Nanoparticules de curcumine ciblées activées par ultrasons focalisés de faible intensité pour le théranostique pH-réactif du cancer de l'ovaire

Résumé

Nous avons développé une nanoplatforme simple et polyvalente utilisant des nanocages de ferritine sensibles au pH, co-chargés avec le médicament anticancéreux curcumine (Cur) et le perfluorohexane liquide (PFH) au cœur, et conjugués à la molécule de ciblage tumoral FA (acide folique) à l'extérieur de la coquille, dénommée FA-FCP. Les FA-FCP synthétisés ont un diamètre moyen de 47 nm, des propriétés physico-chimiques stables et favorables dans différents milieux, et une excellente biocompatibilité et biosécurité in vivo et in vitro. Sous ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU) et à pH = 5,0, FA-FCP libère une grande quantité de médicament (53,2 %) en 24 h. Après 4 min de LIFU (7 W), FA-FCP offre des capacités d'imagerie ultrasonore à contraste renforcé à pH = 5,0. Grâce à l'endocytose médiée par le récepteur FA, FA-FCP pénètre efficacement dans les cellules et se relocalise dans les lysosomes. Dix-huit heures après injection de FA-FCP, la tumeur stimulée par LIFU montre une image ultrasonore à contraste renforcé. Les expériences in vivo et in vitro montrent que l'association FA-FCP + LIFU a un effet thérapeutique significatif sur la tumeur. Ces résultats démontrent que FA-FCP combiné au LIFU externe et à l'environnement acide endogène offre de puissantes fonctions théranostiques et une nouvelle option non invasive et intégrée de théranostique tumoral.

Introduction

Le cancer de l'ovaire est une maladie hautement métastatique et létale à taux de mortalité élevé. Comme les symptômes cliniques précoces sont peu évidents, les cellules tumorales sont déjà hautement métastatiques au moment du diagnostic chez la plupart des patientes. Les traitements couramment utilisés sont la chirurgie cytoréductrice combinée à la chimiothérapie, et le taux de survie à 5 ans pour les stades avancés reste très faible. Il est urgent de développer de nouvelles stratégies de traitement et de diagnostic pour améliorer la survie globale. Récemment, les nanoplatformes combinant thérapie ciblée et imagerie diagnostique ont offert une alternative pour le traitement efficace des tumeurs.

Ces dernières années, les nanoplatformes à réponse acoustique (ARN) sont largement utilisées en recherche sur le traitement et diagnostic tumoral. Les ARN sont généralement conçues comme microbulles (MB) ou nanoparticules (NP). Comparées aux MB, les NP ont une taille plus petite, une perméabilité plus élevée, un cycle pharmacocinétique plus long, une meilleure stabilité et une modification de surface plus aisée. Divers fluorocarbures liquides à changement de phase — perfluoropentane (PFP), perfluorohexane (PFH), perfluorooctylbromure (PFOB) — sont couramment utilisés pour obtenir la réponse acoustique. Sous stimulation par ultrasons focalisés externes, ces fluorocarbures produisent des bulles, voire éclatent, par vaporisation de gouttelettes acoustique (ADV), conférant aux ARN des capacités de contraste ultrasonore renforcé. Parmi eux, le PFP a un point d'ébullition bas (29,2 °C) et risque d'embolie gazeuse ; le PFOB a un point d'ébullition très élevé (144 °C) et nécessite des ultrasons d'intensité ultra-élevée. Le PFH, avec son point d'ébullition de 56 °C, est considéré comme matériau de changement de phase idéal. Cependant, le PFH est hydrophobe ; l'encapsuler dans des nanoparticules le rend hydrosoluble. Divers matériaux — liposomes, PLGA, mésoporeux organiques, polymères organiques — ont été rapportés pour encapsuler les fluorocarbures liquides. Ces vecteurs peuvent aussi être chargés en médicaments anticancéreux, conférant aux ARN des fonctions chimiothérapeutiques et une libération de médicament contrôlée par acoustique. Bien que ces nanoplatformes acoustiquement réactives montrent de bonnes capacités intégrées de diagnostic et traitement tumoral, la biocompatibilité des nanovecteurs reste une préoccupation pour la translation clinique. Récemment, les nanocages de ferritine sans fer sont largement utilisés comme vecteurs de médicaments car ce sont des protéines endogènes avec une sensibilité au pH marquée. Ils se décomposent en milieu acide et se réassemblent en milieu alcalin, offrant une haute biocompatibilité et une capacité de chargement et libération contrôlée.

Dans cette étude, la ferritine a servi de vecteur pour charger PFH et curcumine (Cur), et la molécule de ciblage tumoral FA a été greffée à la surface de la protéine pour obtenir une nanoplatforme multifonctionnelle (FA-FCP). La curcumine, polyphénol naturel extrait du curcuma, a des effets anticancéreux favorables mais une faible solubilité aqueuse. FA-FCP améliore la solubilité aqueuse de PFH et Cur, présente une stabilité physiologique élevée dans différents milieux, et une biocompatibilité et biosécurité favorables in vivo et in vitro. Sous LIFU et pH = 5,0, FA-FCP libère beaucoup de médicament en 24 h (53,2 %). Après 4 min de LIFU (7 W), FA-FCP à pH = 5,0 fournit un contraste ultrasonore renforcé. Grâce à l'endocytose médiée par le récepteur FA, FA-FCP pénètre aisément dans les cellules et se relocalise dans les lysosomes. Dix-huit heures après injection, le site tumoral stimulé par LIFU montre un contraste ultrasonore renforcé. Les expériences in vivo et in vitro montrent un effet significatif sur le traitement tumoral. Ces résultats démontrent que l'avantage non invasif, le ciblage ligand/récepteur, la transition de phase ou l'éclatement déclenchés par LIFU, et la libération précise de médicament font de FA-FCP une nanoplatforme théranostique tumorale prometteuse.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Ferritine (FRT), acide folique (FA), perfluorohexane (PFH) achetés chez Sigma (St. Louis, MO, USA). Curcumine (Cur) chez Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Chine). NH₂-PEG₂₀₀₀-FA et NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH fournis par Xi'an Ruixi Biotechnology Co. (Chine). EDC et NHS de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Kit CCK-8 de Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japon). DMEM, PBS, pénicilline-streptomycine, trypsine-EDTA, sérum fœtal bovin (FBS) de Gibco (Grand Island, NY, USA).

Préparation de FA-FCP

Pour préparer FA-FCP : (1) 10 mg FRT dissous dans 10 ml eau. 10 mg Cur dissous dans 0,3 ml DMSO. Les deux solutions et 1 ml PFH mélangés à pH 5,0 sous ultrasonication bain de glace 30 min. Puis pH ajusté à 7,4 pour obtenir FRT chargé en Cur et PFH (FCP). (2) Molécule cible FA conjuguée covalentement à FCP par méthode carbodiimide [8] : 5 mg NH₂-PEG₂₀₀₀-FA ajoutés à la solution FCP avec EDC (5 mg/ml) et NHS (20 mg/ml). Après 3 h réaction à température ambiante sous agitation légère, purification par dialyse contre eau distillée (seuil 12 kDa) pendant 24 h, donnant FA-FCP. Le taux de chargement de Cur détecté par spectrophotométrie UV-Vis à 426 nm, calculé comme (Aa−Ab)/Ac.

Caractérisations

Tailles et potentiels zêta par Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK). Morphologie par MET (Hitachi, Japon) et AFM (Agilent 5500LS). Prise cellulaire par microscopie confocale (LEXT OLS4100, Olympus, Japon) et cytométrie de flux (BD, Franklin Lakes, NJ). Spectres d'absorption par spectrophotomètre UV-Vis (UV1800, Shimadzu, Japon).

Culture cellulaire et modèle animal

Ligne cellulaire cancéreuse ovarienne humaine SK-OV-3 fournie par Shanghai Institute of Cell Biology, Académie chinoise des sciences. Culture en DMEM + 10 % FBS + 1 % pénicilline-streptomycine, 5 % CO₂, 37 °C. Souris nu/nues Balb/c (femelles, ~5 semaines) de Vital River Laboratory Animal Technology (Pékin, Chine). Modèle tumeur SK-OV-3 : 1×10⁶ cellules injectées sous-cutanément dans le dos droit. Toutes procédures conformes aux directives du Sichuan Academy of Medical Sciences et approuvées par son comité d'éthique.

Libération de Cur déclenchée par pH/LIFU

Solution aqueuse FA-FCP divisée en quatre portions dans un sac de dialyse (PM 5000), dialysées dans 10 ml PBS pH 5,0 et 7,4. Après 3 h, traitement avec ou sans LIFU (7 W, 5 min) (cycle 50 %, mode onde pulsée). À intervalles réguliers, 1 ml dialysat prélevé et remplacé par volume égal de solution tampon même pH. Concentration de Cur mesurée par spectromètre UV-Vis.

Propriétés ADV et fonction imagerie US de FA-FCP

FA-FCP à pH 5,0 et 7,4 irradiés par LIFU de puissances 5, 6, 7 W pendant 3, 4, 5 min dans modèle gel d'agarose, puis images US observées par échographe (Esaote Mylab 90, Italie) fréquence 5–12 MHz, indice mécanique (MI) 0,06. Intensité US de la région d'intérêt analysée par ImageJ.

Capacité de ciblage de FA-FCP

Pour démontrer le ciblage in vitro, FITC a marqué les nanoparticules : 1 mg FITC dans 1 ml DMSO mélangé avec FCP et FA-FCP 30 min agitation douce. Dialyse overnight dans eau déionisée pour éliminer FITC et DMSO libres, donnant nanoparticules marquées FITC. Cellules cultivées 24 h, puis nanoparticules marquées ajoutées 3 h incubation. Lavage PBS ×3, coloration DAPI 5 min, LysoTracker Red 10 min, fixation paraformaldéhyde 4 % 15 min. Observation microscopie confocale. Signaux fluorescents intracellulaires mesurés et analysés par cytométrie de flux.

Circulation sanguine et accumulation tumorale de FA-FCP

Cur libre et FA-FCP (même concentration Cur) injectés par voie intraveineuse chez souris normales. Sang prélevé à divers temps au plexus orbitaire, lysé. Concentration Cur dans sang déterminée par spectres d'absorption UV-Vis de chaque échantillon sanguin solubilisé, exprimée en % dose injectée par gramme de tissu (ID%/g). Contenu FA-FCP dans tumeur chez souris porteuses : après 0, 1, 6, 12, 18, 24 h injection IV FA-FCP, tissus tumoraux prélevés, pesés, digérés par eau régale 24 h. Concentration Cur déterminée par UV-Vis, exprimée en ID%/g.

Efficacité anticancéreuse in vitro et in vivo

In vitro : cellules traitées PBS, Cur, FA-FCP, FCP+LIFU, FA-FCP+LIFU (même dose Cur 5 mg/kg) 3 h, puis irradiation LIFU (5 min, 7 W). Incubation 21 h supplémentaires. Viabilité par test CCK-8. In vivo : souris porteuses divisées en 5 groupes (n=6), injection IV : sérum physiologique (témoin), Cur libre, FA-FCP, FCP+LIFU, FA-FCP+LIFU. Pendant 24 jours, volume tumeur et poids corporel suivis tous les 3 jours. Volume tumeur = longueur×largeur²/2. Croissance tumorale montrée par volumes relatifs V/V₀ (V₀ = volume initial).

Évaluation de la biosécurité

Cellules SK-OV-3 ensemencées plaque 96 puits (1×10⁴ cellules/puits) 24 h. Concentrations variées (0, 20, 40, 100, 200, 500 μg/ml) FA-FRT-PFH cultivées avec cellules. Après 24 h, milieu DMEM + 10 % CCK-8 20 min incubateur. Absorbance 450 nm par lecteur multimode (Thermo Scientific) pour viabilité cellulaire. Organes majeurs (cœur, foie, rate, poumon, rein) de souris saines à 25 jours post-injection FA-FCP prélevés, analysés par coloration hématoxyline-éosine (H&E). Images observées microscopie optique.

Analyse statistique

Données présentées moyenne ± écart-type. Traitement statistique SPSS 22.0. Test t de Student pour significativité entre deux groupes. p < 0,05 = différence significative.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation de FA-FCP

Le Schéma 1 illustre la synthèse de FA-FCP et son application en imagerie ultrasonore tumorale et chimiothérapie combinée US in vitro et in vivo. L'agent théranostique multifonctionnel FA-FCP a été préparé par auto-assemblage simple et biocompatible. Les images MET et AFM (Fig. 1a, inset et Fig. S1 supplémentaire) montrent une structure sphérique. L'analyse DLS indique un diamètre moyen ~47 nm et potentiel zêta moyen ~−37 mV dans l'eau (Fig. 1a, b). Après 4 semaines dans l'eau, PBS, sérum physiologique, FBS, FA-FCP affiche une stabilité de taille (Fig. 1c), indiquant une excellente stabilité physiologique, probablement due au revêtement PEG et à la nature de la FRT [32]. Le spectre UV-Vis-NIR de FA-FCP montre le pic d'absorption de Cur, prouvant sa présence. Taux de chargement Cur = 125,8 ± 2,1 %.

La Fig. 2 montre le profil de libération de Cur depuis FA-FCP sous différents pH avec ou sans LIFU. Sans LIFU, libération à pH 5,0 ~30 % sur 24 h, significativement plus élevée qu'à pH 7,4 (5,3 %). Sous LIFU (7 W, 4 min), libération à pH 5,0 et 7,4 augmente fortement. Mais à pH 5,0, libération (50 %) est nettement supérieure sur 24 h. Cette propriété rend FA-FCP très utile dans le microenvironnement tumoral. Cette excellente libération est due à : (1) FRT en condition acide se désassemble et ouvre la nanocage pour libérer le Cur chargé ; (2) LIFU induit une transition de phase instantanée permettant au Cur de s'échapper de la coquille poreuse élargie de façon stable.

Effet ADV in vitro de FA-FCP

FA-FCP exposé à LIFU puissances 5, 6, 7 W, durées 3–5 min à pH 7,4 ou 5,0 pour évaluer les meilleures conditions. L'intensité US représente l'effet ADV. Selon images US (Fig. 3a, b) et valeurs moyennes de niveau de gris (Fig. 3c, d), l'effet ADV montre une tendance temps/puissance-dépendante à pH 7,4, pic à 7 W pendant 5 min. À pH 5,0, pic à 7 W pendant 4 min. Paramètres < 5 W / 3 min : bulles insuffisantes pour optimiser images US ; > 7 W / 4 min : la plupart des bulles générées s'effondrent et disparaissent. Résultats indiquent qu'une stimulation certaine est essentielle pour déclencher l'effet ADV de FA-FCP : 7 W puissance et 4 min durée à pH 5,0.

Capacité de ciblage de FA-FCP

Colorant FITC a marqué les nanoparticules. Selon Fig. S2 supplémentaire, l'intensité fluorescente de FCP et FA-FCP marqués FITC à même concentration ne diffère pas significativement, indiquant que la différence de quantité de FITC marqué n'influence pas l'expérience de prise cellulaire. Images fluorescence et analyse FCM montrent que FCP entre dans les cellules avec taux prise 19,5 % (Fig. 4a, b), possiblement grâce à des récepteurs ferritine à la surface cellulaire favorisant l'internalisation. Après conjugaison FA, FA-FCP montre signal fluorescence élevé dans cellules avec taux prise 44,3 %, et effondrement du taux (13,8 %) quand cellules prétraitées avec FA libre (Fig. 4a, b). Résultats indiquent que la conjugaison FA augmente largement le taux de prise de FA-FCP par endocytose médiée par récepteur FA.

La localisation organellaire de FA-FCP a été étudiée avec colorant lysosome-spécifique (Lyso-Tracker Red). Fig. 4c : cellules traitées FA-FCP et Lyso-Tracker Red montrent fluorescence verte et rouge forte dans le cytoplasme. Après fusion vert/rouge, fluorescence jaune intense visible dans le cytoplasme, indiquant que FA-FCP se relocalise dans les lysosomes (pH ≈ 5,0), favorable pour déclencher la libération du médicament dans les cellules.

Circulation sanguine et accumulation tumorale de FA-FCP

Fig. 5a : demi-vie FA-FCP ~7,31 h (augmentation 8 fois) vs Cur libre, probablement grâce au revêtement PEG et encapsulation FRT. Cette demi-vie prolongée dans la circulation sanguine améliore la rétention du médicament, facilitant son accumulation au site tumoral [32, 33]. Fig. 5b : accumulation dynamique de Cur libre et FA-FCP dans tumeur de 0 à 24 h post-injection. FA-FCP montre accumulation maximale à 18 h ; Cur libre pic ~1 h. Résultats indiquent que FA-FCP a une accumulation tumorale significativement supérieure à Cur libre, possiblement due à l'effet de perméabilité et rétention accrues (EPR) et au ciblage actif médié par récepteur FA [34, 35].

Imagerie US in vivo

Tumeurs de souris nu/nues en 4 groupes (témoin+LIFU, FCP+LIFU, FA-FCP+LIFU, FA-FCP sans LIFU) observées avec ou sans exposition LIFU (7 W, 4 min) pour explorer le potentiel ADV in vivo. Fig. 6a : aucun signal US évident dans tumeur sous LIFU pour groupe témoin. À 18 h post-injection, signal US significativement plus fort dans tumeur pour groupe FA-FCP+LIFU vs FCP+LIFU et FA-FCP sans LIFU (Fig. 6a, b). Résultats démontrent que FA-FCP+LIFU renforce le contraste US de la tumeur.

Thérapie anticancéreuse in vitro et in vivo

Cytotoxicité in vitro de FA-FCP par test CCK-8. Fig. 7a : viabilité cellulaire de tous groupes montre patrón concentration Cur-dépendant. Sans LIFU, FA-FCP montre inhibition viabilité supérieure à Cur libre à toutes concentrations, possiblement grâce à l'effet ciblage FA. Cependant, inhibition viabilité FA-FCP+LIFU significativement supérieure à FP+LIFU, FCP+LIFU et FA-FCP sans LIFU, indiquant que FA-FCP combiné à LIFU offre meilleure efficacité anti-tumorale. Ceci est dû à la présence de LIFU et l'environnement acide du lysosome, qui induisent libération du médicament et effet de cavitation, et l'effet ciblage cellules tumorales médié par FA [36,37,38].

Effet anticancéreux in vivo de FA-FCP étudié sur souris porteuses. Selon accumulation tumorale FA-FCP, LIFU réalisée 18 h après injection IV toutes les 2 jours, 3 fois total depuis jour 1. Fig. 7b, c : volume tumoral relatif groupe FA-FCP+LIFU diminue significativement vs témoin, Cur, FA-FCP, FP+LIFU, FCP+LIFU après 24 jours. Poids tumeur groupes FA-FCP et FCP+LIFU significativement inférieur à témoin et Cur, encore plus inhibé groupe FA-FCP+LIFU. Aucune perte significative de poids corporel pendant traitement (Fig. 7d). L'excellent effet anti-tumoral FA-FCP+LIFU dû à l'agrégation ciblée FA-FCP dans tumeur et capacité libération médicament acoustique/pH-réactive [39,40,41]. Efficacité thérapeutique renforcée aussi expliquée par clairance retardée nanoparticules au site tumoral due à demi-vie prolongée FA-FCP dans circulation [42].

Biocompatibilité in vitro et in vivo

Biocompatibilités évaluées par test CCK-8 et coloration H&E. Fig. 8a, b : viabilité cellules avec FA-FP porteur médicament et puissance LIFU 0–8 W toutes > 90 %, indiquant aucune cytotoxicité significative in vitro. Fig. 8c : images H&E organes majeurs souris traitées FA-FCP+LIFU, sans changements histologiques vs groupe témoin. Résultats démontrent haute biocompatibilité FA-FCP in vitro et in vivo.

Conclusion

En résumé, nous avons préparé un FA-FCP multifonctionnel chargé en médicament anticancéreux Cur et molécule de ciblage tumoral FA, utilisant des nanocages de ferritine, conférant capacité imagerie US à contraste renforcé et ciblage précis en chimiothérapie. Le FA-FCP nouvellement synthétisé montre haute biocompatibilité in vitro et in vivo. De plus, FA-FCP présente excellente capacité ciblage tumoral, libération Cur déclenchée acoustique/pH, et transition de phase acoustique-réactive par LIFU pour imagerie ultrasonore. Compte tenu de ces propriétés uniques, FA-FCP peut s'appliquer comme facteur significatif d'inhibition tumorale sans toxicité systémique. On s'attend à ce qu'une telle nanoplatforme théranostique novatrice et biocompatible intègre imagerie ultrasonore et efficacité thérapeutique améliorée pour fournir un paradigme prometteur de traitement du cancer.

Disponibilité des données et matériaux

Les conclusions de ce manuscrit sont basées sur les données (texte principal et figures) présentées dans cet article.

Abréviations

US :

Ultrasons

FA :

Acide folique

FRT :

Ferritine

PFH :

Perfluorohexane

LIFU :

Ultrasons focalisés de faible intensité

ADV :

Vaporisation de gouttelettes acoustique

FITC :

Fluorescéine isothiocyanate

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8

FBS :

Sérum fœtal bovin

EDC :

1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide

NHS :

N-hydroxysuccinimide

Cur :

Curcumine