Administration ciblée contre le cancer : décoration de nanovésicules avec pHLIP pour reconnaissance du microenvironnement tumoral acide

Résumé

L'acidité à la surface des cellules cancéreuses est une marque du microenvironnement tumoral, qui ne dépend pas de la perfusion tumorale, servant ainsi de biomarqueur général pour cibler les cellules tumorales. Nous avons utilisé le peptide d'insertion à pH bas (pHLIP) pour décorer des liposomes et niosomes. Le pHLIP détecte le pH à la surface des cellules cancéreuses et s'insère dans la membrane des cellules ciblées, amenant le nanomatériau à proximité immédiate de la membrane cellulaire. Des liposomes DMPC et niosomes Tween 20 ou Span 20 avec et sans pHLIP dans leur revêtement ont été pleinement caractérisés pour obtenir une compréhension fondamentale des caractéristiques des nanovecteurs et faciliter la conception rationnelle de nanovecteurs sensibles à l'acidité. La stabilité des échantillons dans le temps et en présence de sérum a été démontrée. La taille, le potentiel zêta, la morphologie des nanovecteurs, ainsi que leur capacité à piéger une sonde hydrophile et moduler sa libération ont été étudiées. Les vésicules décorées de pHLIP pourraient être utiles pour obtenir une libération prolongée (modifiée) de substances biologiquement actives pour cibler tumeurs et autres tissus malades acides.

Introduction

Il y a environ un siècle, Paul Ehrlich a émis l'idée de réaliser des « balles magiques » pour une administration spécifique et plus efficace des médicaments [1]. Ces « balles magiques » doivent protéger le médicament administré d'un environnement hostile, diminuer les effets secondaires en ciblant le tissu malade, améliorer la pharmacocinétique et la pharmacodynamique, et moduler la libération du médicament [2].

En 1965, Bangham a observé pour la première fois des vésicules à base de phospholipides [3] et, dans les années suivantes, Gregory Gregoriadis a établi le concept que les liposomes pouvaient encapsuler des médicaments et être utilisés comme systèmes d'administration. En particulier, ils sont composés de bicouches phospholipidiques fermées (lamelles), où les chaînes lipidiques hydrophobes sont enfermées entre deux couches de têtes hydrophiles. La bicouche fermée entoure un cœur aqueux, permettant la localisation de médicaments lipophiles ou hydrophiles respectivement [4, 5].

La taille des liposomes est un paramètre critique influençant le sort du vecteur après administration, en termes d'absorption de protéines plasmatiques, reconnaissance par le système réticulo-endothélial (RES), temps de circulation, et trafic cellulaire. Les vecteurs nanosize favorisent l'internalisation cellulaire et le ciblage tumoral, ainsi de nombreux chercheurs se concentrent sur la « nanonisation » [6-9].

Pour obtenir des nanovecteurs plus polyvalents et économiques, des tensioactifs synthétiques ont été employés pour obtenir des systèmes d'administration liposome-like. Les tensioactifs non-ioniques sont largement utilisés à cet effet, capables de s'auto-assembler en vésicules unilamellaires ou multilamellaires (liposomes non-ioniques, niosomes, ou vésicules de tensioactifs non-ioniques). Les tensioactifs esters de sorbitan (Spans®) sont des substances lipophiles largement utilisées dans la préparation de niosomes. Pour prolonger le temps de circulation des vésicules et obtenir des nanovecteurs « furtifs », l'incorporation de polyéthylène glycol (PEG) est l'approche standard : par cette conjugaison, des tensioactifs esters de sorbitan éthoxylés (Tweens®) sont obtenus. Span et Tween sont caractérisés par une balance hydrophile/lipophile (HLB) différente et le choix du tensioactif permet de préparer des niosomes aux propriétés souhaitées [10]. De plus, l'ajout de cholestérol renforce la stabilité de la bicouche en étirant les queues des tensioactifs, affectant la température de transition gel-liquide et conférant rigidité à la bicouche lipophile [11, 12]. Le nanovecteur « optimisé » est conçu pour améliorer la formulation et/ou renforcer le ciblage [10].

De nos jours, le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. Les approches thérapeutiques actuelles ont des limitations incluant une administration non-efficace aux tumeurs et un manque de ciblage tumoral associé à effets secondaires indésirables et dangereux, que les approches nanotechnologiques pourraient aider à surmonter [13].

Actuellement, diverses approches de ciblage sont en développement. La plupart ciblent des biomarqueurs particuliers surexprimés à la surface des cellules cancéreuses. Cependant, du fait de l'hétérogénéité des tumeurs humaines, des approches plus générales de ciblage tumoral seront bien plus avantageuses. L'acidité à la surface des cellules cancéreuses est une marque du microenvironnement tumoral, et ne dépend pas de la perfusion tumorale, servant ainsi de biomarqueur général pour cibler les cellules tumorales [14]. La technologie pH (low) insertion peptide (pHLIP) se développe rapidement pour cibler l'imagerie et les petites molécules thérapeutiques, ainsi que les nanomatériaux vers les tumeurs. Le pHLIP détecte le pH à la surface des cellules cancéreuses et s'insère dans la membrane des cellules ciblées [15, 16]. Le mécanisme d'insertion du pHLIP est déclenché par la protonation des résidus chargées négativement du peptide à pH bas (pH < 7,0). Cela augmente l'hydrophobicité du peptide, déplaçant l'équilibre vers la partition du peptide dans la bicouche [17]. Les nanovecteurs décorés de pHLIP sont biocompatibles, ciblent les tumeurs, et démontrent une internalisation cellulaire accrue par les cellules cancéreuses. Parmi les nanoparticules revêtues de pHLIP étudiées figurent des nanomatériaux lipidiques, polymères et métalliques [18-21].

Le but de ce travail est de caractériser pleinement de nouveaux nanovecteurs vésiculaires décorés par pHLIP pour obtenir une compréhension fondamentale des caractéristiques des nanovecteurs et faciliter la conception rationnelle de nanovecteurs sensibles à l'acidité.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Polyoxyéthylène sorbitan monolaurate (Tween 20), sorbitan monolaurate (Span 20), cholestérol (Chol), sel Hepes {N-(2-hydroxyéthyl) pipérazine-N'-(2-éthanesulfonique)}, sérum humain, Sephadex G-75, calcéine, et diphenylhexatriène (DPH) ont été achetés chez Sigma-Aldrich. 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-[4-(p-maleimidophényl)butyramide] sel de sodium (DSPE-maleimide) ont été achetés chez Avanti Polar Lipids et le pyrène obtenu chez Fluka. Le peptide pHLIP (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) a été synthétisé et purifié par CS Bio. Tous les autres produits et réactifs étaient de grade analytique.

Synthèse de DSPE-pHLIP

Le pHLIP a été conjugué avec des lipides DSPE dans le méthanol par conjugaison covalente de DSPE-maleimide avec le résidu cystéine unique au N-terminus du pHLIP, comme décrit précédemment [18, 21, 22]. Brièvement, 5 mg de peptide dissous dans 250 μL méthanol (soufflé à l'argon) et DSPE-maleimide (de solution mère 9,9 mM) dissous dans le chloroforme ont été mélangés à ratio molaire 1:1. Le mélange réactionnel a été maintenu à température ambiante pendant 2-6 h jusqu'à complétion de la conjugaison. La progression de la conjugaison DSPE-maleimide avec pHLIP a été suivie par RP-HPLC utilisant un gradient de 25 à 80 % acétonitrile dans l'eau contenant 0,05 % TFA en surveillant la diminution du pic correspondant au pHLIP non marqué dans le mélange réactionnel. Le construit synthétisé a été caractérisé par spectrométrie de masse SELDI-TOF. La concentration du conjugué DSPE-pHLIP a été déterminée par absorbance utilisant le coefficient d'extinction molaire pour pHLIP : ε₂₈₀ = 13 940 M⁻¹ cm⁻¹.

Préparation et purification des vésicules

La méthode d'évaporation de couche mince a été utilisée pour préparer des vésicules de tensioactifs non-ioniques (Tween 20 ou Span 20) et phospholipidiques (DMPC), avec et sans pHLIP. Dans chaque formulation, le cholestérol a été ajouté en différents ratios molaires (Tableau 1) [23].

La composition des échantillons a été optimisée en choisissant des structures préalablement bien caractérisées [24, 25] auxquelles la même quantité de pHLIP a été ajoutée.

Les composants lipophiles étaient d'abord dissous dans mélange CHCl₃:CH₃OH (3:1) ; le solvant organique était ensuite éliminé sous vide à différentes températures selon l'échantillon. Le film obtenu était hydraté avec 5 mL de tampon Hepes (0,01 M pH 7,4) ou solution de calcéine sodique 10⁻² M. La suspension était vortexée ~5 min, suivie de sonication (voir Fichier additionnel 1: Tableau S1, informations supplémentaires) utilisant une microsonde à 20 kHz (VibraCell-VCX 400-Sonics, Taunton, MA, USA). La sonication LipoDMPC était conduite sous atmosphère inerte pour prévenir l'oxydation.

La suspension de vésicules était ensuite purifiée par chromatographie d'exclusion de taille sur Sephadex G-75 (colonne verre 50 × 1,2 cm) avec tampon Hepes comme éluant. Ensuite, la suspension purifiée était filtrée par filtres à cellulose à pore approprié.

La même méthode de préparation a été utilisée pour préparer niosomes et liposomes revêtus de pHLIP.

Mesures par diffusion dynamique de la lumière

La taille moyenne et la distribution de taille des vésicules étaient mesurées à T = 25 °C par diffusion dynamique de la lumière (DDL), utilisant un Malvern NanoZetaSizer ZS90, équipé d'un laser HeNe 5 mW (longueur d'onde λ = 632,8 nm) et corrélateur numérique. Les fonctions d'autocorrélation normalisées de l'intensité diffusée à 90° étaient analysées par l'algorithme Contin pour obtenir la distribution du coefficient de diffusion D, donc la distribution du rayon hydrodynamique effectif R_H des vésicules via la relation Stokes-Einstein R_H = k_BT/6πηD, où k_BT est l'énergie thermique et η la viscosité du solvant. La largeur de la distribution de taille des niosomes/liposomes est plutôt faible mais non-négligeable. Les valeurs rapportées Tableau 2 correspondent au diamètre hydrodynamique moyen pondéré par l'intensité des particules [26].

Mesures du potentiel zêta

Les mesures de mobilité électrophorétique étaient effectuées par la technique de Doppler laser, utilisant l'appareil Malvern NanoZetaSizer ZS90. La mobilité u était convertie en potentiel ζ via la relation de Smoluchowski ζ = uη/ε, où η et ε sont la viscosité et la permittivité de la phase solvant respectivement [27].

Diffusion des rayons X aux petits angles

Des expériences de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ont été menées au European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, France). L'utilisation de la ligne de faisceau ID02 à haute brillance a permis des mesures sur solutions diluées dans la région de transfert de moment 0,1 nm⁻¹ ≤ q ≤ 6 nm⁻¹, q = (4π/λ)sin(θ/2), où θ est l'angle de diffusion et λ = 0,1 nm la longueur d'onde des rayons X. L'échelle de longueur correspondante est entre 1 et 60 nm, adaptée pour accéder à la structure interne des vésicules niosomales et liposomales en solution. Toutes expériences étaient à T = 25 °C avec temps d'irradiation court, 0,1 s, pour prévenir les dommages radiatifs. Pour chaque échantillon, l'intensité diffusée à différents angles était capturée sur un détecteur 2D, puis regroupée angulairement, soustraite des contributions du fond et du solvant, et analysée pour obtenir information sur la forme et structure interne des vésicules en solution.

Dans le cas de vésicules unilamellaires, la bicouche fermée était modélisée avec trois coquilles concentriques correspondant aux têtes externes, chaînes hydrophobes, et têtes internes. Une distribution de Schulz pour la taille des vésicules était assumée.

Cryo-MET

La solution de vésicules (goutte 5 μL) était déposée sur une grille de microscopie électronique Lacey formar/carbone et préservée en état vitrifié-hydraté par congélation rapide dans l'éthane liquide. Le processus de vitrification était effectué avec le système FEI Vitrobot avec réglage : un seul buvardage de 3 s, décalage de 1, temps d'égouttage et d'attente de 1 s. La microscopie électronique à transmission (MET) (JEOL 2100) avec tension d'accélération 200 kV à grossissements ×10 000 à ×150 000 était utilisée pour imager les vésicules.

Études de stabilité

Des études de stabilité physique des niosomes et liposomes, préparés avec et sans pHLIP, ont été menées à deux températures de stockage (25 °C et 4 °C). Le but était d'évaluer si des changements significatifs de taille et potentiel zêta de la dispersion de vésicules surviennent sur 90 jours. Des échantillons de chaque lot étaient prélevés à intervalles définis (1, 30, 60, 90 jours) et la taille et le potentiel zêta des vésicules déterminés comme décrit.

De même, la stabilité des échantillons a été étudiée en présence de fluides biologiques, comme le sérum humain. Les suspensions étaient mises en contact avec 45 % de sérum humain à 37 °C. À intervalles définis (0, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h), les variations de taille et potentiel zêta des vésicules étaient déterminées.

Caractérisation de la bicouche

La fluidité et la microviscosité-polarité des bicouches niosomales et liposomales étaient accessibles par mesures de fluorescence de deux sondes fluorescentes, diphenylhexatriène (DPH) et pyrène, respectivement, localisées dans la région hydrophobe de la membrane bicouche. DPH (2 mM) et pyrène (4 mM), 220 μL et 2,5 mg respectivement, étaient ajoutés au mélange tensioactif ou phospholipide/cholestérol avant la préparation des vésicules [28]. Ensuite, les vésicules chargées en pyrène étaient purifiées comme décrit, tandis que les vésicules chargées en DPH étaient filtrées à travers des pores progressivement plus petits (5,0 à 0,22 μm).

Les mesures d'anisotropie de fluorescence étaient effectuées à température ambiante avec un spectrofluoromètre LS55 (PerkinElmer, MA, USA) à λ_exc = 400 nm et λ_em = 425 nm et l'anisotropie de fluorescence (A) calculée selon :

$$ A = \frac{I_{vv} - I_{vh} \times G}{I_{vv} + 2 I_{vh} \times G} $$

où I_vv et I_vh sont les intensités de fluorescence émise (unités arbitraires), respectivement parallèles et perpendiculaires à la direction de la lumière d'excitation polarisée verticalement. Le facteur de correction G = I_hv/I_hh est le rapport entre les composantes d'émission polarisées verticalement et horizontalement quand la lumière d'excitation est polarisée horizontalement. Les valeurs d'anisotropie de fluorescence sont inversement proportionnelles à la fluidité de la membrane. Donc, une valeur élevée correspond à un ordre structural élevé et/ou faible fluidité [30].

Pour évaluer la microviscosité et la micropolarité de la bicouche vésiculaire, des expériences de fluorescence avec pyrène étaient menées avec un spectrofluoromètre Perkin-Elmer LS55 à λ_exc = 330 nm, enregistrant le spectre d'émission 350 < λ_em < 550 nm [28]. La structure fine de la fluorescence du pyrène présente cinq pics. Le rapport entre intensités du premier (372 nm) et troisième (382 nm) bandes vibratoires, I₁/I₃, est lié à la polarité de l'environnement du pyrène [31]. De faibles valeurs correspondent à un environnement apolaire. De plus, les molécules de pyrène incorporées dans la bicouche peuvent former des excimères intramoléculaires, processus sensible à la viscosité du microenvironnement [32]. Donc, le rapport intensité excimère/monomère, I_E/I_M, est lié à la microviscosité.

Ces études étaient menées sur vésicules préparées avec et sans pHLIP et les résultats comparés.

Études de libération de calcéine

Les vésicules de tensioactifs non-ioniques ou phospholipidiques étaient chargées en calcéine à concentration 10⁻² M. À cette concentration, la fluorescence de la calcéine est auto-étouffée [33]. Des mesures de dé-étouffement étaient utilisées pour déterminer la libération de calcéine du cœur aqueux des vésicules. La sonde fluorescente était chargée pendant l'hydratation du film mince par addition de 5 mL de solution aqueuse de calcéine. Les suspensions de vésicules étaient purifiées par chromatographie d'exclusion, mises en contact avec 45 % sérum humain ou Hepes, puis chargées dans un sac de dialyse à membrane de cellulose (cut-off 8000 Da, Spectra/Por®). Les expériences de libération étaient à 37 °C, sous agitation magnétique dans tampon Hepes (10 mM, pH 7,4) comme milieu externe. Des aliquots du milieu externe étaient prélevés à différents temps sur 0-24 h. De temps en temps, les aliquots prélevés étaient réintroduits dans le système [34].

La libération de calcéine était surveillée par mesures de fluorescence du milieu avec spectrofluoromètre Perkin-Elmer LS50B à λ_ex = 492 et λ_em = 520 nm. La valeur de référence F_∞ (unités arbitraires), corrélée à la quantité totale de calcéine piégée dans les vésicules [35], était déterminée après disruption des vésicules avec alcool isopropylique (1:1 v/v). Les pourcentages de libération (F%) à chaque point de temps étaient obtenus par :

$$ F\% = \frac{F_t}{F_\infty} \times 100 $$

où F_t (unités arbitraires) est la fluorescence lue à un temps spécifique t.

Analyse statistique

Une ANOVA à un facteur a été utilisée pour l'analyse statistique. Un test t de Bonferroni a posteriori a évalué la significativité statistique du test ANOVA. Une valeur p < 0,05 était considérée statistiquement significative. Les résultats sont la moyenne de trois expériences ± écart-type.

Résultats et discussion

Vésicules Tween20, Span20, et DMPC, préparées avec et sans DSPE-pHLIP, ont été caractérisées pour taille et potentiel zêta (Tableau 2).

Selon les résultats Tableau 2, les échantillons analysés ne montrent pas de variations significatives ni en taille ni en potentiel zêta, indépendamment de la présence de pHLIP.

Les gammes de taille rapportées ont été confirmées par une technique différente, la cryo-MET (Fig. 1).

Images cryo-MET représentatives de niosomes et liposomes revêtus de pHLIP. Images de niosomes NioSpan20-pHLIP (a) et liposomes LipoDMPC-pHLIP (b) à ×10 000 et liposomes LipoDMPC-pHLIP (c) à ×40 000

La structure interne des niosomes/vésicules avec et sans DSPE-pHLIP a été déterminée par expériences SAXS. Les spectres d'intensité SAXS, Fig. 2, sont différents, indiquant que chaque système a des particularités.

Spectres SAXS. Spectres d'intensité des niosomes/vésicules sans (symboles noirs ouverts) et avec DSPE-pHLIP (symboles colorés)

Les niosomes base Tween20 sont unilamellaires, tandis que les vésicules DMPC montrent un certain degré de multilamellarité (comme liposomes), indiqué par le pic caractéristique à q ≅ 1 nm⁻¹, correspondant à distance interlamellaire 6 nm (environ 5 nm bicouche lipidique et 1 nm eau). Les vésicules base Span20 sont définitivement multilamellaires, avec pic caractéristique à q = 1,6 nm⁻¹ correspondant à distance interlamellaire 3,8 nm, correspondant au double de la longueur de la molécule Span20. Les résultats indiquent que la coque multicouche des vésicules Span20 est composée de bicouches adjacentes avec presque pas d'eau interlamellaire.

La présence de DSPE-pHLIP (fraction molaire < 1 %) n'affecte pas dramatiquement les systèmes. L'intensité diffusée dans tout le domaine q investigué est assez similaire, indiquant fraction comparable de matériau structuré et taille globale comparable des particules vésiculaires.

Les vésicules base DMPC montrent une légère augmentation du nombre de bicouches dans le liposome, déductible par l'augmentation d'intensité du pic de Bragg à q = 1 nm⁻¹. L'insertion d'une faible fraction de chaînes DSPE C18, liées à chaque molécule de peptide, ne change pas l'épaisseur de la bicouche lipidique, principalement dictée par la grande fraction de cholestérol vis-à-vis du DMPC (environ 40-50 %). À cette concentration de cholestérol, les chaînes lipidiques sont organisées en phase liquide ordonnée (Lo), caractérisée par découplage de l'ordre positionnel latéral faible des chaînes vis-à-vis de l'ordre orientationnel élevé le long des chaînes et capable d'héberger quelques chaînes C18 sans changement structural [36]. Les vésicules multicouches base Span20 n'affichent aussi aucun changement de structure interne.

Dans le système Tween20 + pHLIP, une petite quantité de cristallites de cholestérol est présente, montrée par le pic net typique à q = 1,84 nm⁻¹ (distance caractéristique 3,41 nm), et la structure vésiculaire est inchangée. La présence de quelques microcristallites a souvent été trouvée associée aux niosomes base Tween [37] en quantité dépendant de la composition, procédure de préparation, et purification. En Fig. 2, les deux spectres expérimentaux de Tween20 et Tween20 + pHLIP sont montrés avec les courbes d'ajustement obtenues en modélisant la bicouche fermée sphériquement avec trois coquilles concentriques : têtes externes, chaînes, têtes internes. La taille moyenne d'ajustement des vésicules est ~168 nm dans les deux systèmes, accord avec DDL. Les paramètres structuraux sont identiques pour les deux bicouches fermées (voir Fichier additionnel 1: Figure S1 et Tableau S2) sauf pour la coquille externe : en présence de DSPE-pHLIP, une légère diminution (5 %) de la densité électronique des têtes est observée (de 0,42 à 0,40 e/ų), avec augmentation de la rugosité de la couche. Ce résultat indique que l'addition de DSPE-pHLIP affecte principalement la coquille externe des vésicules. Ceci est cohérent avec une image où les chaînes C18 DSPE s'insèrent dans la bicouche et ancrent le peptide à la surface vésiculaire, parmi les têtes polyéthylène-glycol étendues et ramifiées. Nous notons que la capacité du peptide pHLIP lui-même (non lié aux lipides) à interagir avec la surface externe des vésicules à pH élevé et s'insérer dans la bicouche à pH bas a été récemment observée par SAXS pour bicouches phospholipidiques insaturées [38]. Dans cette étude, la fraction molaire de peptide est significativement plus faible et le peptide est lié aux lipides, le but étant de concevoir des nanovecteurs pHLIP-revêtus pH-sensibles. L'association pHLIP est guidée par l'interaction hydrophobe des chaînes C18 DSPE conjuguées s'insérant dans la région hydrophobe du nanovecteur. Le peptide pHLIP est ancré et se trouve dans la région des têtes externes, prêt à interagir avec membranes cibles à pH acide et/ou libérer le contenu du nanovecteur après réarrangement de la bicouche en environnement pH bas.

Pour investiguer si la présence de pHLIP pouvait affecter les propriétés microrhéologiques de la bicouche (fluidité, microviscosité, polarité), une caractérisation de la coque lipophile a été menée. Les études étaient conduites avec la sonde fluorescente pyrène, ajoutée aux échantillons au début de la préparation. Du fait de sa nature lipophile, il s'insère dans la bicouche vésiculaire et informe sur la polarité et microviscosité de l'environnement membranaire.

Comme Tableau 3, dans les trois séries d'échantillons, les valeurs de polarité diminuent juste légèrement en présence de pHLIP comparé aux vésicules sans pHLIP, tandis que les valeurs de microviscosité montrent une augmentation triple, pour toutes vésicules.

La bicouche était aussi caractérisée par mesures d'anisotropie de fluorescence d'une autre sonde lipophile, DPH, incorporée dans les lipides. Ces mesures reflètent le mouvement de la sonde et son orientation dans la bicouche, informant sur la fluidité qui peut affecter la capacité des vésicules à libérer leur contenu [29]. Les valeurs d'anisotropie sont inversement proportionnelles à la fluidité membranaire. Donc, valeur élevée correspond à ordre structural élevé et/ou faible fluidité, comme en phase liquide ordonnée [30].

Les valeurs d'anisotropie pour chaque échantillon sont Tableau 3. Les données indiquent que la présence de DSPE-pHLIP dans les vésicules augmente la fluidité membranaire, l'anisotropie de fluorescence diminuant. Il est connu que la fluidité de la bicouche est affectée non seulement par l'ordre et l'organisation latérale des chaînes apolaires mais aussi par les têtes polaires [31]. Les résultats SAXS sur les trois systèmes montrent que les molécules DSPE-pHLIP affectent principalement la région des têtes, causant éventuellement un empaquetage différent des têtes polaires. Les résultats structuraux semblent correspondre aux propriétés microrhéologiques des bicouches en présence de DSPE-pHLIP associé comme révélé par l'insertion de deux sondes différentes. Résultats montrent une microviscosité accrue révélée par pyrène, sonde qui peut s'insérer près de la région externe (log P pyrène = 4,88). D'autre part, DPH est supposé enfoui dans le cœur des bicouches, orienté parallèle à l'axe des chaînes acyles ou contraint au centre de la bicouche, parallèle à la surface. Il est largement sensible à la réorientation angulaire des chaînes acyles amphiphiles [39]. La fluidité accrue, révélée par DPH, pourrait être liée à l'effet d'insertion des chaînes DSPE parmi les autres chaînes acyles et à l'effet de partition du pHLIP dans la région des têtes polaires, changeant les propriétés d'empaquetage des tensioactifs (Fig. 3).

Représentation des interactions pHLIP avec membrane vésiculaire

D'autres études de caractérisation ont été menées sur les préparations examinées. Tous les échantillons, préparés avec et sans pHLIP, ont été stockés 90 jours à 4 °C pour évaluer la stabilité des vésicules dans le temps, en mesurant variations de taille et potentiel zêta (Fichier additionnel 1: Figure S2). Aucunes variations significatives de taille et potentiel zêta n'ont été observées ; donc tous les préparations examinées sont stables stockées à 4 °C.

De plus, la stabilité des échantillons a été examinée en présence de 90 % (v/v) sérum humain stocké à 37 °C pendant 3 h (Fichier additionnel 1: Figure S3).

Au contact du sérum humain, les vésicules Tween20 montraient une augmentation de taille, bien que restant sous 300 nm. La taille et les valeurs PDI étaient mesurées constantes sur l'expérience de 3 h, suggérant que les vésicules en suspension restaient intactes.

Les deux échantillons Span20 au contact du sérum humain montraient une augmentation de taille, surtout la préparation avec pHLIP, tandis que les valeurs PDI suggèrent une distribution de taille homogène (données non montrées). Cet événement peut être dû à l'absorption de protéines plasmatiques sur la surface niosomale, par interactions électrostatiques, sans toutefois entraîner de disruption vésiculaire. Cette hypothèse est soutenue par la diminution du potentiel zêta après contact avec sérum humain. Ce phénomène survient quand le potentiel zêta atteint des valeurs légèrement négatives, autour de la région de neutralité, rendant le système instable, et les vésicules commencent à s'agréger.

Comme Tween20, les vésicules DMPC montrent une augmentation de taille par rapport à l'échantillon pré-contact. Cependant, cette variation s'est avérée non-significative et les valeurs de taille maintenues sous 280 nm (DMPC) ou sous 240 nm (DMPC + pHLIP).

La capacité de libération a été évaluée pour échantillons préparés avec et sans pHLIP en suivant la quantité de calcéine (sonde hydrophile) libérée des vésicules dans le temps.

Les études étaient à 37 °C pendant 24 h, exposant les échantillons purifiés soit à tampon HEPES soit à sérum humain. Comme Fig. 4, les profils de libération de calcéine sont très similaires pour Tween20 et Tween20-pHLIP en tampon HEPES ou sérum humain.

Profil de libération de calcéine. NioTween20 et NioTween20-pHLIP en contact avec tampon HEPES (a) ou sérum humain (b)

La quantité libérée de calcéine était entre 30 et 50 %, indiquant aucune différence de capacité de libération entre échantillons avec et sans pHLIP.

Mêmes résultats pour échantillons Span et DMPC (données non montrées).

Des profils de libération comparables ont été rapportés pour différents nanovecteurs stimuli-réponsifs, comme cubosomes thermosensibles [40] ou nanovecteurs auto-assemblés polymériques (SANs) [41, 42].

En conclusion, les différences physico-chimiques observées en microviscosité et fluidité pour échantillons avec et sans pHLIP (Tableau 3) n'affectent pas leurs capacités de libération (Fig. 4), selon l'évidence que l'insertion de molécules DSPE-pHLIP affecte principalement la région des têtes. Ces données concordent avec résultats antérieurs montrant qu'à pH neutre et élevé, pHLIP est lié à la surface de liposomes en 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) et n'induit ni fusion ni fuite membranaire.

Conclusion

Cette étude confirme la possibilité de préparer des vésicules décorées pHLIP. Les échantillons sont stables stockés à 4 °C pendant au moins 3 mois et en présence de sérum. De plus, les nanovecteurs proposés peuvent piéger une sonde hydrophile et moduler sa libération.

Les vésicules pHLIP ont été pleinement caractérisées pour obtenir une compréhension fondamentale des caractéristiques des nanovecteurs et faciliter la conception rationnelle de nanovecteurs sensibles à l'acidité.

L'association pHLIP est guidée par l'interaction hydrophobe des chaînes C18 DSPE conjuguées s'insérant dans la région hydrophobe du nanovecteur. Le peptide pHLIP est ancré et se trouve dans la région des têtes externes, prêt à interagir avec membranes cibles à pH acide et/ou libérer le contenu du nanovecteur après réarrangement de la bicouche en environnement pH bas.

Selon ces résultats, les vésicules décorées pHLIP proposées pourraient être utiles pour obtenir une libération prolongée (modifiée) de substances biologiquement actives pour cibler tumeurs et autres tissus malades acides.

Abréviations

Chol :

Cholestérol

Cryo-MET :

Microscopie électronique à transmission cryogénique

DDL :

Diffusion dynamique de la lumière

DMPC :

1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DPH :

Diphenylhexatriène

pHLIP :

Peptide d'insertion à pH bas

SAXS :

Diffusion des rayons X aux petits angles

Span20 :

Sorbitan monolaurate

Tween20 :

Polyoxyéthylène sorbitan monolaurate