ml dans un milieu DMEM sans sérum à 10 % ont été préparées. Après ensemencement cellulaire des cellules MCF-7 et des cellules NIH3T3 dans des plaques à 96 puits, les plaques ont été traitées et incubées avec différentes concentrations en microgramme (100–1,56) de l'Au-CSCaCO₃ Solutions NPs.

(MTT) Préparation et protocole du réactif bromure de 3-diméthylthiazo-2, 5-diphynyltétrazolium

Typiquement, 5 mg de poudre de réactif MTT ont été dissous dans 1 ml de PBS facilité par un vortex sonicateur pour un mélange uniforme. Après l'ensemencement et le traitement des cellules, les plaques de puits ont été nettoyées et 20 ul de réactif MTT ont été ajoutés à chaque puits. Immédiatement après, les plaques ont été laissées à incuber pendant 3 à 4 h pour permettre la liaison du MTT aux mitochondries des cellules. Après incubation, 1 ml de DMSO a été ajouté à chacun des puits qui ont libéré le produit coloré dans la solution. Les plaques ont été conservées dans une pièce sombre pendant 30 minutes et la densité optique (DO) de la solution a été mesurée avec un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de 570 nm [56]. Les expériences ont été menées en triple pour chaque lignée cellulaire, et les valeurs moyennes ont été enregistrées. Le pourcentage de viabilité cellulaire a été déterminé à l'aide de la formule ci-dessous.

où A _Échantillon était la lecture moyenne de la DO de différentes cellules traitées incubées des deux lignées cellulaires et A _Contrôle était la lecture moyenne de la DO des différentes cellules incubées dans des milieux de culture complets uniquement. La cytotoxicité des cellules a ensuite été évaluée à partir des valeurs moyennes en triple et présentée comme moyenne  ± écart-type (SD).

Analyse statistique

L'analyse des données statistiques a été effectuée à l'aide du logiciel SPSS (Version 10, Chicago, USA). Les expériences ont été réalisées en triple et exprimées en moyenne  ± écart-type (M ± SD). Le seuil de signification était p < 0,01.

Résultats et discussion

Propriétés physicochimiques du conjugué Au-CSCaCO₃ NP

Microscope électronique à transmission

Le but des micrographies MET était d'évaluer la taille de l'Au-CSCaCO₃ conjugué synthétisé NPs qui montrent des nanoparticules bien dispersées avec un diamètre moyen de 35 ± 16 nm dans la plage de (19-51 nm). Les différences de taille attribuées aux conditions de synthèse étaient comme indiqué sur la figure 1.

TEM (a , b ) images de l'Au-CSCaCO₃ NPs caractérisant leurs différentes tailles de nanoparticules

Les micrographies MET du nano-conjugué ont montré un diamètre allant de 19 à 51 nm et des nanoparticules dispersées. La nano-taille obtenue de manière unique pourrait être attribuée aux conditions de synthèse contrôlées utilisées. Une autre explication possible de la dispersité des nanoparticules pourrait être due à la couche chargée négativement d'ions citrate qui a contribué à la répulsion des nanoparticules les unes des autres et également, en raison de la répulsion électrostatique et de la couche de surface d'hydratation conjuguée empêchant l'agrégation et augmentant la stabilité du conjugué comme rapporté de la même manière. par Jazayeri et al. [56]. De plus, le réactif de coiffage citrate joue un rôle dans la synthèse, ce qui a permis une plus grande dispersité et stabilité du conjugué de nanoparticules, comme l'ont rapporté Rawat et al. [57]. La taille de particule unique a montré que les différentes nanoparticules d'or absorbées à l'intérieur de la matrice de nanosphères de carbonate de calcium étaient similaires aux travaux effectués par Cai et al. [16], contribuant à la taille de particule résultante observée montrée. Cependant, ce résultat confirme également les rapports selon lesquels la calcite a une faible capacité à accueillir des nanoparticules d'or [16].

Microscopie électronique à balayage par émission de champ (FESEM) et spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDX)

La micrographie FESEM a évalué la morphologie et la forme des nanoparticules synthétisées qui montrent Au-CSCaCO₃ de forme sphérique et en forme de chaîne Nanoparticules NPs avec un faible degré d'agrégation, comme le montre la Fig. 2. Les spectres élémentaires (Fig. 2b) ont analysé la composition élémentaire des nanoparticules conjuguées qui présentent 64,98 % de carbone, 13,53 % d'oxygène, 0,02 % de calcium, 17,63 % de cuivre et 3,85 % d'or comme présenté dans le tableau 1.

FESEM a Micrographie FESEM de l'Au-CSCaCO₃ NPs décrivant la morphologie. b Spectres EDX de l'Au-CSCaCO₃ NP

Les micrographies FESEM ont décrit la morphologie unique comme une forme sphérique, une surface lissée et des nanoparticules conjuguées structurées en chaîne dont les propriétés physiques ou chimiques pourraient être expliquées en raison des conditions de préparation et des méthodes de synthèse [58]. De même, la nature structurelle sphérique affichée par les nanoparticules conjuguées était similaire à celles rapportées par Verma et al. [53], mais contrairement au faible degré d'agrégation présenté. Une explication possible de ce résultat pourrait être due aux interactions hydrophobes et électrostatiques entre les nanoparticules d'or et les nanoparticules de carbonate de calcium dérivées de la coque de coque conduisant à une forte liaison [48]. De plus, le rôle du BS-12 utilisé dans la synthèse s'est reflété dans la décomposition des nanoparticules en une forme sphérique analogue aux travaux documentés par Islam et al. [55]. Le profil élémentaire (tableau 1) n'a révélé aucun changement significatif contrairement au résultat attendu. De même, les résultats observés avec la composition chimique des nanoparticules conjuguées sont documentés comme indiqué précédemment dans des travaux antérieurs [26, 54].

Répartition de la charge de surface et de la taille par intensité

Le potentiel zêta des nanoparticules conjuguées a été effectué afin d'évaluer leur charge de surface, leur stabilité et leur distribution de taille par intensité, ce qui révèle une charge négative de − 16,4 ± 3,81 mV et une taille moyenne des nanoparticules conjuguées de 57,97 nm, comme indiqué sur la Fig. 3 et Tableau 2.

un Distribution granulométrique par intensité de l'Au-CSCaCO₃ NPs. b Potentiel zêta de l'Au-CSCaCO₃ NPs montrant la charge surfacique

Le potentiel zêta est un test important dans l'évaluation de la charge électrostatique de surface des nanoparticules qui a été déterminée à l'aide d'un calibreur zêta. Cela explique en outre la dispersité du nanomatériau en solution, nous permettant de comprendre la stabilité globale, la durée de conservation des nanoparticules, les interactions entre les particules chargées et leurs implications [59]. L'évaluation du potentiel zêta du nanomatériau conjugué a indiqué la stabilité des nanoparticules à - 16,4 mV et un indice de polydispersité (PdI) inférieur à 0,5. Une explication possible pourrait être attribuée à la présence de plus d'électro-répulsion entre les particules en suspension lors de la mesure. De plus, les tendances à l'agglomération peuvent également avoir influencé la distribution de la taille conduisant à une plus grande taille en raison des méthodes de synthèse. Une étude préalable de Hoque et al. a également documenté [60] qu'un potentiel zêta hautement positif ou négatif diminue l'agrégation et augmente la stabilité. De plus, les différences physico-chimiques des nanoparticules synthétisées pourraient être expliquées par les méthodes de synthèse utilisées. Les travaux de Kanaujia et ses collaborateurs [61] ont également souligné que des valeurs négatives ou positives plus élevées du potentiel zêta indiquent la stabilité et évitent l'agrégation des particules, en raison de la répulsion électrique qui stabilise électriquement la dispersion des nanoparticules, également signalée par Isa et al. [62].

Spectromètre infrarouge à transformation de Fourier (FTIR)

Le spectre FTIR de Au-CSCaCO₃ NPs montre que le pic le plus remarquable est apparu à 1455,09 cm ⁻¹ suivi de pics observés à 1059,12 cm ⁻¹ , 854,80 cm ⁻¹ , et 464,16 cm ⁻¹ , respectivement. De plus, des pics faibles ont été observés à 706,40 cm ⁻¹ et 1785,68 cm ⁻¹ comme présenté dans la Fig. 4.

Spectre du spectromètre infrarouge à transformée de Fourier des principaux pics caractéristiques de Au-CSCaCO₃ NPs. Toutes les marques correspondent aux fréquences discutées dans le texte

Le spectre FTIR de Au-CSCaCO₃ Les NP telles que présentées ont montré que le pic le plus remarquable apparaissait à 1455,09 cm ⁻¹ , attestant des liaisons oxygène-hydrogène (O–H) présentes dans les groupes carboxyliques des nanoparticules d'or [14] et des nanoparticules de coque de coque, suivies de pics qui montraient le mieux la présence du marqueur polymorphe d'aragonite observé à 1059,12 cm ⁻¹ , 854,80 cm ⁻¹ , et 706,40 cm ⁻¹ , qui sont connus pour rapporter un groupe alkyle apparaissant dans les nanoparticules dérivées de la coque de coque qui correspondaient aux pics du spectre [55]. De même, le pic faible a été observé à 1785,68 cm ⁻¹ en raison de la présence de groupe carboxylique [54], et un pic supplémentaire a été observé à 464,16 cm ⁻¹ . Tous les pics ont montré une caractéristique significative de la présence de liaisons covalentes, de liaisons carbone-carbone (C-C), carbone-oxygène (C-O) et carbone-azote (C-N) dont les groupes fonctionnels appropriés étaient présents dans notre conjugué nanoparticules. Le FTIR a essentiellement identifié les groupes fonctionnels présents, en obtenant les pics du spectre infrarouge du nanomatériau conjugué et en collectant simultanément des données à haute résolution spectrale sur une large gamme spectrale (400-4000 cm ⁻¹ ) [63]. Cependant, la calcite polymorphe du carbonate de calcium aurait des pics allant de 2000 à 2900 cm ⁻¹ avec les nanoparticules fabriquées par la méthode de carbonatation [64].

Spectrophotomètre Uv-Vis

Les nanoparticules conjuguées synthétisées présentent un pic d'absorption important à 530 nm, comme le montre la figure 5.

Spectre d'absorbance du spectrophotomètre Uv-Vis de l'Au-CSCaCO₃ NPs comme discuté dans le texte

Les nanostructures d'or ont une large absorbance de la lumière en raison de l'effet de résonance plasmonique de surface localisé des AuNPs [65, 66]. Un certain nombre de rapports ont montré que les particules d'or ont souvent un pic d'absorbance net observé entre 500 et 520 nm [66,67,68,69]. Cette technique a permis une évaluation plus approfondie du conjugué Au-CSCaCO₃ Taille, concentration et niveau d'agrégation des NP [65]. La bande d'absorbance est également connue pour se déplacer vers les plus petites longueurs d'onde indiquant la réduction de la taille des particules, et la forme symétrique des spectres d'absorption indique une distribution granulométrique étroite [70], confirmant ainsi notre conjugué Au-CSCaCO_{3 NPs qui affichaient un pic d'absorption plus large entre 500 et 550 nm et le point le plus élevé à une longueur d'onde de 530 nm. Acceptable dans la région du spectre visible proche infrarouge, où la lumière est facilement atténuée par le tissu et le pic d'absorption se déplace de manière significative vers une longueur d'onde plus longue [71]. Une explication possible à cela pourrait être due à la synthèse et à la conjugaison du nanomatériau. Également en accord avec Srinath et al., qui ont révélé que la position de la bande d'absorption dépend principalement de la variation de couleur, de l'agrégation et des espèces adsorbées en surface [72]. De plus, le spectre d'absorption des nanoparticules pourrait changer en fonction de la couleur, de la morphologie et de la taille en raison de la propriété de résonance plasmonique de l'or [73]. Les nanostructures dotées de propriétés photothermiques NIR ont la capacité de diffuser fortement la lumière, ce qui a des applications importantes en imagerie biomédicale [74, 75].}

Études de cytotoxicité

MTT (3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazolium Bromide)

Des études de cytotoxicité sur des cellules de carcinome mammaire humain (MCF-7) et des cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (NIH3T3) révèlent que l'Au-CSCaCO₃ Les NP ont inhibé plus de 70 % de prolifération cellulaire provoquant la mort des cellules cancéreuses et près de 40 % d'inhibition des cellules fibroblastiques à une dose de 100 μg. L'IC₅₀ et des doses de concentration plus faibles telles que 25 μg se sont également avérées toxiques pour les cellules cancéreuses, révélant une faible viabilité cellulaire et inhibant également plus de 50 % de la prolifération cellulaire des cellules cancéreuses pour les nanoparticules. D'autre part, des doses de concentration identiques aux cellules fibroblastiques ont montré une viabilité cellulaire accrue et cohérente des cellules fibroblastiques. L'IC₅₀ affiché jusqu'à 80 % de viabilité cellulaire des cellules fibroblastiques, comme le montre la figure 6.

Évaluation de la cytotoxicité du Au-CSCaCO₃ traité au MCF-7 et au NIH3T3 Cellules NP utilisant le test MTT donnant un pourcentage de viabilité cellulaire

Le bromure de 3-diméthylthiazo-2,5-diphynyltétrazolium (MTT) est un test colorimétrique utilisé de manière acceptable pour déterminer la viabilité cellulaire [76]. Utilizing mitochondrial enzymes in the electron transport chain [77], viable cells with active metabolism converted MTT into purple-colored formazon crystals in the cellular cytosol [78]. The crystals were dissolved after cell lysis on adding an organic solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) which is proportional to live cell number, unlike dead cells, due to cytotoxicity that are unable to carry out the reaction [79]. The conjugated nanoparticles displayed consistent cell death against the cancer cells and reliable cell viability of the fibroblast cells with concentration doses ranging from 25–100 μg. Furthermore, attesting low cytotoxicity and highlighting the biocompatibility of Au-CSCaCO₃ NPs and potential usefulness for biomedical applications, the cytotoxicity could be due to the internalization of the nanoparticles which possibly triggered intracellular responses and thus induced cellular damage because of interaction with cell organelles. Despite contrary cytotoxicity findings with works done on HeLa cells (human cervical cancer cell line) due to nanoparticles inducing oxidative damage [35, 80], Zhang et al. demonstrated the biocompatibility of the nanoparticles and its likely use for drug delivery systems [80]. Similarly, reports of gold nanoparticles confirmed nontoxic dependent on their size [81] and concentration [39]. Studies strongly confirmed that biogenic gold conjugates are stable and nontoxic nanocarrier used in biomedical application [35, 39] suggesting use for biomedical applications such as drug delivery and cancer therapy [82].

Conclusions

Spherical-shaped conjugated gold-cockle shell-derived calcium carbonate nanoparticles (Au-CSCaCO₃ NPs) were obtained. The conjugated nanoparticles were synthesized using a simpler, environmental friendly, and cost-efficient synthetic approach. Furthermore, based on the results, the obtained conjugated nanoparticles were relatively pure and stable. The source of material used for the cockle shell-derived nanoparticles is biogenic, readily available, and naturally occurring as seawater mollusca cockle shell. Based on the presented evidences, the conjugated Au-CSCaCO₃ NPs could be a good biomaterial for biomedical applications.

Abréviations

Au-CSCaCO₃ NPs :

Synthesized Conjugated Gold-Cockle Shell Derived Calcium Carbonate Nanoparticles

AuNPs:

Gold nanoparticles

BS-12:

Dodecyl dimethyl betaine

C–C:

Carbon-carbon bond

C–N:

Carbon-nitrogen bond

C–O :

Carbon-oxygen bond

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

EDX:

Energy dispersive X-ray

FBS:

Fetal bovine serum

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FRGS:

Fundamental Research Grant Scheme

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

HeLa cells:

Human cervical cancer cell line

IC₅₀ :

50% inhibition concentration

ICG:

Indocyanine green dye

JCRB:

Japanese Collection Research Bioresource

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

MTT:

3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazolium Bromide Dye

NIH-3T3:

Mouse embryonic fibroblast cell line

NIR :

Proche infrarouge

O–H:

Oxygen-hydrogen bond

OD:

Optical density

PBS:

Phosphate-buffered saline

TEM :

Microscope électronique à transmission