Nanosensibilisateur magnétique modifié par Aptamer pour l'imagerie par résonance magnétique in vivo du cancer exprimant HER2

Contexte

Le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2), qui appartient à la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGFR), joue un rôle clé dans les malignités humaines et est surexprimé dans environ 30 % des cancers du sein humains [1] et dans de nombreux autres types de cancer. , y compris les carcinomes de l'estomac, de la vessie, de l'ovaire et du poumon [1,2,3,4]. Les patientes atteintes d'un cancer du sein surexprimant HER2 ont tendance à avoir des taux de survie sensiblement inférieurs à ceux des patientes atteintes d'un cancer HER2 non surexprimant [5]. De plus, la surexpression de HER2 entraîne une augmentation des métastases du cancer du sein [6,7,8]. Pour cette raison, HER2 sert de biomarqueur important dans le diagnostic du cancer. En milieu clinique, HER2 est utilisé comme marqueur biologique typique, avec le récepteur des œstrogènes (ER) et le récepteur de la progestérone (PR), pour diagnostiquer le cancer du sein. Ainsi, les patientes atteintes d'un cancer du sein reçoivent un diagnostic définitif après vérification histologique des niveaux d'expression de HER2, ER et PR. Cependant, la vérification histologique est invasive et n'est réalisée que dans un nombre limité de lésions. Pour cette raison, diverses recherches ont été menées pour visualiser les marqueurs diagnostiques de manière non invasive via un examen radiologique avant vérification histologique basée sur la tomodensitométrie [9, 10], la tomographie par émission de positons [11,12,13], la tomodensitométrie à émission monophotonique [14,15,16], imagerie par résonance magnétique (IRM) [17,18,19,20] et outils d'imagerie multimodale [21,22,23].

Les nanoparticules d'oxyde de fer (IONP) sont utilisées dans divers examens radiologiques non invasifs pour l'observation de biomarqueurs cliniquement pertinents [24, 25]. Les IONP sont compatibles avec l'imagerie moléculaire car ils ont une sensibilité magnétique ou une biocompatibilité plus élevée que les autres agents de contraste IRM à base de métaux lourds tels que les agents de contraste à base de gadolinium (GBCA) ou les agents de contraste contenant du nickel ou du cobalt. En particulier, bien que les agents de contraste IRM commercialisés et les GBCA soient associés à des problèmes liés à la toxicité in vivo dus à la libération de Gd ³⁺ ions, les agents de contraste IRM à base d'IONP ont une sécurité in vivo plus élevée que les GBCA car ils peuvent être dégradés en fer, absorbés ou éliminés [26, 27].

Pour appliquer les IONP à l'imagerie moléculaire, les fragments de ciblage sont extrêmement importants et peuvent être des produits chimiques, des glucides, des protéines, des anticorps ou des aptamères [25, 28, 29]. Parmi ces molécules, les aptamères ont une structure tridimensionnelle stable d'un acide nucléique simple brin qui a une affinité de liaison et une spécificité élevées sur des molécules spécifiques. La forte affinité de liaison des aptamères est due à leur technique de développement et à l'évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) [30]. SELEX utilise de très grandes bibliothèques d'oligonucléotides à séquences aléatoires (~ 10 ¹⁵ ) peuvent être fournis par synthèse chimique et criblés en parallèle pour trouver des aptamères qui ont une affinité de liaison élevée sur la molécule cible. Grâce à SELEX, des aptamères pourraient être développés avec une affinité de liaison élevée au niveau de concentration picomolaire en général, tandis que celle d'autres biomolécules va de la micromole à la sous-nanomole [31, 32]. Dans le cas des aptamères de troisième génération récemment développés, ils présentent également une stabilité in vitro et in vivo en raison de leur résistance améliorée contre la DNase ou la RNase en utilisant des acides nucléiques modifiés [33, 34]. Pour ces raisons, les aptamères apparaissent comme les fractions préférées dans la recherche en imagerie moléculaire [35].

L'objectif de cette étude était le développement d'un agent de contraste T2 modifié par un aptamère basé sur des nanocristaux magnétiques (MNC) avec une spécificité élevée pour les cellules cancéreuses surexprimant HER2. Pour atteindre cet objectif, des MNC, qui ont une haute sensibilité magnétique, ont été préparées par une méthode de décomposition thermique et un aptamère spécifique à HER2 (K _d =0,42 nM) a été utilisé. Les agents de contraste synthétisés ont été caractérisés en analysant la morphologie, la propriété de magnétisation et la relaxivité magnétique. De plus, nous avons effectué des essais de ciblage in vitro et in vivo contre les protéines HER2 dans un modèle animal de xénogreffe de tumeur implanté avec une lignée cellulaire cancéreuse exprimant HER2, respectivement.

Méthodes

Matériaux

TWEEN® 80 (T80), 4-(diméthylamino)pyridine, N ,N Le ′-dicyclohexylcarbodiimide, la triéthylamine, le dichlorométhane anhydre, l'acétylacétonate de fer (III), le 1,2-hexadécanediol, l'acide dodécanoïque, la dodécylamine et l'éther benzylique ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (États-Unis) et l'acide 3-maléimidopropionique (MPA) a été acheté auprès de TCI Amérique (États-Unis). Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640), le milieu Eagle modifié de Dulbecco, le sérum bovin fœtal et la solution antibiotique-antimycosique Gibco® ont été achetés auprès de Life Technologies (États-Unis). Le NIH3T6.7 a été acheté auprès d'American Tissue Type Culture (USA). L'eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) a été achetée auprès de Biosesang Inc. (Corée). L'aptamère thiolé anti-HER2 [Apt_HER2 , séquence :5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3' (6 :NapdU), modification 5'-SH, 40-mer] a été acheté chez Aptamer Science Inc. (Corée).

Synthèse des multinationales

Les nanoparticules d'oxyde de fer magnétique monodispersées ont été synthétisées à l'aide de la méthode de décomposition thermique de Sun [36]. Ces nanoparticules magnétiques sont appelées MNC en raison de leurs précurseurs d'acétylacétonate de fer (III) et d'acide oléique. En bref, un mélange d'acétylacétonate de fer (III) (2 mmol), d'acide oléique (6 mmol), de 1-octadécène (6 mmol), de 1,2-hexadécanediol (10 mmol) et d'éther benzylique (20 ml) a été chargé dans un ballon tricol à fond rond et agité mécaniquement. Pour éliminer les molécules d'oxygène résiduelles et l'eau, le mélange a été préchauffé à 100 °C pendant 30 min. Le mélange préchauffé a ensuite été chauffé à 200 °C pendant 2 h et chauffé au reflux à 300 °C pendant 30 min sous un courant d'azote. Après avoir refroidi les réactifs à température ambiante en éliminant la source de chaleur, les réactifs ont été purifiés avec un excès d'alcool éthylique. La centrifugation a été effectuée en triple pour séparer le produit de tout résidu non dispersé. Le Fe₃ O₄ les produits nanoparticulaires ont ensuite été redispersés dans 5 mL d'hexane. Le produit final a été synthétisé en répétant la procédure décrite ci-dessus avec 100 mg de Fe₃ O₄ et ses précurseurs. Les morphologies des MNC ont été évaluées à l'aide d'un microscope électronique à transmission haute résolution (HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Japon). La saturation de l'aimantation a été évaluée à l'aide d'un magnétomètre à échantillon vibrant (VSM, MODEL-7300, Lakeshore, USA) à température ambiante. La quantité de MNC dans le produit a été analysée en mesurant le poids à l'aide d'un analyseur thermogravimétrique (SDT-Q600, TA Instrument), et les MNC ont été lavées jusqu'à la teneur en Fe₃ O₄ atteint environ 80 %.

Synthèse de Maleimidyl-TWEEN ^® 80

Pour la préparation de maléimidyl T80 (Tm80), 15,3 mmol de MPA et 22,9 mmol de N ,N Le ′-dicyclohexylcarbodiimide a été dissous dans 10 mL de dichlorométhane, respectivement, puis mélangé. Le mélange a ensuite été ajouté à 20 ml de dichlorométhane contenant 7,6 mmol de T80, suivi par l'ajout de 3,2 ml de triéthylamine dans le mélange. Enfin, 22,9 mmol de 4-(diméthylamino) pyridine ont été dissous dans 10 ml de dichlorométhane et tous les réactifs ont été mélangés dans un flacon de 70 ml. Le mélange final a été agité à l'aide d'un aimant pendant 48 h. La couleur du mélange a changé d'abricot à une couleur de vin rouge. Après 48 h de réaction, l'urée cristallisée a été éliminée par filtration. Pour éliminer le dichlorométhane, la réaction a été filtrée par évaporation dans un évaporateur rotatif (N-1100, EYELA, Japon). Le produit résultant a été mis en suspension dans de l'eau désionisée et les réactifs non conjugués ont été éliminés par dialyse (Spectra/Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA). Le produit final a été préparé par lyophilisation. Le Tm80 synthétisé a été confirmé par comparaison avec le MPA et le T80 en utilisant un spectromètre UV-vis (UV-1800, Shimadzu, Japon), un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) (PerkinElmer, spectre deux) et ¹ Spectromètre à résonance magnétique (RMN) nucléaire H (Bruker Biospin, Advance II, voir le fichier supplémentaire 1 :Figure S1).

Préparation des MNC Maleimidyl

Les MNC maléimidyles dispersables dans l'eau (mWMNC) ont été préparées par la méthode de la nanoémulsion [37]. En bref, 100 mg de Tm80 ont été complètement dissous dans 20 mL d'eau déminéralisée, et 4 mL de n-hexane contenant 20 mg de MNC ont été rapidement injectés dans de l'eau dissoute de Tm80 avec ultrasons (190 W) et agitation (1200 rpm). Le processus d'émulsion s'est poursuivi pendant 10 min avec un bain refroidi par de la glace. Le solvant organique restant a été évaporé pendant 12 h à température ambiante, et les produits ont été purifiés par dialyse (Spectra/Por®, 3,5 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA) pour éliminer l'excès de tensioactif pendant 3 jours. Les mWMNC ont ensuite été concentrés à l'aide d'un filtre centrifuge (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Allemagne) à 1,25 mg_Fe /mL dans de l'eau traitée au DEPC. Les MNC à enveloppe T80 (WMNC) ont également été préparées selon la même méthode.

Préparation d'Apt_HER2 -MNS

Avant la conjugaison entre les mWMNCs et les aptamères anti-HER2, l'étape de réduction des aptamères thiol-modifiés a été réalisée. Brièvement, 1 nmol d'aptamère a été dissous dans 0,3 mL d'eau déminéralisée, et une solution d'acétate de triéthylamine et de 1,4-dithiltrétol a été ajoutée par laquelle la concentration finale était de 50 et 25 mM, respectivement. Ce mélange a été agité à température ambiante pendant 1,5 h, et il a été purifié et dessalé par précipitation à l'éthanol. Pour préparer l'Apt_HER2 -MNS, sonde IRM spécifique à HER2, le poids moléculaire des MNC a été calculé théoriquement (voir le fichier supplémentaire 1 :Figure S2) et le rapport de mélange des mWMNC et de l'aptamère a été désigné comme 1:7. Par conséquent, 100 μg (Fe) de mWMNC (comme Fe₃ O₄ , 45 pmol) a été dissous dans du PBS (1 mL) et 5 ug (0,35 nmol) d'aptamère ont été ajoutés. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 5 minutes et incubé à 4 °C pendant 2 heures. La distribution du diamètre hydrodynamique de l'Apt_HER2 -MNS a ensuite été analysé à l'aide d'un analyseur à diffusion laser dynamique (ELS-Z, Otsuka Electronics, Japon). Pour confirmer la capacité de l'Apt_HER2 -MNS en tant qu'agent de contraste IRM, l'analyse de relaxivité T2 (R2) a été réalisée avec un instrument d'IRM clinique de 1,5 T avec une bobine de surface micro-47 (Intera, Philips Medical System, Pays-Bas) en utilisant divers fantômes concentrés d'Apt_{HER2 -MNS. Le R2 de l'AptHER2 -La MNS a été mesurée en utilisant la séquence Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) à température ambiante :TR = 10 s, 32 échos avec un espace d'écho pair de 12 ms, nombre d'acquisitions = 1, résolution ponctuelle = 156 μm × 156 μm, et épaisseur de section = 0.6 mm. Le R2 a été défini comme 1/T2 avec s ⁻¹ unités.}

Apt_HER2 -MNS Binding Affinity Assay

Pour la validation de la spécificité HER2 d'Apt_HER2 -MNS, la méthode de fixation par filtre de nitrocellulose a été utilisée [38]. Le nu Apt_HER2 et Apt_HER2 -Les MNS ont été déphosphorylés en utilisant de la phosphatase alcaline (New England Biolabs, MA, USA). L'extrémité 5' ou 3' des aptamères a été marquée par la polynucléotide kinase T4 et [ ³² P]-ATP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, États-Unis) [39]. Les tests de liaison ont été effectués en incubant les ³² Aptamères marqués au P à une concentration de 10 pM avec la protéine HER2 à des concentrations allant de 100 à 10 pM dans un tampon de sélection (20 mM Tris·HCl, pH 7,5 à 4 °C, 6 mM NaCl, 5 mM 2-mercaptoéthanol, 1 mM Na₃ EDTA, 10 % v /v glycérol) à 37 °C pendant 30 min. Le mélange des ³² Les aptamères marqués au P et la protéine HER2 ont été filtrés sur colonne G-50 (GE Heathcare Life Science, Royaume-Uni) pour éliminer les radio-isotopes libres. Les mélanges filtrés ont été développés sur le film réutilisable et les fractions des aptamères liés aux protéines HER2 ont été quantifiées à l'aide d'un phosphorimager (Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Tokyo, Japon). Pour éliminer l'effet de la liaison de fond non spécifique de l'aptamère radiomarqué au filtre de nitrocellulose, les données de liaison brutes ont été corrigées en effectuant l'expérience en utilisant ³² Aptamères marqués P uniquement.

IRM in vivo

Toutes les expérimentations animales ont été menées sous l'approbation de l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. Les IRM in vivo ont été réalisées à l'aide d'un modèle de tumeur syngénique de la souris, qui a été généré par l'implantation de cellules NIH3T6.7 (1,0 × 10 ⁷ cellules) dans les cuisses de souris nudes femelles BALB/c âgées de 5 semaines. Après 2 semaines, la taille de la tumeur a été évaluée par IRM. Lorsque la taille de la tumeur a atteint environ 500 mm ³ , 100 μg (5 mg/kg) Apt_HER2 -MNS a été injecté dans la veine caudale. Des expériences d'IRM in vivo ont été réalisées à l'aide d'un instrument d'IRM clinique de 3,0 T et d'une bobine de poignet humain à 8 canaux. Pour l'IRM pondérée en T2 à 3,0 T, les paramètres suivants ont été retenus :TR/TE = 1054/70 ms, nombre d'acquisitions = 2, résolution ponctuelle = 400 × 319 mm et épaisseur de coupe = 1 mm facteur TSE = 8. des expériences de contrôle ont été réalisées en utilisant des WMNC avec la même méthode. Toutes les intensités de signal T2 ont été calculées en faisant la moyenne d'environ cinq régions d'intérêt (ROI) dessinées sur les images IRM pondérées en T2 de chaque modèle de souris (n = 3), et la valeur R2 (ou R2*), valeur inversée de T2, a été utilisée dans l'analyse de l'intensité du signal. Les changements dans le temps de l'intensité relative du signal ont été normalisés par l'intensité du signal initial (pré-injection). L'analyse de l'histogramme a également été menée sur l'intensité du signal R2 du voxel en retour sur investissement.

Analyse histologique

La coloration au bleu de Prusse, peut être utilisée pour détecter l'ion Fe dans les tissus tumoraux, a été réalisée pour confirmer l'Apt_HER2 -Ciblage MNS du cancer exprimant HER2 suite à la récolte de tissu tumoral de chaque modèle tumoral après l'IRM in vivo. Les tissus tumoraux récoltés ont été fixés dans une solution de formol à 10 % pendant 24 h et inclus dans de la paraffine après déshydratation dans des concentrations croissantes d'éthanol et clarification dans Histo-Clear® (National Diagnotics, USA). La coloration au bleu de Prusse a été réalisée en montant les tranches de tissu (épaisseur = 5 μm) sur des lames de verre suivies d'un déparaffinage et d'une hydratation à l'aide d'Histo-Clear® et d'éthanols concentrés, respectivement. Après cela, les lames ont été placées dans la solution de travail bleu de Prusse (solution à 10 % de ferrocyanure de potassium et à 20 % d'acide chlorhydrique = 1 :1) pendant 1 h. Les noyaux ont été colorés en utilisant le colorant Nuclear Fast Red (Sigma Aldrich, USA). Après avoir lavé les échantillons de tissus trois fois pendant 30 min, nous avons ajouté 2 à 3 gouttes de la solution de montage sur les lames, puis nous avons recouvert les lames de lamelles. Les coupes de tissus colorées ont été observées à l'aide d'un logiciel Olympus BX51 et Olyvia (Olympus, Japon).

Résultats et discussion

Appartement_HER2 -MNS a été conçu comme un agent de ciblage à molécule unique basé sur les IONP pour l'imagerie moléculaire des tumeurs exprimant HER2 à l'aide de l'IRM. Par conséquent, Apt_HER2 -MNS devait avoir une spécificité élevée pour la molécule cible et une grande susceptibilité magnétique. Pour obtenir une haute sensibilité magnétique dans un premier temps, les MNC, monodisperses Fe₃ O₄ nanoparticules, ont été synthétisées en utilisant la méthode de décomposition thermique et de croissance de graines [36]. Procédure expérimentale de préparation et d'application in vivo d'Apt_HER2 -MNS a été décrit dans la Fig. 1. Premièrement, la taille et la forme des MNC ont été confirmées par HR-TEM (Fig. 2a, b). Sur la figure 2c, la taille moyenne des MNC a été mesurée par la sélection aléatoire de 130 MNC à partir de l'image MET, et une distribution de taille très étroite (10,49 ± 1,74 nm) et une forme sphérique ont été observées. La propriété superparamagnétique des MNC a également été évaluée par VSM, qui a donné une valeur de magnétisation de saturation des MNC de 98,8 emu/g_Fe (Fig. 2d). L'agent de contraste T2, actuellement disponible par injection intraveineuse, était à base d'oxydes de fer superparamagnétiques (SPIO) ou d'oxydes de fer ultra-petits superparamagnétiques (USPIO) [40]. SPIO ou USPIO ont également des propriétés superparamagnétiques, mais ils ont une valeur d'aimantation à saturation inférieure à 70 emu/g_Fe [40,41,42,43]. La propriété superparamagnétique est nécessaire pour utiliser les IONP en tant qu'agent de contraste intraveineux, car elle confère aux IONP une propriété magnétique uniquement lorsqu'elles se trouvent dans le champ magnétique et empêche les IONP de s'agréger. De plus, une valeur de magnétisation de saturation plus élevée des MNC pourrait être utile pour réduire la dose d'injection que les agents de contraste à base de SPIO ou d'USPIO.

Illustration schématique montrant la procédure expérimentale pour la préparation du nanosensibilisateur magnétique modifié par aptamère (Apt_HER2 -MNS) et leur évaluation des capacités d'imagerie in vivo

Le résultat de la caractérisation morphologique et magnétique des MNC. un image TEM. b Image MET agrandie. c Mesure de la distribution de la taille à partir de l'image TEM (compte total 100). d Graphique de magnétisation

Afin d'utiliser les MNC pour des expériences in vivo, les WMNC et les mWMNC ont été préparés par une méthode de nanoémulsion utilisant respectivement le T80 ou le Tm80. Les caractéristiques physico-chimiques du Tm80 préparé et de ses précurseurs, MPA et T80, ont été confirmées par absorbance, FT-IR, ¹ Analyse spectrale H-RMN (voir Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). Comme précédemment publié [44], les mWMNC préparés par la méthode de nanoémulsion utilisant le Tm80 sont dispersés de manière stable dans l'eau. De plus, les groupes maléimidyle des mWMNC peuvent être facilement conjugués avec une molécule qui a des groupes thiol à pH neutre et cette conjugaison ne génère aucun produit secondaire. De plus, l'aptamère modifié par NapdU a été utilisé pour augmenter la demi-vie in vivo, et sa demi-vie était de 151 h dans le sérum humain (voir le fichier supplémentaire 1 :Figure S3). Appartement_HER2 -MNS a été préparé par conjugaison entre mWMNCs et Apt_HER2 -SH, et les propriétés hydrodynamiques d'Apt_HER2 -Les SMN ont été évalués à l'aide de la diffusion laser dynamique et de l'analyse de relaxivité par résonance magnétique (Fig. 3). Les diamètres des WMNC et Apt_HER2 -Les MNS étaient respectivement de 28,8 ± 7,2 et 34,1 ± 8,2 nm (Fig. 3a). Parce que l'Apt_HER2 se composait d'oligonucléotides 40-mer et mesurait environ 5 à 10 nm de longueur, la présence d'Apt_HER2 pourrait causer la différence de diamètre hydrodynamique. La relaxivité des WMNCs et Apt_HER2 -MNS était de 265,7 et 257,2 mM ⁻¹ _Fe s ⁻¹ , respectivement (Fig. 3b), qui a été évalué pour confirmer leur sensibilité magnétique en tant qu'agent de contraste IRM. Dans le cas des agents de contraste T2 à base de SPIO ou USPIO, qui sont approuvés par la FDA, ils ont presque été synthétisés par la méthode de co-précipitation. Pour cette raison, leur cristallinité était diminuée, ce qui entraînait une faible relaxivité (inférieure à 190 mM ⁻¹ _Fe s ⁻¹ ) sous le champ magnétique [40]. En utilisant des MNC dans cette étude, Apt_HER2 -MNS avait une relaxivité magnétique augmentée de 35 à 500 % par rapport aux agents de contraste T2 à base de SPIO ou d'USPIO.

La caractérisation des WMNCs et Apt_HER2 -MNS pour utilisation comme agent de contraste IRM in vivo. un diamètre hydrodynamique (n = 5, WMNC 28,8 ± 7,2 nm, Apt_HER2 -MNS 34,1 ± 8,2 nm). b Graphique d'analyse de relaxivité (n = 3, WMNCs R ² = 265,7 mM ⁻¹ s ⁻¹ , R ² = 0.99 et Apt_HER2 -MNS R ² = 257,2 mM ⁻¹ s ⁻¹ , R ² = 0.99)

L'affinité de liaison d'Apt_HER2 -Le MNS pour la protéine HER2 a été évalué à l'aide d'un test de liaison par filtre (Fig. 4a), et le K résultant _d valeurs de Apt_HER2 -SH et Apt_HER2 -Les MNS ont été mesurés à 26,88 ± 8,24 et 0,57 ± 0,26 nM, respectivement (Fig. 4b, c). Appartement_HER2 -OH a une spécificité très élevée pour les protéines HER2 avec un K _d valeur de 0,42 ± 0,05 nM, et cette affinité de liaison est environ 10 fois supérieure à 5 nM d'Herceptin® [45]. Cependant, l'affinité de liaison de l'Apt_HER2 nu peut être modifié par conjugaison avec les produits chimiques, les molécules ou les nanoparticules. Par conséquent, l'affinité de liaison d'Apt_HER2 pour les protéines HER2 doit être évalué après conjugaison avec les mWMNC. L'affinité de liaison d'Apt_HER2 -SH pour HER2 a été réduit par la présence d'un groupe thiol plutôt que par l'Apt_HER2 nu parce que le groupe thiol peut être lié à un autre résidu thiol dans des protéines ou d'autres aptamères modifiés par un thiol. Cependant, l'affinité de liaison d'Apt_HER2 -MNS a été mesuré comme similaire à celui d'Apt_HER2 , ce résultat signifie qu'il n'y a pas non plus assez d'Apt_HER2 non lié -SH qui peut interrompre l'interaction entre l'aptamère et la protéine HER2, ni les mWMNC n'ont pas ou très peu d'influence sur l'affinité de liaison des aptamères.

Données d'affinité de liaison de l'aptamère anti-HER2 (Apt_HER2 -OH) aptamère anti-HER2 thiolé (Apt_HER2 -SH) et Apt_HER2 -MNS sur les protéines HER2 en mesurant le test de liaison du filtre. un L'illustration schématique montrant le processus de dosage de liaison par filtre des aptamères. b La fraction liée au graphique de l'aptamère par rapport à la concentration de HER2. c Le K _d graphique des valeurs d'Apt_HER2 -OH (0,42 ± 0,05 nM, R ² = 0.99, p < 0.0001), Apt_HER2 -SH (26,88 ± 8,24 nM, R ² = 0.98, p < 0.0001), et Apt_HER2 -MNS (0,57 ± 0,26 nM, R ² = 0.91, p = 0.001) calculé à partir de b . Les barres d'erreur étaient représentées par des y positifs -axe uniquement

Des expériences d'IRM in vivo ont été réalisées à l'aide de modèles de tumeurs syngéniques de souris pour évaluer la capacité d'Apt_HER2 -MNS pour cibler les tumeurs surexprimant HER2. À l'aide d'un modèle de tumeur généré par l'implantation de cellules NIH3T6.7 dans la cuisse, une expérience d'IRM a été menée de la pré-injection à 120 min après l'injection de WMNC ou d'Apt_HER2 -MNS (Fig. 5, voir également le fichier supplémentaire 1 :Figure S4). L'effet d'amélioration du contraste T2 par les agents de contraste à base d'IONP est observé sous forme d'image plus sombre car ils induisent un effet de raccourcissement T2 autour des protons. Par conséquent, dans les analyses d'intensité du signal, les valeurs T2 ou T2* étaient représentées par R2 ou R2*. R2, une valeur inversée de T2, est utilisée pour comparer l'intensité du signal avec une valeur positive. Dans le cas des WMNC, l'intensité du signal R2 la plus élevée a été observée 30 min après l'injection de WMNC, après quoi elle a progressivement diminué (Fig. 5a, b). À 120 min après l'injection de WMNC, l'intensité du signal T2 ressemblait à l'état de pré-injection. Le taux de variation de la valeur moyenne de l'intensité du signal R2 était inférieur à 10 % ; ainsi, il était difficile à reconnaître dans l'IRM pondérée en T2 à l'œil nu. Dans l'étude précédente, il a été démontré que les nanoparticules d'oxyde de fer enveloppées de T80 s'accumulaient autour des tissus tumoraux malgré l'absence de toute partie de ciblage [46]. Cependant, dans cette étude, une dose d'agent de contraste de 1,4 mg_Fe par souris a été utilisée dans l'IRM pondérée en T2, qui était 14 fois plus élevée que la dose utilisée dans cette étude. Cela signifie que les WMNC n'ont pas pu montrer une efficacité d'amélioration du contraste efficace dans l'expérience à une dose de 0,1 mg_Fe par souris (5 mg_Fe /kg). Le changement dans la série chronologique de l'intensité du signal R2* était également inférieur à 10 %, et il n'y avait aucune signification statistique. En revanche, 120 min après l'injection, Apt_HER2 -MNS a provoqué une amélioration de l'intensité du signal 130% plus élevée qu'avant l'injection d'Apt_HER2 -MNS malgré l'utilisation de la même dose d'injection que les WMNC (Fig. 5c, d). Cette dose d'injection était 2 à 30 fois inférieure à celle d'autres études sur l'agent de contraste à base de nanoparticules magnétiques modifiées par aptamère [44, 47, 48]. Ce résultat a indiqué que Apt_HER2 -MNS a une capacité de ciblage plus élevée que les WMNC ou d'autres agents de contraste modifiés par aptamère, et a également suggéré que l'effet d'amélioration du contraste élevé d'Apt_HER2 -MNS pourrait être attendu malgré une dose plus faible que les WMNC. Le rehaussement de contraste est apparu principalement dans les vaisseaux périphériques et au centre du tissu tumoral. Bien que les vaisseaux périphériques aient été noircis peu après l'injection d'Apt_HER2 -MNS, l'amélioration du contraste au centre de la lésion tumorale est apparue pour la première fois à 60 minutes et avait tendance à augmenter jusqu'à 120 minutes.

Images IRM in vivo d'un modèle de souris tumorale HER2+ utilisant des WMNC (n = 3) ou Apt_HER2 -MNS (n = 3). un Images IRM pondérées en T2 et T2* en pré- ou post-injection de WMNC. b Graphique d'intensité relative du signal mesuré à partir de a . c Images IRM pondérées T2 et T2* en pré- ou post-injection d'Apt_HER2 -MNS. d Graphique d'intensité relative du signal et e l'histogramme d'intensité de la région tumorale mesuré à partir de c . f Données d'analyse histologique obtenues après imagerie par résonance magnétique. Les barres d'erreur étaient représentées par des y positifs -axe uniquement. Intensités relatives du signal de b , d , et e ont été mesurés à partir du retour sur investissement en rouge de a , c , et fichier supplémentaire 1 :Figure S4

Pour souligner le changement visible des effets d'amélioration du contraste avant et après l'injection d'Apt_HER2 -MNS, une analyse d'histogramme de l'intensité du signal R2 a été réalisée dans les ROI au niveau des images IRM pondérées en T2 (Fig. 5e). Étant donné que le signal T2 est apparent comme le rehaussement négatif dans les images IRM pondérées en T2, il était représenté par R2. Après injection d'Apt_HER2 -MNS, le centre de l'histogramme a été déplacé vers la droite. L'augmentation d'environ 10 % de l'amélioration du contraste a été observée lorsque la différence du centre des histogrammes a été calculée.

Pour confirmer la présence d'Apt_HER2 -MNS dans la tumeur histologiquement, une coloration au bleu de Prusse a été réalisée (Fig. 5f). Dans les tissus colorés au bleu de Prusse, le noyau et le cytoplasme ont été colorés en rose foncé ou rose clair, et plusieurs points de couleur bleue ont été observés autour des cellules tumorales. Nous avons supposé que les tissus tumoraux étaient colorés en bleu si Apt_HER2 -MNS a ciblé la tumeur. Dans les résultats de la coloration au bleu de Prusse, les points bleus ont été observés dans les tissus tumoraux, et les lames de tissus d'Apt_HER2 -MNS avait environ 3 fois plus de points bleus que ceux des WMNC. La coloration au bleu de Prusse peut détecter l'ion Fe dans les tissus; ainsi, il a été utilisé pour confirmer l'accumulation de l'agent de contraste basé sur les IONP dans les tissus tumoraux [44, 49, 50].

Conclusions

En conclusion, nous avons confirmé qu'Apt_HER2 -MNS fonctionne comme un agent de contraste IRM in vivo ciblant HER2 par caractérisation physico-chimique et expériences IRM in vivo dans des modèles de tumeurs murines exprimant HER2. Appartement_HER2 -MNS a une relaxivité et une spécificité élevées vis-à-vis de HER2, et il a démontré des effets d'amélioration du contraste marqués malgré une dose d'administration plus faible que les autres agents de contraste T2, en raison des nanoparticules d'oxyde de fer. Cet agent de contraste devrait fournir des informations concernant l'expression du cancer HER2 chez les patients atteints de cancer et pourrait être utilisé pour surveiller les patients atteints de cancer HER2+ pendant la chimiothérapie à l'aide de médicaments cibles HER2. Nous espérons que les résultats de ces travaux offriront une stratégie prometteuse pour le diagnostic du cancer surexprimant HER2 et pour le traitement des patients.