Nanosensibilisateur magnétique ciblant HER2 améliore l'IRM in vivo pour les cancers HER2-positifs

Résumé

L'objectif de cette étude était le développement d'un agent de contraste ciblable pour le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM) avec une haute sensibilité magnétique. Un nanosensibilisateur magnétique modifié par un aptamère anti-HER2 (Apt_HER2-MNS) a été préparé par conjugaison avec des aptamères thiol-modifiés en 5' et des nanocristaux magnétiques (MNC) maléimidylés. Les caractéristiques physicochimiques et la capacité de ciblage de l'Apt_HER2-MNS ont été confirmées, et l'affinité de liaison (K_d) sur la protéine HER2 de l'Apt_HER2-MNS était de 0,57 ± 0,26 nM. La capacité d'amélioration du contraste IRM in vivo a également été vérifiée sur des modèles murins xénogreffés de cellules cancéreuses HER2+ (NIH3T6.7) (n = 3) sur un instrument IRM clinique 3T. L'expérience contrôle a été réalisée en utilisant des MNC non marqués. Les résultats indiquaient qu'une amélioration de contraste allant jusqu'à 150 % était atteinte au niveau de la région tumorale dans les images IRM pondérées T2 après l'injection de l'agent Apt_HER2-MNS chez les souris ayant reçu les cellules NIH3T6.7.

Contexte

Le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2), qui appartient à la famille du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), joue un rôle clé dans les maladies humaines malignes et est surexprimé dans environ 30 % des cancers du sein humains [1] et dans de nombreux autres types de cancers, y compris les carcinomes de l'estomac, de la vessie, de l'ovaire et du poumon [1,2,3,4]. Les patientes atteintes de cancer du sein surexprimant HER2 ont des taux de survie substantiellement plus faibles que celles avec des cancers HER2 non surexprimés [5]. De plus, la surexpression de HER2 entraîne une métastase accrue du cancer du sein [6,7,8]. Pour cette raison, HER2 sert de biomarqueur important dans le diagnostic du cancer. En milieu clinique, HER2 est utilisé comme marqueur biologique typique, avec le récepteur aux œstrogènes (ER) et le récepteur à la progestérone (PR), pour diagnostiquer le cancer du sein. Ainsi, les patientes reçoivent un diagnostic définitif après vérification histologique des niveaux d'expression de HER2, ER et PR. Cependant, la vérification histologique est invasive et n'est réalisée que sur un nombre limité de lésions. Pour cette raison, diverses recherches ont été menées pour visualiser les marqueurs diagnostiques de manière non invasive via examen radiologique avant la vérification histologique basée sur la tomodensitométrie [9, 10], la tomographie par émission de positrons [11,12,13], la tomodensitométrie à photon unique [14,15,16], l'imagerie par résonance magnétique (IRM) [17,18,19,20], et les outils d'imagerie multimodaux [21,22,23].

Les nanoparticules d'oxyde de fer (IONP) sont utilisées dans divers examens radiologiques non invasifs pour l'observation de biomarqueurs cliniquement pertinents [24, 25]. Les IONP sont compatibles avec l'imagerie moléculaire car elles ont une sensibilité magnétique ou une biocompatibilité plus élevée que les autres agents de contraste IRM à base de métaux lourds tels que les agents de contraste à base de gadolinium (GBCA) ou les agents de contraste contenant du nickel ou du cobalt. En particulier, bien que les agents de contraste IRM commercialisés et les GBCA soient associés à des problèmes de toxicité in vivo dus à la libération d'ions Gd³⁺, les agents de contraste IRM à base d'IONP ont une sécurité in vivo plus élevée que les GBCA car ils peuvent être dégradés en fer, absorbés ou éliminés [26, 27].

Pour appliquer les IONP à l'imagerie moléculaire, les molécules de ciblage sont extrêmement importantes et peuvent être des chimiques, glucides, protéines, anticorps ou aptamères [25, 28, 29]. Parmi ces molécules, les aptamères ont une structure tridimensionnelle stable d'un acide nucléique simple brin qui a une haute affinité et spécificité de liaison sur des molécules spécifiques. La haute affinité de liaison des aptamères est causée par leur technique de développement et l'évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) [30]. Le SELEX utilise de très grandes bibliothèques de séquences d'oligonucléotides aléatoires (~10¹⁵) qui peuvent être fournies par synthèse chimique et criblées en parallèle pour trouver des aptamères ayant une haute affinité de liaison sur la molécule cible. En résultat du SELEX, les aptamères peuvent être développés avec une haute affinité de liaison au niveau de concentration picomolaire généralement tandis que celle d'autres biomolécules varie du micromole au sous-nanomole [31, 32]. Dans le cas des aptamères de troisième génération récemment développés, ils ont aussi une stabilité in vitro et in vivo due à leur résistance améliorée contre les DNase ou RNase en utilisant des acides nucléiques modifiés [33, 34]. Pour ces raisons, les aptamères émergent comme les molécules de ciblage préférées dans la recherche en imagerie moléculaire [35].

L'objectif de cette étude était le développement d'un agent de contraste T2 modifié par aptamère basé sur des nanocristaux magnétiques (MNC) avec une haute spécificité pour les cellules cancéreuses surexprimant HER2. Pour atteindre cet objectif, des MNC, qui ont une haute sensibilité magnétique, ont été préparés par une méthode de décomposition thermique et un aptamère spécifique HER2 (K_d = 0,42 nM) a été utilisé. Les agents de contraste synthétisés ont été caractérisés en analysant la morphologie, la propriété d'aimantation et la relaxivité magnétique. De plus, nous avons réalisé des essais de ciblage in vitro et in vivo contre les protéines HER2 dans un modèle animal xénogreffé tumoral implanté avec une lignée cellulaire cancéreuse exprimant HER2, respectivement.

Méthodes

Matériaux

TWEEN® 80 (T80), 4-(diméthylamino)pyridine, N,N'-dicyclohexylcarbodiimide, triéthylamine, dichlorométhane anhydre, acétylacétonate de fer(III), 1,2-hexadécanediol, acide dodécanoïque, dodécylamine et éther benzylique ont été achetés chez Sigma-Aldrich (USA), et l'acide 3-maleimidopropionique (MPA) a été acheté chez TCI America (USA). Le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640), le milieu modifié Eagle de Dulbecco, le sérum fœtal bovin et la solution antibiotique-antimycotique Gibco® ont été achetés chez Life Technologies (USA). Le NIH3T6.7 a été acheté chez American Tissue Type Culture (USA). L'eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC) a été achetée chez Biosesang Inc. (Corée). L'aptamère anti-HER2 thiolé [Apt_HER2, séquence : 5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3' (6 : NapdU), modification 5'-SH, 40-mer] a été acheté chez Aptamer Science Inc. (Corée).

Synthèse des MNC

Les nanoparticules d'oxyde de fer magnétiques monodisperses ont été synthétisées en utilisant la méthode de décomposition thermique de Sun [36]. Ces nanoparticules magnétiques sont appelées MNC en raison de leurs précurseurs acétylacétonate de fer(III) et acide oléique. Brièvement, un mélange d'acétylacétonate de fer(III) (2 mmol), d'acide oléique (6 mmol), de 1-octadécène (6 mmol), de 1,2-hexadécanediol (10 mmol) et d'éther benzylique (20 mL) a été chargé dans un ballon à trois cols à fond rond et agité mécaniquement. Pour éliminer les molécules d'oxygène résiduelles et l'eau, le mélange a été préchauffé à 100 °C pendant 30 min. Le mélange préchauffé a ensuite été chauffé à 200 °C pendant 2 h et refluxé à 300 °C pendant 30 min sous flux d'azote. Après que les réactifs aient été refroidis à température ambiante en retirant la source de chaleur, les réactifs ont été purifiés avec un excès d'alcool éthylique. La centrifugation a été effectuée en triple pour séparer le produit de tout résidu non dispersé. Les produits de nanoparticules Fe₃O₄ ont été alors redispersés dans 5 mL d'hexane. Le produit final a été synthétisé en répétant la procédure décrite ci-dessus avec 100 mg Fe₃O₄ et ses précurseurs. Les morphologies des MNC ont été évaluées en utilisant un microscope électronique à transmission haute résolution (HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Japon). La saturation d'aimantation a été évaluée en utilisant un magnétomètre à échantillon vibrant (VSM, MODEL-7300, Lakeshore, USA) à température ambiante. La quantité de MNC dans le produit a été analysée en mesurant le poids en utilisant un analyseur thermogravimétrique (SDT-Q600, TA Instrument), et les MNC ont été lavés jusqu'à ce que la teneur en Fe₃O₄ atteigne environ 80 %.

Synthèse du TWEEN® 80 maléimidylé

Pour la préparation du T80 maléimidylé (Tm80), 15,3 mmol MPA et 22,9 mmol N,N'-dicyclohexylcarbodiimide ont été dissous dans 10 mL de dichlorométhane, respectivement, et ensuite mélangés. Le mélange a ensuite été ajouté à 20 mL de dichlorométhane contenant 7,6 mmol T80, suivi de l'addition de 3,2 mL de triéthylamine dans le mélange. Finalement, 22,9 mmol de 4-(diméthylamino)pyridine a été dissous dans 10 mL de dichlorométhane, et tous les réactifs ont été mélangés dans un flacon de 70 mL. Le mélange final a été agité en utilisant un aimant pendant 48 h. La couleur du mélange a changé de l'abricot à une couleur vin rouge. Après réaction pendant 48 h, l'urée cristallisée a été éliminée par filtration. Pour éliminer le dichlorométhane, la réaction a été filtrée par évaporation dans un évaporateur rotatif (N-1100, EYELA, Japon). Le produit résultant a été suspendu dans l'eau déionisée, et les réactifs non conjugués ont été éliminés par dialyse (Spectra/Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA). Le produit final a été préparé par lyophilisation. Le Tm80 synthétisé a été confirmé par comparaison avec MPA et T80 en utilisant un spectromètre UV-vis (UV-1800, Shimadzu, Japon), un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) (PerkinElmer, spectrum two), et un spectromètre de résonance magnétique nucléaire ¹H (Bruker Biospin, Advance II, voir Fichier supplémentaire 1 : Figure S1).

Préparation des MNC maléimidylés

Les MNC maléimidylés dispersibles dans l'eau (mWMNC) ont été préparés en utilisant la méthode de nanoémulsion [37]. Brièvement, 100 mg de Tm80 ont été complètement dissous dans 20 mL d'eau déionisée, et 4 mL d'hexane contenant 20 mg de MNC ont été rapidement injectés dans l'eau dissoute de Tm80 avec ultrasonication (190 W) et agitation (1200 tr/min). Le processus d'émulsion a continué pendant 10 min avec un bain refroidi à la glace. Le solvant organique restant a été évaporé pendant 12 h à température ambiante, et les produits ont été purifiés par dialyse (Spectra/Por®, 3,5 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA) pour éliminer l'excès de tensioactif pendant 3 jours. Les mWMNC ont ensuite été concentrés en utilisant un filtre centrifuge (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Allemagne) à 1,25 mg_Fe/mL dans l'eau traitée DEPC. Les MNC enveloppées de T80 (WMNC) ont également été préparées en utilisant la même méthode.

Préparation de l'Apt_HER2-MNS

Avant la conjugaison entre les mWMNC et les aptamères anti-HER2, l'étape de réduction des aptamères thiol-modifiés a été réalisée. Brièvement, 1 nmol d'aptamère a été dissous dans 0,3 mL d'eau déionisée, et l'acétate de triéthylamine et la solution de 1,4-dithioltréol ont été ajoutées pour que la concentration finale soit de 50 et 25 mM, respectivement. Ce mélange a été agité à température ambiante pendant 1,5 h, et il a été purifié et désalé par précipitation à l'éthanol. Pour préparer l'Apt_HER2-MNS, sonde IRM spécifique HER2, le poids moléculaire des MNC a été calculé théoriquement (voir Fichier supplémentaire 1 : Figure S2) et le ratio de mélange des mWMNC et de l'aptamère a été désigné comme 1:7. Par conséquent, 100 µg (Fe) mWMNC (en tant que Fe₃O₄, 45 pmol) a été dissous dans PBS (1 mL) et 5 µg (0,35 nmol) d'aptamère a été ajouté. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 5 min et incubé à 4 °C pendant 2 h. La distribution du diamètre hydrodynamique de l'Apt_HER2-MNS a ensuite été analysée en utilisant un analyseur de diffusion laser dynamique (ELS-Z, Otsuka Electronics, Japon). Pour confirmer la capacité de l'Apt_HER2-MNS comme agent de contraste IRM, l'analyse de relaxivité T2 (R2) a été réalisée avec un instrument IRM clinique 1,5 T avec une micro-bobine de surface 47 (Intera, Philips Medical System, Pays-Bas) en utilisant divers fantômes concentrés d'Apt_HER2-MNS. La R2 de l'Apt_HER2-MNS a été mesurée en utilisant la séquence Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) à température ambiante : TR = 10 s, 32 échos avec espace d'écho pair de 12 ms, nombre d'acquisitions = 1, résolution de point = 156 µm × 156 µm, et épaisseur de coupe = 0,6 mm. La R2 a été définie comme 1/T2 avec des unités s⁻¹.

Essai d'affinité de liaison de l'Apt_HER2-MNS

Pour la validation de la spécificité HER2 de l'Apt_HER2-MNS, la méthode de liaison sur filtre de nitrocellulose a été utilisée [38]. L'Apt_HER2 nu et l'Apt_HER2-MNS ont été déphosphorylés en utilisant la phosphatase alcaline (New England Biolabs, MA, USA). L'extrémité 5' ou 3' des aptamères a été marquée par la kinase polynucléotidique T4 et [³²P]-ATP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) [39]. Les essais de liaison ont été conduits en incubant les aptamères marqués au ³²P à une concentration de 10 pM avec la protéine HER2 à des concentrations variant de 100 à 10 pM dans le tampon de sélection (20 mM Tris·HCl, pH 7,5 à 4 °C, 6 mM NaCl, 5 mM 2-mercaptoéthanol, 1 mM Na₃EDTA, 10 % v/v glycérol) à 37 °C pendant 30 min. Le mélange des aptamères marqués au ³²P et de la protéine HER2 a été filtré par colonne G-50 (GE Heathcare Life Science, UK) pour éliminer les radioisotopes libres. Les mélanges filtrés ont été développés sur le film réutilisable, et les fractions des aptamères liés à la protéine HER2 ont été quantifiées en utilisant un phosphoimageur (Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Tokyo, Japon). Pour éliminer l'effet de la liaison de fond non spécifique de l'aptamère radiomarqué au filtre de nitrocellulose, les données de liaison brutes ont été corrigées en conduisant l'expérience en utilisant uniquement des aptamères marqués au ³²P.

IRM in vivo

Toutes les expériences animales ont été conduites sous l'approbation de l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire internationaux. Les scans IRM in vivo ont été conduits en utilisant un modèle murin de tumeur syngénique, qui a été généré par l'implantation de cellules NIH3T6.7 (1,0 × 10⁷ cellules) dans les cuisses de souris BALB/c nu femelles de 5 semaines. Après 2 semaines, la taille de la tumeur a été évaluée par IRM. Lorsque la taille de la tumeur a atteint environ 500 mm³, 100 µg (5 mg/kg) d'Apt_HER2-MNS a été injecté dans la veine caudale. Les expériences IRM in vivo ont été réalisées en utilisant un instrument IRM clinique 3,0 T et une bobine poignet humaine 8 canaux. Pour l'IRM pondérée T2 à 3,0 T, les paramètres suivants ont été adoptés : TR/TE = 1054/70 ms, nombre d'acquisitions = 2, résolution de point = 400 × 319 mm, et épaisseur de coupe = 1 mm, facteur TSE = 8. Les expériences contrôle ont été réalisées en utilisant des WMNC avec la même méthode. Toutes les intensités de signal T2 ont été calculées en moyennant approximativement cinq régions d'intérêt (ROI) tracées sur les images IRM pondérées T2 de chaque modèle murin (n = 3), et la valeur R2 (ou R2*), valeur inversée de T2, a été utilisée dans l'analyse d'intensité de signal. Les changements au cours du temps de l'intensité de signal relative ont été normalisés par l'intensité de signal initiale (pré-injection). L'analyse d'histogramme a également été conduite sur l'intensité de signal R2 des voxels dans la ROI.

Analyse histologique

La coloration au bleu de Prusse, qui peut être utilisée pour détecter les ions Fe dans les tissus tumoraux, a été conduite pour confirmer le ciblage de l'Apt_HER2-MNS des cancers exprimant HER2 suivant la récolte du tissu tumoral de chaque modèle tumoral après l'IRM in vivo. Les tissus tumoraux récoltés ont été fixés dans une solution de formol à 10 % pendant 24 h et inclus dans la paraffine après déshydratation dans des concentrations croissantes d'éthanol et clarification dans Histo-Clear® (National Diagnotics, USA). La coloration au bleu de Prusse a été conduite en montant les tranches de tissu (épaisseur = 5 µm) sur des lames de verre suivies de déparaffinage et d'hydratation en utilisant Histo-Clear® et des éthanol concentrés, respectivement. Après cela, les lames ont été placées dans la solution de travail de bleu de Prusse (10 % ferrocyanure de potassium et 20 % solution d'acide chlorhydrique = 1:1) pendant 1 h. Les noyaux ont été colorés en utilisant la coloration Nuclear Fast Red (Sigma Aldrich, USA). Après lavage des échantillons de tissu trois fois pendant 30 min, nous avons ajouté 2-3 gouttes de la solution de montage sur les lames et puis couvert les lames avec des lamelles. Les sections de tissu colorées ont été observées en utilisant un Olympus BX51 et le logiciel Olyvia (Olympus, Japon).

Résultats et discussion

L'Apt_HER2-MNS a été conçu comme un agent de ciblage monomoléculaire basé sur les IONP pour l'imagerie moléculaire des tumeurs exprimant HER2 en utilisant l'IRM. Ainsi, l'Apt_HER2-MNS devait avoir une haute spécificité pour la molécule cible et une grande susceptibilité magnétique. Pour obtenir une haute sensibilité magnétique d'abord, les MNC, nanoparticules monodisperses de Fe₃O₄, ont été synthétisées en utilisant la méthode de décomposition thermique et de croissance par germe [36]. La procédure expérimentale de préparation et d'application in vivo de l'Apt_HER2-MNS a été décrite dans la Fig. 1. Premièrement, la taille et la forme des MNC ont été confirmées par HR-TEM (Fig. 2a, b). Dans la Fig. 2c, la taille moyenne des MNC a été mesurée par la sélection aléatoire de 130 MNC depuis l'image TEM, et une distribution de taille très étroite (10,49 ± 1,74 nm) et une forme sphérique ont été observées. La propriété superparamagnétique des MNC a également été évaluée par VSM, qui a donné une valeur d'aimantation de saturation des MNC de 98,8 emu/g_Fe (Fig. 2d). L'agent de contraste T2, qui était actuellement disponible par injection intraveineuse, était basé sur les oxydes de fer superparamagnétiques (SPIO) ou les oxydes de fer superparamagnétiques ultrasmall (USPIO) [40]. Les SPIO ou USPIO ont aussi des propriétés superparamagnétiques, mais ils ont une valeur d'aimantation de saturation inférieure à 70 emu/g_Fe [40,41,42,43]. La propriété superparamagnétique est nécessaire pour utiliser les IONP comme agent de contraste intraveineux car elle fait en sorte que les IONP aient une propriété magnétique seulement quand elles sont dans le champ magnétique, et elle empêche les IONP de s'agglomérer. De plus, une valeur d'aimantation de saturation plus élevée des MNC pourrait être utile pour réduire la dose d'injection par rapport aux agents de contraste basés sur SPIO ou USPIO.

Illustration schématique montrant la procédure expérimentale pour la préparation du nanosensibilisateur magnétique modifié par aptamère (Apt_HER2-MNS) et l'évaluation de leur capacité d'imagerie in vivo.

Résultat de la caractérisation morphologique et magnétique des MNC. a Image TEM. b Image TEM agrandie. c Distribution de taille mesurée depuis l'image TEM (comptage total 100). d Graphique d'aimantation.

Afin d'utiliser les MNC pour des expériences in vivo, les WMNC et mWMNC ont été préparés par une méthode de nanoémulsion en utilisant T80 ou Tm80, respectivement. Les caractéristiques physicochimiques du Tm80 préparé et de ses précurseurs, MPA et T80, ont été confirmées par analyse spectrale d'absorbance, FT-IR, ¹H-RMN (voir Fichier supplémentaire 1 : Figure S1). Comme publié précédemment [44], les mWMNC préparés par la méthode de nanoémulsion en utilisant Tm80 sont stablement dispersés dans l'eau. De plus, les groupes maléimidylés des mWMNC peuvent être facilement conjugués avec une molécule qui a des groupes thiol à pH neutre et cette conjugaison ne génère aucun sous-produit. De plus, l'aptamère modifié NapdU a été utilisé pour augmenter la demi-vie in vivo, et sa demi-vie était de 151 h dans le sérum humain (voir Fichier supplémentaire 1 : Figure S3). L'Apt_HER2-MNS a été préparé par conjugaison entre les mWMNC et Apt_HER2-SH, et les propriétés hydrodynamiques de l'Apt_HER2-MNS ont été évaluées en utilisant la diffusion laser dynamique et l'analyse de relaxivité IRM (Fig. 3). Les diamètres des WMNC et de l'Apt_HER2-MNS étaient de 28,8 ± 7,2 et 34,1 ± 8,2 nm, respectivement (Fig. 3a). Parce que l'Apt_HER2 consistait en des oligonucléotides de 40-mer et était d'environ 5-10 nm de longueur, la présence de l'Apt_HER2 pourrait causer la différence de diamètre hydrodynamique. La relaxivité des WMNC et de l'Apt_HER2-MNS était de 265,7 et 257,2 mM⁻¹_Fe s⁻¹, respectivement (Fig. 3b), ce qui a été évalué pour confirmer leur sensibilité magnétique comme agent de contraste IRM. Dans le cas des agents de contraste T2 basés sur SPIO ou USPIO, qui sont approuvés par la FDA, ils étaient presque synthétisés par la méthode de co-précipitation. Pour cette raison, leur cristallinité était diminuée, ce qui causait une relaxivité faible (sous 190 mM⁻¹ _Fe s⁻¹) sous le champ magnétique [40]. En utilisant les MNC dans cette étude, l'Apt_HER2-MNS avait une relaxivité magnétique augmentée de 35 à 500 % par rapport aux agents de contraste T2 basés sur SPIO ou USPIO.

Caractérisation des WMNC et Apt_HER2-MNS pour utilisation comme agent de contraste IRM in vivo. a Diamètre hydrodynamique (n = 5, WMNC 28,8 ± 7,2 nm, Apt_HER2-MNS 34,1 ± 8,2 nm). b Graphique d'analyse de relaxivité (n = 3, WMNC R² = 265,7 mM⁻¹ s⁻¹, R² = 0,99 et Apt_HER2-MNS R² = 257,2 mM⁻¹ s⁻¹, R² = 0,99).

L'affinité de liaison de l'Apt_HER2-MNS pour la protéine HER2 a été évaluée en utilisant un essai de liaison sur filtre (Fig. 4a), et les valeurs K_d résultantes de l'Apt_HER2-SH et de l'Apt_HER2-MNS ont été mesurées à 26,88 ± 8,24 et 0,57 ± 0,26 nM, respectivement (Fig. 4b, c). L'Apt_HER2-OH a une spécificité très élevée pour les protéines HER2 avec une valeur K_d de 0,42 ± 0,05 nM, et cette affinité de liaison est environ 10 fois supérieure à 5 nM d'Herceptin® [45]. Cependant, l'affinité de liaison de l'Apt_HER2 nu peut être changée par conjugaison avec les chimiques, molécules ou nanoparticules. Par conséquent, l'affinité de liaison de l'Apt_HER2 pour les protéines HER2 devrait être évaluée après conjugaison avec les mWMNC. L'affinité de liaison de l'Apt_HER2-SH pour HER2 a été réduite par la présence d'un groupe thiol plutôt que par l'Apt_HER2 nu car le groupe thiol peut être lié avec d'autres résidus thiol dans les protéines ou d'autres aptamères thiol-modifiés. Cependant, l'affinité de liaison de l'Apt_HER2-MNS a été mesurée comme similaire à celle de l'Apt_HER2, ce résultat signifie qu'il n'y a pas assez d'Apt_HER2-SH non lié qui peut interrompre l'interaction entre l'aptamère et la protéine HER2 ni les mWMNC n'ont aucune ou très peu d'influence sur l'affinité de liaison des aptamères.

Données d'affinité de liaison de l'aptamère anti-HER2 (Apt_HER2-OH), aptamère anti-HER2 thiolé (Apt_HER2-SH) et Apt_HER2-MNS sur les protéines HER2 en mesurant l'essai de liaison sur filtre. a Illustration schématique montrant le processus d'essai de liaison sur filtre des aptamères. b Graphique de la fraction d'aptamère lié contre la concentration HER2. c Graphique de la valeur K_d de l'Apt_HER2-OH (0,42 ± 0,05 nM, R² = 0,99, p < 0,0001), Apt_HER2-SH (26,88 ± 8,24 nM, R² = 0,98, p < 0,0001), et Apt_HER2-MNS (0,57 ± 0,26 nM, R² = 0,91, p = 0,001) calculée depuis b. Les barres d'erreur étaient représentées par l'axe y positif seulement.

Les expériences IRM in vivo ont été réalisées en utilisant les modèles murins de tumeur syngénique pour évaluer la capacité de l'Apt_HER2-MNS à cibler les tumeurs surexprimant HER2. En utilisant un modèle de tumeur généré par l'implantation de cellules NIH3T6.7 dans la cuisse, une expérience IRM a été conduite de la pré-injection à 120 min après l'injection de WMNC ou Apt_HER2-MNS (Fig. 5, voir aussi Fichier supplémentaire 1 : Figure S4). L'effet d'amélioration de contraste T2 par les agents de contraste à base d'IONP est observé comme assombrissement de l'image car ils induisent un effet de raccourcissement T2 des protons environnants. Par conséquent, dans les analyses d'intensité de signal, les valeurs T2 ou T2* étaient représentées par R2 ou R2*. R2, une valeur inversée de T2, est utilisée pour comparer l'intensité de signal avec une valeur positive. Dans le cas des WMNC, la plus haute intensité de signal R2 a été observée 30 min après l'injection de WMNC après quoi elle a diminué progressivement (Fig. 5a, b). À 120 min après l'injection de WMNC, l'intensité de signal T2 ressemblait à l'état pré-injection. Le taux de changement de la valeur moyenne de l'intensité de signal R2 était inférieur à 10 % ; ainsi, il était difficile à reconnaître dans l'IRM pondérée T2 à l'œil nu. Dans l'étude précédente, il a été démontré que les nanoparticules d'oxyde de fer enveloppées de T80 s'accumulaient autour des tissus tumoraux malgré l'absence de toute molécule de ciblage [46]. Cependant, dans cette étude, une dose d'agent de contraste de 1,4 mg_Fe par souris a été utilisée dans l'IRM pondérée T2, ce qui était 14 fois plus élevé que la dose utilisée dans cette étude. Cela signifie que les WMNC ne pouvaient pas montrer une efficacité d'amélioration de contraste effective dans l'expérience à une dose de 0,1 mg_Fe par souris (5 mg_Fe/kg). Le changement de série temporelle de l'intensité de signal R2* était aussi inférieur à 10 %, et il n'y avait pas de signification statistique. En contraste, 120 min après l'injection, l'Apt_HER2-MNS a causé une amélioration de l'intensité de signal 130 % plus élevée qu'avant l'injection de l'Apt_HER2-MNS malgré l'utilisation de la même dose d'injection que les WMNC (Fig. 5c, d). Cette dose d'injection était 2 à 30 fois plus faible que celle d'autres études sur les agents de contraste basés sur nanoparticules magnétiques modifiées par aptamère [44, 47, 48]. Ce résultat indiquait que l'Apt_HER2-MNS a une capacité de ciblage plus élevée que les WMNC ou d'autres agents de contraste modifiés par aptamère, et suggérait aussi que l'effet d'amélioration de contraste élevé de l'Apt_HER2-MNS pourrait être attendu malgré une dose plus faible que les WMNC. L'amélioration de contraste apparaissait principalement dans les vaisseaux périphériques et au centre du tissu tumoral. Bien que les vaisseaux périphériques s'assombrissaient peu après l'injection de l'Apt_HER2-MNS, l'amélioration de contraste au centre de la lésion tumorale apparaissait d'abord à 60 min et tendait à augmenter jusqu'à 120 min.

Images IRM in vivo du modèle murin de tumeur HER2+ utilisant WMNC (n = 3) ou Apt_HER2-MNS (n = 3). a Images IRM pondérées T2 et T2* à la pré- ou post-injection de WMNC. b Graphique d'intensité de signal relative mesuré depuis a. c Images IRM pondérées T2 et T2* à la pré- ou post-injection de Apt_HER2-MNS. d Graphique d'intensité de signal relative et e l'histogramme d'intensité de la région tumorale mesuré depuis c. f Données d'analyse histologique obtenues après imagerie IRM. Les barres d'erreur étaient représentées par l'axe y positif seulement. Les intensités de signal relatives de b, d, et e étaient mesurées depuis la ROI à ligne rouge continue de a, c, et Fichier supplémentaire 1 : Figure S4.

Pour souligner le changement visible dans les effets d'amélioration de contraste avant et après l'injection de l'Apt_HER2-MNS, une analyse d'histogramme de l'intensité de signal R2 a été conduite dans les ROI aux images IRM pondérées T2 (Fig. 5e). Parce que le signal T2 est apparent comme l'amélioration négative dans les images IRM pondérées T2, il a été représenté par R2. Après injection de l'Apt_HER2-MNS, le centre de l'histogramme a été décalé vers le côté droit. L'augmentation d'environ 10 % de l'amélioration de contraste a été observée quand la différence du centre des histogrammes a été calculée.

Pour confirmer la présence de l'Apt_HER2-MNS dans la tumeur histologiquement, la coloration au bleu de Prusse a été conduite (Fig. 5f). Dans le tissu coloré au bleu de Prusse, le noyau et le cytoplasme étaient colorés en rose foncé ou clair, et plusieurs points de couleur bleue étaient observés autour des cellules tumorales. Nous avons supposé que les tissus tumoraux seraient colorés en bleu si l'Apt_HER2-MNS ciblait la tumeur. Dans les résultats de la coloration au bleu de Prusse, les points bleus étaient observés dans les tissus tumoraux, et les lames de tissu de l'Apt_HER2-MNS avaient environ 3 fois plus de points bleus que celles des WMNC. La coloration au bleu de Prusse peut détecter l'ion Fe dans les tissus ; ainsi, elle a été utilisée pour confirmer l'accumulation de l'agent de contraste basé sur les IONP dans les tissus tumoraux [44, 49, 50].

Conclusions

En conclusion, nous avons confirmé que l'Apt_HER2-MNS fonctionne comme un agent de contraste IRM ciblable HER2 in vivo par caractérisation physicochimique et expériences IRM in vivo dans des modèles murins de tumeur exprimant HER2. L'Apt_HER2-MNS a une haute relaxivité et spécificité pour HER2, et il a démontré des effets d'amélioration de contraste marqués malgré une dose d'administration plus faible que les autres agents de contraste T2, grâce aux nanoparticules d'oxyde de fer. Cet agent de contraste devrait fournir des informations concernant l'expression du cancer HER2 chez les patients cancéreux et pourrait être utilisé pour surveiller les patients atteints de cancer HER2+ pendant la chimiothérapie utilisant des médicaments ciblant HER2. Nous attendons que les résultats de ce travail offrent une stratégie prometteuse pour le diagnostic du cancer surexprimant HER2 et pour le traitement des patients.