Nanoparticules theranostiques photo-chimio ciblées tumeur à haute efficacité : artésunate-chargé, ICG-conjugué albumine sérique humaine

Résumé

Nous rapportons une plateforme theranostique tumeur-spécifique qui combine quatre agents cliniquement approuvés — artésunate (Arte), albumine sérique humaine (HSA), acide folique (FA) et vert indocyanine (ICG) — en une seule nanoparticule (FA-IHA NPs). Ces nanoparticules exhibent une stabilité photo- et physicochimique exceptionnelle. L'ICG confère une fluorescence proche infrarouge (NIR) pour l'imagerie et confère des capacités thérapeutiques photothermique (PTT) et photodynamique (PDT) sous un seul laser 808 nm. Simultanément, l'irradiation 808 nm déclenche une libération contrôlée d'Arte, amplifiant l'efficacité chimiothérapeutique. Des études in vitro et in vivo démontrent une absorption cellulaire rapide et une accumulation tumorale sélective, vérifiées par microscopie confocale et imagerie NIR chez des souris xénogreffées HepG2. Une seule session d'irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm²) combinée aux FA-IHA NPs supprime complètement la croissance tumorale sans récidive. Ces résultats établissent les FA-IHA NPs comme plateforme prometteuse pour la traduction clinique de la photo-chimiothérapie guidée par l'image.

Contexte

La photo-chimiothérapie guidée par l'image (IGPC) a émergé comme stratégie convaincante pour l'oncologie personnalisée, mariant localisation tumorale précise avec traitement multimodal tout en minimisant les dommages collatéraux (1-4). Une plateforme IGPC réussie doit être : (i) multifonctionnelle, intégrant modalités diagnostiques et thérapeutiques ; (ii) biocompatible, stable et tumor-sélective (5-8). L'imagerie par fluorescence, en raison de sa haute sensibilité et résolution temporelle favorable, est communément employée pour la guidance en temps réel (9-16).

La thérapie photothermique (PTT) et la thérapie photodynamique (PDT) peuvent être unifiées sous irradiation NIR, délivrant à la fois chaleur et espèces réactives de l'oxygène (ROS) pour ablater les cellules tumorales (17-19). Néanmoins, la monothérapie échoue souvent à éradiquer la maladie résiduelle, menant à la rechute (17-19). La chimiothérapie conventionnelle offre une cytotoxicité systémique mais souffre de non-spécificité et toxicités associées (20-22). Ainsi, l'IGPC, qui combine photothérapie localisée avec chimiothérapie ciblée, promet de surmonter ces limitations.

La nanomédecine a produit une variété de theranostiques IGPC, incluant le vert indocyanine (ICG), nanoparticules à base de métal, nanomatériaux carbonés et systèmes polymères (23-27). L'ICG, un colorant NIR approuvé FDA, est largement utilisé cliniquement pour le débit cardiaque, la fonction hépatique et l'angiographie ophtalmique (28-29). Son absorption forte à 800 nm facilite une PTT-PDT efficace. Cependant, l'ICG libre est instable, se clairance rapidement de la circulation, s'auto-décolore et manque de spécificité tumorale (31-32). L'encapsulation dans des vecteurs tels que micelles, polymères ou nanostructures protéiques a amélioré sa performance, pourtant le besoin de composites ICG plus biocompatibles et ciblés persiste (33-34).

Ici, nous avons conçu un agent IGPC ciblé tumeur en liant covalemment FA et ICG à des nanoparticules HSA, encapsulant simultanément Arte — un composé antipaludique naturel avec activité anticancéreuse prouvée contre les cancers du foie, poumon et sein (35). Les FA-IHA NPs résultants exploitent l'absorption réceptrice médiatisée par FA, l'excellente biocompatibilité de HSA et la double puissance thérapeutique de l'ICG et Arte. Ce construct multifonctionnel offre imagerie NIR, PTT-PDT et chimiothérapie à libération contrôlée, le positionnant comme plateforme versatile pour la traduction clinique.

Méthodes

Matériaux

Les réactifs incluaient EDC, NHS et Arte (≥ 99%) de Sigma-Aldrich ; DAPI et CCK-8 d'Aladdin ; NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH et NH₂-PEG₂₀₀₀-FA de Xi'an Ruixi ; DMEM et PBS de Gibco ; ICG-NHS de Dojindo. Tous les chimiques étaient utilisés tels que reçus.

Synthèse et caractérisation des FA-IHA NPs

L'Arte était dissous dans DMSO, puis ajouté à 15 mL d'eau. L'HSA (10 mg) était introduit et agité 3 h à température ambiante, suivi de réticulation avec 150 µL glutaraldéhyde 0,5%. Le mélange était dialysé contre eau distillée (PMCO 8-12 kDa) pendant 24 h pour produire Arte-HSA chargé. L'activation des groupes carboxyl de HSA avec EDC/NHS était suivie de conjugaison avec NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (3 h, 4 °C) et attachement subséquent d'ICG-NHS (30 min, RT). Les FA-ICG-HSA@Arte (FA-IHA NPs) finaux étaient purifiés par dialyse 24 h dans eau déionisée. Les efficacités de chargement d'Arte et ICG étaient quantifiées par spectroscopie UV-vis (chargement % = W₁/W₂ × 100%).

La morphologie était évaluée par MET (Hitachi). La taille hydrodynamique et le potentiel ζ étaient mesurés par DLS (Malvern Zetasizer). Les spectres d'absorbance étaient enregistrés sur un spectrophotomètre UV-vis Shimadzu. Les réponses photothermiques étaient mesurées utilisant un laser CW 808 nm (1 W/cm²) avec température monitorée par thermocouple Fluke. La photostabilité et la longévité de fluorescence étaient évaluées sur 5 cycles et 30 jours respectivement.

Libération d'Arte déclenchée thermiquement et par pH

Les FA-IHA NPs (50 µg/mL) étaient incubés à pH 6,5, pH 7,4 et pH 6,5 + NIR (808 nm, 1 W/cm², impulsion 1 min) sur 36 h. La libération d'Arte était quantifiée par UV-vis à 287 nm dans le surnageant.

Détection de la production d'oxygène singulet

Le DPBF (15 µL) était mélangé avec 1 mL de 10 µg/mL ICG ou FA-IHA NPs et irradié (808 nm, 1 W/cm², 5 min). La diminution d'absorbance à 410 nm au cours du temps reflétait la génération d'oxygène singulet.

Culture cellulaire et absorption cellulaire

Les cellules HepG2 (ATCC) étaient cultivées dans DMEM avec 10% FBS, 1% pénicilline-streptomycine à 37 °C, 5% CO₂. Pour les études d'absorption, les cellules étaient incubées avec ICG libre, IHA NPs ou FA-IHA NPs (0,05 mg/mL ICG) pendant 6 h, lavées, fixées, colorées DAPI et imagées par microscopie confocale. La cytométrie de flux quantifiait les taux d'internalisation.

Génération de ROS intracellulaires

Les cellules HepG2 (2 × 10⁵ cellules/mL) étaient traitées avec PBS, Arte, FA-HA-NPs, ICG libre, IHA-NPs ou FA-IHA NPs pendant 12 h, puis irradiées (808 nm, 1 W/cm², 5 min). DCFH-DA (5 µg/mL) était ajouté pendant 30 min, suivi de cytométrie de flux et microscopie de fluorescence pour évaluer les niveaux de ROS.

Photo-chimiothérapie combinatoire in vitro

Les cellules HepG2 (2 × 10⁴ cellules/puits) étaient traitées avec ICG libre, Arte, IHA NPs ou FA-IHA NPs (Arte 0-30 µg/mL) pendant 6 h, puis irradiées (808 nm, 1 W/cm², 5 min) ou laissées non traitées. La viabilité cellulaire était mesurée par CCK-8 après 24 h. La coloration vivant/mort (calcéine-AM/PI) confirmait la cytotoxicité via imagerie confocale.

Modèle animal et imagerie de fluorescence in vivo

Des souris Balb/c nues (n=5) étaient injectées sous-cutanément avec 1 × 10⁶ cellules HepG2. L'imagerie IVIS Spectrum (Caliper) suivait la fluorescence NIR à 10 min, 6 h, 12 h, 24 h et 48 h post-injection intraveineuse d'ICG libre, IHA NPs ou FA-IHA NPs.

Photo-chimiothérapie combinatoire in vivo

Les souris étaient randomisées en six groupes (n=5) : PBS, Arte, FA-IHA NPs, ICG + NIR, IHA + NIR, FA-IHA + NIR (dose Arte égale). L'irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm², 5 min) était appliquée à 24 h et 48 h. Les volumes tumoraux étaient enregistrés tous les 4 jours et exprimés relatifs à la ligne de base. Post-traitement, les organes majeurs étaient récoltés pour histologie H&E.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des FA-IHA NPs

La Figure 1 schématise la conception des FA-IHA NPs et le flux thérapeutique. Les nanoparticules étaient assemblées via une méthode simple, biocompatible, intégrant l'ICG pour imagerie NIR et photothérapie, et Arte pour action chimiothérapeutique.

Représentation schématique de l'utilisation des FA-IHA NPs pour la photo-chimiothérapie combinatoire guidée par l'image ciblée tumeur in vitro et in vivo

La microscopie électronique en transmission révélait des particules sphériques monodisperses (~131,2 nm). La diffusion dynamique de la lumière confirmait un diamètre hydrodynamique de 131 ± 2,3 nm dans l'eau, PBS et milieu cellulaire, avec un potentiel ζ stable de –29,2 ± 1,13 mV. La taille restait inchangée sur 7 jours, indiquant une stabilité colloïdale robuste conférée par le revêtement PEG et HSA. Les spectres UV-vis affichaient les pics caractéristiques d'Arte et ICG, confirmant le chargement réussi (Arte 98,6 ± 3,1 %, ICG 56,9 ± 2,4 %). Les spectres de fluorescence correspondaient à l'ICG libre, confirmant les propriétés photophysiques préservées.

a Image MET des FA-IHA NPs. b, c Distribution de taille et potentiel ζ des FA-IHA NPs dans l'eau, milieu cellulaire et PBS. d Changement de taille des FA-IHA NPs dans l'eau, milieu cellulaire et PBS. e Spectres d'absorbance de l'ICG libre, Arte et FA-IHA NPs. f Spectres de fluorescence de l'ICG libre et FA-IHA NPs

L'évaluation photothermique montrait que les FA-IHA NPs (contenu ICG égal) augmentaient la température de ~36 °C en 5 min sous irradiation 808 nm (1 W/cm²), tandis que l'ICG libre affichait une hausse similaire et l'eau à peine <4 °C. Les tests de photostabilité révélaient que les FA-IHA NPs maintenaient l'absorbance sur cinq cycles d'irradiation, alors que l'ICG libre perdait en intensité, soulignant l'effet protecteur de la conjugaison covalente et de l'encapsulation HSA/PEG. La longévité de fluorescence sur 30 jours à 4 °C montrait une réduction de 28 % pour les FA-IHA NPs versus 88 % pour l'ICG libre, mettant en évidence une photostabilité supérieure.

a Courbes de chauffe photothermique de l'eau, ICG et FA-IHA NPs sous irradiation laser 808 nm 5 min (1 W/cm²). b Variations de température de l'ICG et FA-IHA NPs après cinq cycles continus d'irradiation 5 min. c Changement d'absorbance des FA-IHA NPs à 780 nm avant et après cinq cycles. d Changement de fluorescence ICG et FA-IHA NPs sur 30 jours

Les essais DPBF démontraient que les FA-IHA NPs produisaient 58 % du rendement standard d'oxygène singulet en 5 min d'exposition NIR, surpassant l'ICG libre (35 %). Cette amélioration reflète l'effet synergique de la double photothérapie.

a Absorbance DPBF normalisée en présence d'ICG, FA-IHA NPs et échantillon blanc sous irradiation laser 808 nm (1 W/cm²). b Cinétiques de libération d'Arte des FA-IHA NPs sous pH 7,4 et pH 6,5 avec ou sans irradiation laser NIR respectivement

Sous conditions acides (pH 6,5) et irradiation NIR, la libération d'Arte des FA-IHA NPs augmentait de 11,6 % (pH 7,4) à 68,4 % (pH 6,5 + NIR). Les doubles déclencheurs — expansion thermique de HSA et altération de charge de surface médiatisée par protons — facilitent la libération contrôlée du médicament (37-38).

Absorption cellulaire et détection des ROS intracellulaires

L'imagerie confocale révélait une fluorescence rouge ICG prononcée dans les cellules HepG2 traitées avec FA-IHA NPs, surpassant l'ICG libre et les IHA NPs. La cytométrie de flux quantifiait un taux d'absorption de 52,3 % pour les FA-IHA NPs, nettement plus élevé que les IHA NPs (25,2 %) et l'ICG libre (3,9 %) — indication claire du ciblage récepteur médiatisé par FA (39-41).

a Images fluorescentes confocales des cellules HepG2 après incubation avec ICG libre, IHA NPs et FA-IHA NPs. Rouge et bleu représentent la fluorescence ICG et noyaux colorés DAPI respectivement. b Mesure par cytométrie de flux des intensités de fluorescence ICG dans les cellules HepG2 après incubation avec ICG libre, IHA NPs et FA-IHA NPs

La production de ROS, évaluée avec DCFH-DA, était significativement plus élevée dans les cellules traitées FA-IHA NPs suivant 5 min irradiation NIR comparé à tous les autres groupes, confirmant l'activité photodynamique améliorée (Figure 6a,b).

a Images de fluorescence de production ROS dans cellules cancéreuses traitées avec divers médicaments, et b intensité fluorescente correspondante : (1) PBS, (2) Arte, (3) FA-HA NPs, (4) ICG libre + NIR, (5) IHA NPs + NIR, et (6) FA-IHA NPs + NIR

Photo-chimiothérapie combinatoire in vitro

Les FA-IHA NPs atteignaient la plus haute hausse de température (~31 °C) parmi tous les traitements après 5 min exposition NIR, corrélant avec la performance photothermique supérieure (Figure 7a). Sans irradiation, Arte, IHA NPs et FA-IHA NPs affichaient une cytotoxicité concentration-dépendante, alors que l'ICG libre restait inerte. Post-irradiation, la viabilité cellulaire chutait dramatiquement dans le groupe FA-IHA NPs, attribuable aux effets synergiques chimiothérapie-photothermique. La coloration calcéine-AM/PI confirmait une mort cellulaire quasi-complète dans FA-IHA NPs + NIR, alors que les autres groupes retenaient des cellules viables (Figure 7d).

a Courbes de changement de température de PBS, ICG libre, IHA NPs et FA-IHA NPs cellules traitées en plaques 96 puits après 5 min irradiation NIR. b, c Viabilité cellulaire des cellules traitées avec ICG libre, Arte, IHA NPs et FA-IHA NPs sans ou avec irradiation laser 808 nm (5 min, 1 W/cm²) respectivement. d Images coloration calcéine-AM/PI double des cellules après traitement avec PBS (contrôle), PBS + NIR, FA-IHA NPs et FA-IHA NPs + NIR respectivement

Imagerie de fluorescence in vivo

L'imagerie IVIS révélait une forte fluorescence corps entier dans les 10 min post-injection de toutes formulations. La fluorescence tumorale culminait à 24 h, avec les FA-IHA NPs exhibant le signal le plus haut à chaque point temporel, confirmant l'accumulation tumorale pilotée par FA (Figure 8b). L'analyse ex vivo d'organes à 24 h montrait une absorption hépatique prédominante dans tous les groupes, cohérente avec les voies de clairance hépatique (Figure 8c).

a Images de fluorescence représentatives de souris porteuses de tumeur après injection intraveineuse avec ICG libre, IHA NPs et FA-IHA NPs. Les cercles pointillés noirs indiquent la région tumorale. b Analyse quantitative in vivo du signal de fluorescence dans les régions tumorales de souris traitées avec ICG libre, IHA NPs et FA-IHA NPs en fonction du temps d'injection. c Le signal de fluorescence des organes majeurs incluant cœur, foie, rate, poumons et rein

Photo-chimiothérapie combinatoire in vivo

L'imagerie thermique à 24 h post-injection sous irradiation NIR montrait la plus grande augmentation de température (~22,1 °C) pour les FA-IHA NPs, confirmant une conversion photothermique puissante (Figure 9a,b). Deux sessions d'irradiation (jour 0 et jour 2) ont mené à une régression tumorale complète dans le groupe FA-IHA + NIR, sans rechute sur 90 jours et un taux de survie de 100 %, alors que tous les autres groupes n'ont pas atteint de suppression soutenue (Figure 9c,d). L'examen histologique n'a révélé aucune pathologie organique significative dans le groupe FA-IHA + NIR, soulignant une toxicité systémique négligeable (Figure 10).

a Températures de région tumorale chez souris porteuses de tumeur après injection intraveineuse de PBS, ICG, IHA NPs et FA-IHA NPs à 24 h sous 5 min irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm²). b Images thermiques de souris porteuses de tumeur après injection intraveineuse de PBS, ICG, IHA NPs et FA-IHA NPs à 24 h sous 5 min irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm²). c Profil de croissance xénogreffe HepG2 après injection intraveineuse de PBS, Arte, ICG, IHA NPs et FA-IHA NPs avec ou sans 5 min irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm²). d Taux de survie de souris porteuses de tumeur après injection intraveineuse avec PBS, Arte libre, ICG, IHA NPs et FA-IHA NPs avec ou sans 5 min irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm²)

Sections tissulaires H&E colorées des organes majeurs, incluant cœur, foie, rate, poumons et rein de souris traitées avec PBS et FA-IHA NPs