Le MicroARN-18a des Macrophages M2 Fait Progresser le Carcinome Nasopharyngé en Ciblant TGFBR3 dans la Voie TGF-β

Résumé

Objectifs

Le carcinome nasopharyngé (CNP) est un type de maladie nasopharyngée aux propriétés de métastase et d'invasion élevées. Les macrophages tumoraux activés alternativement (M2) sont liés au CNP. Cette étude vise à explorer le mécanisme et la participation du microARN-18a (miR-18a) issu des macrophages M2 dans le CNP.

Méthodes

Des cellules mononucléaires du sang périphérique ont été différenciées en macrophages puis polarisées en type M2 par l'interleukine-4. Les cellules SUNE-1 et CNE2 ont été transféctées avec miR-18a restauré ou épuisé, ou récepteur III du facteur de croissance transformant bêta (TGFBR3) pour explorer leurs rôles dans la progression du CNP avec l'implication de la voie de signalisation TGF-β. Ensuite, les cellules SUNE-1 et CNE2 ont été co-cultivées avec des macrophages M2 traités avec miR-18a restauré ou épuisé, ou TGFBR3 pour comprendre leurs rôles combinés dans le CNP avec l'implication de la voie TGF-β.

Résultats

Le miR-18a était fortement exprimé et le TGFBR3 faiblement exprimé dans les cellules CNP. La restauration du miR-18a, le knockdown de TGFBR3 ou la co-culture avec des macrophages M2 transféctés avec mimiques miR-18a ou si-TGFBR3 favorisaient la progression des cellules SUNE-1, la croissance tumorale chez la souris, diminuaient p-Smad1/t-Smad1 et augmentaient p-Smad3/t-Smad3. La downregulation du miR-18a, la surexpression de TGFBR3, ou la co-culture avec des macrophages M2 transféctés avec inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3 déprimaient la progression des cellules CNE2, la croissance tumorale chez la souris, augmentaient p-Smad1/t-Smad1 et diminuaient p-Smad3/t-Smad3.

Conclusion

Notre étude élucide que le miR-18a des macrophages M2 entraîne une progression des cellules CNP et une croissance tumorale chez les souris nues via la répression de TGFBR3, accompagnée de l'inactivation de Smad1 et l'activation de Smad3.

Introduction

Le carcinome nasopharyngé (CNP) est une tumeur maligne épithéliale sujette à l'infiltration locale et aux métastases à distance précoces [1]. Les patients CNP se plaignent souvent de paralysie du sixième nerf et du syndrome de Horner [2]. Actuellement, le traitement appliqué consiste principalement en radiothérapie, et radiothérapie combinée chimiothérapie [3]. Malheureusement, la radiothérapie et la chimiothérapie s'accompagnent inattendument de complications, et la résistance acquise à la radiothérapie entrave les résultats du CNP [3]. La recherche de thérapies ciblées potentielles est donc prioritaire.

Les microARN (miARN) dysrégulés sont documentés comme impliqués dans la tumorigénèse, métastase, invasion, et résistance à la radiothérapie et chimiothérapie du CNP [1]. En tant que sous-famille de miARN, le miR-18a facilite la progression du CNP par inhibition du suppresseur de la morphogenèse dans les organes génitaux 1 et activation de la voie mTOR [4]. De plus, le miR-18a active la prolifération et la métastase des cellules CNP via la régulation de DICER1 [5]. En outre, la progression des cellules CNP est entraînée par le miR-18a via l'altération de la biogenèse des miARN [6]. Par ailleurs, le miR-18a fonctionne critique dans la métastase du CNP [7]. Les macrophages activés alternativement (M2) sont des composants importants des tumeurs solides et hématologiques et sont liés à la progression, métastase et résistance thérapeutique [8]. Les macrophages M2 polarisés associés aux tumeurs sont associés à un mauvais pronostic du CNP [9]. Il est intriguant de noter les différences des macrophages M2 dans le CNP virus Epstein-Barr négatif et positif [10]. Une étude montre que le miR-18a inhibe la métastase hépatique des cellules de cancer du côlon en induisant des macrophages M1 [11]. Le récepteur III du facteur de croissance transformant bêta (TGFBR3) est un co-récepteur TGF-β qui fournit le ligand au récepteur TGF-β de type II pour stimuler la signalisation et l'équilibre de surface cellulaire, et le TGFBR3 soluble est un régulateur pendant la progression du cancer [12]. Un TGFBR3 faiblement exprimé induit un microenvironnement tumoral immunotolérant [13]. Inversement, la surexpression transitoire de TGFBR3 induit l'apoptose dans les cellules CNP humaines [14]. À notre connaissance, la polarisation des macrophages M2 induite par miR-181a avance la métastase des cellules tumorales médiatisée par les macrophages M2 via l'axe Kruppel-like factor 6 et CCAAT/enhancer binding protein α [15].

Collectivement, bien que de nombreuses études aient découvert les rôles indépendants du miR-18a, TGFBR3 et macrophages M2 dans le CNP, les interactions combinées entre ces trois facteurs restent élusives. Cette étude est lancée pour décrypter les mécanismes et la participation de ces facteurs dans le CNP.

Matériels et Méthodes

Déclaration d'Éthique

L'expérience a été approuvée par le comité d'éthique de l'Hôpital Third Xiangya, Université Centrale du Sud et respecte les normes d'éthique médicale. Cette étude a été menée avec le consentement écrit de tous les donneurs. Les expériences animales étaient conformes aux exigences des réglementations nationales sur la gestion et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Collecte des Cellules Mononucléaires du Sang Périphérique

Les monocytes ont été obtenus du sang périphérique de donneurs sains par méthode d'adhérence. Les échantillons de sang périphérique provenaient de donneurs sains du Département d'Hématologie de l'Hôpital Third Xiangya, Université Centrale du Sud. Les macrophages dérivés des monocytes ont été obtenus par adhérence sur plastique des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) préalablement isolées par centrifugation sur gradient de densité (Ficoll-Paque, GE Healthcare) à partir de préparations de couche leucocytaire de sang de donneurs sains. Ensuite, 2,0 × 10⁶ PBMC ont été cultivés dans le milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM) supplémenté avec 10 % de sérum humain (Millipore, Bedford, MA, USA) et pénicilline/streptomycine sur plaques 12 puits (NalgeNunc, NY, USA). Quand les PBMC adéraient au fond pendant 2–3 h, le surnageant et les PBMC en suspension étaient retirés répétitivement pour obtenir les monocytes adhérents.

Polarisation des Macrophages

Les monocytes ont été induits à se différencier en macrophages par le facteur de stimulation des colonies de macrophages humain (M-CSF) et polarisés en macrophages M2 par l'interleukine (IL)-4.

Induction des Macrophages

Les monocytes ont été cultivés en DMEM avec 20 % de sérum fœtal bovin (FBS) et additionnés de M-CSF (100 µg, Peprotech, NJ, USA) à la concentration finale de 100 ng/mL. Le milieu était renouvelé de moitié tous les 3 jours et supplémenté à nouveau avec 100 ng/mL M-CSF. Cultivés jusqu'au 7–8ᵉ jour, une partie des cellules étaient récoltées, et les marqueurs de surface des macrophages CD68 [16], CD163 [17], et CD206 [18] étaient testés par immunofluorescence [19] pour identifier les macrophages.

Polarisation des Macrophages

Les macrophages étaient polarisés en macrophages M2 par ajout de 20 ng/mL IL-4 (Peprotech) au milieu de différenciation pendant 24 h supplémentaires. Une partie des échantillons de macrophages M2 était utilisée pour la détection par cytométrie de flux. Les échantillons étaient divisés en 3 tubes : tube 1 même lot de macrophages adhérents sans stimulation IL-4 ; tubes 2 et 3 macrophages adhérents stimulés par IL-4. Les échantillons étaient dilués à ~10 000 cellules au chargement et additionnés d'immunoglobuline G non spécifique pour bloquer le récepteur Fc. Puis additionnés d'anticorps isotype non spécifique, anticorps CD68 marqué PE, et anticorps CD163 marqué PE (tous deux de Biolegend, CA, USA). Incubation 30 min, rinçage avec 0,5 % albumine sérique bovine dans PBS, centrifugation et mise en suspension cellulaire avec 500 µL PBS pour détection.

RT-qPCR

La RT-qPCR a été employée pour détecter l'expression de miR-18a, CCL22, récepteur γ activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR-γ), et ARNm TGFBR3 dans les cellules collectées.

L'ARN total a été extrait des cellules par Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et rétrotranscrit en ARN complémentaire par le kit Mir-X miRNA First Strand Synthesis (Clontech, Mountain View, CA, USA) pour miR-18a et le kit PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, Chine) pour CCL22, PPAR-γ, et TGFBR3. U6 et glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) étaient contrôles de charge pour miR-18a, CCL22, PPAR-γ, et TGFBR3. Le SYBR® Premix Ex Taq™ II (Perfect Real Time) (Takara) dans un système LightCycler 480 II (Roche Diagnostics, Indiana, USA) a été utilisé pour la PCR. Le calcul des données a été évalué par la méthode 2^(-ΔΔCT). Les amorces PCR sont présentées dans le Tableau 1.

Western Blot

Le Western blot a été appliqué à la détection de TGFBR3, Smad1 total (t), Smad1 phosphorylé (p), t-Smad3, et p-Smad3 dans les cellules collectées.

La protéine totale des cellules a été extraite et la concentration déterminée par le kit d'acide bicinchonique. L'échantillon de protéine a été chargé dans les puits en électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS et transféré sur membrane PVDF. La membrane PVDF a été bloquée avec du lait écrémé et incubée avec les anticorps primaires TGFBR3 (1:2000, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), t-Smad1 (1:1000), p-Smad1 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), t-Smad3 (1:1000), p-Smad3 (1:1000), et GAPDH (1:1000, tous d'Abcam, Cambridge, MA, UK), suivi d'incubation avec l'anticorps secondaire marqué peroxydase de raifort (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, USA). Lavée 3 fois avec tampon tris salin + Tween 20, la membrane a été révélée par chimiluminescence amplifiée. La quantification des signaux a été réalisée par le logiciel ImageJ du NIH avec normalisation de l'intensité de signal sur GAPDH.

Culture et Criblage Cellulaires

Les lignées cellulaires humaines de CNP CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1 et la lignée cellulaire nasopharyngée humaine normale NP96 (Instituts de Shanghai pour les Sciences Biologiques, Académie Chinoise des Sciences, Shanghai, Chine) ont été cultivées en milieu RPMI-1640 (Gibco, CA, USA) contenant FBS (Gibco), 100 µg/mL pénicilline et 100 µg/mL streptomycine et passagées à 80 % de confluence. La RT-qPCR a été utilisée pour détecter l'expression de miR-18a. Parmi ces lignées CNP, les cellules CNE2 et SUNE-1 montraient les plus grandes et plus petites différences d'expression de miR-18a par rapport aux cellules NP96, ainsi elles ont été sélectionnées pour les essais de downregulation ou upregulation de miR-18a.

Groupement et Traitement Cellulaires

Parmi toutes les lignées CNP, les cellules SUNE-1 avec la plus petite différence des cellules NP96 en expression miR-18a ont été sélectionnées. Guidées par les spécifications de Lipofectamine 2000 (Invitrogen), les cellules SUNE-1 ont été transféctées avec mimiques miR-18a, mimiques miR-18a contrôle négatif (NC), si-TGFBR3, ou si-TGFBR3 NC.

Parmi toutes les lignées CNP, les cellules CNE2 avec la plus grande différence des cellules NP96 en expression miR-18a ont été sélectionnées et transféctées avec inhibiteurs miR-18a, inhibiteurs miR-18a NC, surexpression (OE)-TGFBR3 ou OE-TGFBR3 NC par Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Guidées par les spécifications de Lipofectamine 2000 (Invitrogen), les macrophages M2 ont été transféctés avec mimiques miR-18a, mimiques miR-18a NC, si-TGFBR3, si-TGFBR3 NC, inhibiteurs miR-18a, inhibiteurs miR-18a NC, OE-TGFBR3, ou OE-TGFBR3 NC.

Co-culture Macrophages M2 et Cellules CNP

La co-culture en chambre Transwell a été adoptée pour explorer les effets du miARN des macrophages M2 sur les cellules CNP. La chambre supérieure était remplie de macrophages M2 avec une taille de pore de 0,4 µm, qui stoppait seulement les cellules de la chambre supérieure mais pas les petites molécules sécrétées (vésicules, facteurs de croissance, nutriments, etc.). La chambre inférieure était ensemencée avec les cellules CNP.

Les cellules SUNE-1 et CNE2 étaient incubées en FBS normal (Gibco). Les cellules en phase de croissance logarithmique étaient adoptées pour les expériences.

Les cellules SUNE-1 et CNE2 étaient co-cultivées avec macrophages M2 en milieu RPMI-1640 10 % FBS (tous deux Gibco) dans un plat de culture cellulaire avec insert Transwell (Coring, Corning, NY, USA) à pores de 0,4 µm.

Les cellules SUNE-1 n'étaient pas co-cultivées avec macrophages M2, ou co-cultivées avec macrophages M2, macrophages M2 transféctés mimiques miR-18a, mimiques miR-18a NC, si-TGFBR3, ou si-TGFBR3 NC.

Les cellules CNE2 n'étaient pas co-cultivées avec macrophages M2, ou co-cultivées avec macrophages M2, macrophages M2 transféctés inhibiteurs miR-18a, inhibiteurs miR-18a NC, OE-TGFBR3, ou OE-TGFBR3 NC.

Test MTT

La viabilité cellulaire a été testée par le test MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide), un test colorimétrique déterminant l'activité de la déshydrogénase mitochondriale qui réduit le MTT en formazan.

Trypsinisées et ensemencées en plaques 96 puits à 4 × 10⁴ cellules/puits, les cellules étaient privées de milieu de culture aux 0, 12ᵉ, 24ᵉ, 36ᵉ, et 48ᵉ h, et supplémentées avec solution MTT (500 µL, 0,5 g/L). Incubées 4 h, le surnageant était éliminé et les cellules incubées avec 200 µL solution DMSO. La densité optique (DO, 490 nm) était mesurée sur un lecteur de microplaques (ELX808IU, BioTek, VT, USA). Chaque groupe comportait 6 puits parallèles.

Test de Formation de Colonies

La capacité de formation de colonies des cellules CNP a été testée par test de formation de colonies, reflétant la dépendance de la population cellulaire et la prolifération clonale.

Cultivées 24 h et détachées avec 0,25 % trypsine, 300 cellules étaient ensemencées dans un plat 35 mm avec 3 puits parallèles par groupe. Avec renouvellement du milieu tous les 3 jours, les cellules étaient cultivées une semaine et fixées avec 5 mL paraformaldéhyde 4 %. Ensuite, les cellules étaient colorées par solution de violet de cristal et séchées à l'air. Le plat était inversé sur lequel un film transparent à grille était superposé, et le nombre de colonies (> 50 cellules) était compté au microscope (Olympus, Tokyo, Japon).

Test de Griffure

La migration cellulaire a été testée par test de griffure. Les cellules étaient trypsinisées, ensemencées en plaques 6 puits avec 3 puits parallèles par groupe, et cultivées à 90 % de confluence. Puis, les cellules étaient incubées en milieu 2 % FBS et des griffures verticales étaient tracées par une pointe de 100 µL. Les cellules étaient photographiées aux 0 et 24ᵉ h sous microscope inversé pour mesurer la distance de migration.

Test Transwell

L'invasion et la migration cellulaire ont été testées par test Transwell. La chambre supérieure du Transwell était pré-imprégnée et additionnée de 100 µL Matrigel (Coring) dilué par milieu RPMI 1640 sans sérum à 1:100. Les chambres supérieure et inférieure étaient additionnées de 200 µL et 600 µL milieu RPMI 1640 sans sérum respectivement. Ensuite, la chambre inférieure recevait 600 µL milieu RPMI 1640 contenant 10 % FBS tandis que la supérieure 200 µL suspension cellulaire (12,5 × 10⁴ cellules/mL). Incubation 40 h, les cellules étaient colorées par violet de cristal et essuyées avec un coton-tige pour compter les cellules ayant traversé le Matrigel au microscope.

Cytométrie de Flux

L'apoptose cellulaire et la distribution du cycle cellulaire ont été déterminées par cytométrie de flux.

La distribution du cycle cellulaire a été évaluée par coloration iodure de propidium (PI). Les cellules étaient ensemencées en plaques 6 puits à 4 × 10⁵ cellules/puits, cultivées à 70–80 % confluence. Fixées dans l'éthanol 70 % pré-refroidi pendant la nuit, les cellules étaient centrifugées (surnageant éliminé), additionnées de RNAase (1 g/L, 200 µL) et Triton X-100 (2 µL), et colorées par solution PI 30 min. Ensuite, la distribution du cycle cellulaire était détectée par cytomètre de flux (BD Bioscience, NJ, USA) à 488 nm selon les intensités de fluorescence différentes à chaque phase (G0/G1, S, G2/M).

L'apoptose cellulaire a été mesurée par double coloration Annexin V-FITC (fluorescéine isothiocyanate) et PI. Les cellules étaient resuspendues dans 500 µL tampon de liaison et colorées par 5 µL solution Annexin V-FITC et 10 µL solution PI. L'apoptose était aussi testée par cytomètre de flux (BD Bioscience) dans les 30 min sans exposition à la lumière. Sur le nuage de points, les cellules vivantes en quadrant inférieur gauche (Q4) étaient FITC⁻/PI⁻, les cellules apoptotiques précoces en quadrant inférieur droit (Q3) FITC⁺/PI⁻, et les cellules nécrotiques et apoptotiques tardives en quadrant supérieur droit (Q2) FITC⁺/PI⁺. Taux d'apoptose = % apoptose précoce (Q3) + % apoptose tardive (Q2).

Xénogreffes Tumorales chez Souris Nues

La croissance tumorale a été observée en établissant un modèle de CNP chez souris nues. Détachées par 0,25 % trypsine, les cellules SUNE-1 et CNE2 en phase logarithmique étaient configurées en suspension cellulaire unique à 5 × 10⁷ cellules/mL. La suspension (0,2 mL) était injectée à l'aisselle droite des souris par micro-injecteur pour établir les modèles. Les souris modélisées étaient élevées en environnement exempt de pathogènes spécifiques. À partir du 4ᵉ jour, la croissance tumorale était observée et les souris pesées tous les 4 jours. Les souris nues étaient euthanasiées au 20ᵉ jour post-injection et les tumeurs résecquées, pesées par balance électronique et photographiées.

Test Double Luciférase Reporter

Le système double luciférase reporter a été adopté pour confirmer les sites de liaison du miR-18a et de la région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm TGFBR3. Un site web de prédiction biologique (https://www.microrna.org/microrna/home.do) a été utilisé pour analyser le gène cible du miR-18a, et découvrir l'existence du site de liaison complémentaire du miR-18a sur la 3'UTR de TGFBR3. Le test double luciférase reporter a été employé pour vérifier si TGFBR3 était directement ciblé par miR-18a. Un pmirGLO-TGFBR3-type sauvage (WT) et un pmirGLO-TGFBR3-type mutant (MUT) du site de liaison 3'UTR de TGFBR3 ont été construits. TGFBR3-WT ou TGFBR3-MUT et mimiques miR-18a ou mimiques NC étaient co-transféctés dans les cellules SUNE-1 et CNE2 par Lipofectamine 2000 (Invitrogen) et incubés 48 h. Un kit de test luciférase (Promega, Madison, WI, USA) a été utilisé pour analyser les cellules.

Analyse Statistique

Le logiciel statistique SPSS21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) a été utilisé pour l'analyse. Les données étaient exprimées en moyenne ± écart-type. Les différences entre deux groupes étaient analysées par test t, tandis que les différences entre groupes multiples par ANOVA à un facteur, suivi du test post-hoc de Tukey. Une différence significative était considérée à P < 0,05.

Résultats

Identification des Macrophages M2

Les monocytes enrichis par adhérence et induits par M-CSF ont été collectés du sang périphérique de donneurs sains. La détection par immunofluorescence de CD68, CD206, CD163 a confirmé que les PBMC induits par M-CSF in vitro se transformaient en macrophages avec caractéristiques moléculaires typiques, répondant à nos exigences (Fig. 1a).

Les macrophages obtenus étaient polarisés par IL-4 et observés au microscope pour la morphologie. Les macrophages (M0) sans stimulation IL-4 étaient divers et irréguliers, forme ronde, ovale ou fusiforme. Stimulés par IL-4, les macrophages M2 devenaient plus grands et prédominamment ronds, conformes aux caractéristiques morphologiques des macrophages M2 décrites antérieurement [20] (Fig. 1b).

La cytométrie de flux a testé les antigènes de surface des cellules adhérentes stimulées par 20 ng/mL IL-4 pendant 24 h : CD68 exprimé à 21,16 % tandis que CD163 à 98,69 % du nombre total de cellules (Fig. 1c), confirmant les cellules adhérentes comme macrophages M2. La RT-qPCR a révélé que par rapport aux cellules M0, CCL22 et PPAR-γ (molécules de polarisation typiques) augmentaient dans les macrophages M2 (Fig. 1d, e), indiquant l'induction réussie des macrophages M2.

La RT-qPCR a aussi montré que l'expression de miR-18a augmentait dans les macrophages M2 par rapport aux macrophages M0 (P < 0,05) (Fig. 1f).

Le miR-18a est Hautement Exprimé et TGFBR3 Faiblement Exprimé dans les Cellules CNP

Le site bioinformatique (miRanda) a prédit les cibles potentielles du miR-18a et TGFBR3 a été considéré comme une cible du miR-18a (Fig. 2a). Le test double luciférase reporter a vérifié que miR-18a ciblait la 3'UTR de TGFBR3. TGFBR3-WT ou TGFBR3-MUT clonés dans le vecteur pmirGLO et co-transféctés avec mimiques miR-18a ou NC dans cellules SUNE-1 et CNE2. Les mimiques miR-18a n'avaient pas d'influence sur l'activité luciférase de TGFBR3 3'UTR-MUT mais l'altéraient pour TGFBR3 3'UTR-WT dans les deux lignées, suggérant que TGFBR3 était un gène cible régulé par miR-18a (Fig. 2b).

L'efficacité de transfection des mimiques ou inhibiteurs miR-18a dans macrophages M2 a été manifestée par la détermination de l'expression miR-18a et TGFBR3 dans macrophages M2 par RT-qPCR et Western blot. Il était évident (Fig. 2c, d) que la surexpression miR-18a augmentait l'expression miR-18a et réduisait TGFBR3 dans macrophages M2. Inversement, l'inhibition miR-18a réduisait l'expression miR-18a et augmentait TGFBR3 dans macrophages M2. Aucune différence n'était observée dans l'expression miR-18a tandis que TGFBR3 diminuait quand macrophages M2 transféctés avec si-TGFBR3. Aucune différence dans l'expression miR-18a tandis que TGFBR3 augmentait sur transfection OE-TGFBR3 aux macrophages M2.

L'expression miR-18a et TGFBR3 dans lignées CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1, NP96 a été testée par RT-qPCR et Western blot. Dans les cellules CNP, par comparaison avec NP96, l'expression miR-18a augmentait et TGFBR3 diminuait (Fig. 2e). Du fait que cellules CNE2 et SUNE-1 manifestaient les plus grandes et plus petites différences d'expression miR-18a par rapport à NP96, elles ont été sélectionnées pour les essais subséquents de downregulation et upregulation de miARN.

Pour identifier les effets du miR-18a et TGFBR3 sur les cellules CNP, les cellules SUNE-1 étaient transféctées avec mimiques miR-18a ou si-TGFBR3 tandis que cellules CNE2 avec inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3. RT-qPCR et Western blot ont démontré que mimiques miR-18a augmentaient l'expression miR-18a et réduisaient TGFBR3 dans cellules SUNE-1. La transfection si-TGFBR3 n'avait pas d'effet sur l'expression miR-18a mais réduisait TGFBR3 dans cellules SUNE-1. Les inhibiteurs miR-18a diminuaient l'expression miR-18a et augmentaient TGFBR3 dans cellules CNE2. La transfection OE-TGFBR3 dans cellules CNE2 n'affectait pas l'expression miR-18a mais augmentait TGFBR3 (Fig. 2f, g).

Pour explorer les effets du miR-18a des macrophages M2 sur les cellules CNP, macrophages M2 transféctés mimiques miR-18a ou si-TGFBR3, ou inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3 étaient co-cultivés avec cellules SUNE-1 ou CNE2 en chambre Transwell. RT-qPCR et Western blot ont testé l'expression miR-18a et TGFBR3 dans cellules SUNE-1 ou CNE2. Cellules SUNE-1 co-cultivées avec macrophages M2 non transféctés ou transféctés mimiques miR-18a montraient une expression miR-18a augmentée et TGFBR3 dégradée. Aucune différence dans l'expression miR-18a et TGFBR3 réduite dans cellules SUNE-1 co-cultivées avec macrophages M2 transféctés si-TGFBR3 (Fig. 2h). Après co-culture avec macrophages M2 non transféctés, cellules CNE2 présentaient une expression miR-18a augmentée et TGFBR3 diminuée. Cependant, expression miR-18a réduite et TGFBR3 élevée dans cellules CNE2 pré-co-cultivées avec macrophages M2 transféctés inhibiteurs miR-18a. Aucune différence dans l'expression miR-18a, et TGFBR3 augmentée dans cellules CNE2 co-cultivées avec macrophages M2 transféctés OE-TGFBR3 (Fig. 2i).

Le miR-18a des Macrophages M2 Favorise la Viabilité et la Capacité de Formation de Colonies des Cellules CNP

Les tests MTT et formation de colonies ont été appliqués pour identifier les impacts du miR-18a et TGFBR3 sur la viabilité et la capacité de formation de colonies des cellules SUNE-1 et CNE2. Mimiques miR-18a, inhibiteurs miR-18a, si-TGFBR3, ou OE-TGFBR3 étaient transféctés dans cellules SUNE-1 ou CNE2. Il était indiqué que dans cellules SUNE-1, l'upregulation miR-18a ou downregulation TGFBR3 améliorait la viabilité cellulaire et augmentait le nombre de colonies (Fig. 3a, e). Dans cellules CNE2, la viabilité était altérée et le nombre de colonies réduit par inhibition miR-18a ou surexpression TGFBR3 (Fig. 3b, f).

Pour examiner les effets du miR-18a des macrophages M2 sur la viabilité et la capacité de formation de colonies des cellules CNP, macrophages M2 transféctés mimiques miR-18a, inhibiteurs miR-18a, si-TGFBR3, ou OE-TGFBR3 étaient co-cultivés avec cellules SUNE-1 ou CNE2 en chambre Transwell. MTT et test formation de colonies ont montré que cellules SUNE-1 co-cultivées avec macrophages M2 non transféctés, ou transféctés mimiques miR-18a ou si-TGFBR3 présentaient une viabilité renforcée et un nombre de colonies accru (Fig. 3c, g).

Cellules CNE2 co-cultivées avec macrophages M2 non transféctés présentaient une viabilité renforcée et colonies accrues. Cependant, cellules CNE2 co-cultivées avec macrophages M2 transféctés inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3 présentaient une viabilité diminuée et colonies réduites (Fig. 3d, h).

Le miR-18a des Macrophages M2 Favorise les Capacités d'Invasion et Migration des Cellules CNP

Pour mieux comprendre comment miR-18a et TGFBR3 affectaient migration et invasion des cellules CNP, test de griffure et test Transwell ont été implémentés. Les résultats ont révélé que cellules SUNE-1 transféctées mimiques miR-18a ou si-TGFBR3 étaient caractérisées par une distance de migration cellulaire accrue et cellules invasives (Fig. 4a et 5a).

Dans cellules CNE2 transféctées inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3, des réductions apparaissaient en distance de migration et cellules invasives (Fig. 4b et 5b).

Comment le miR-18a des macrophages M2 influençait invasion et migration des cellules CNP a été déchiffré par co-culture de macrophages M2 transféctés mimiques miR-18a, inhibiteurs miR-18a, si-TGFBR3, ou OE-TGFBR3 avec cellules SUNE-1 ou CNE2. Les résultats ont montré que cellules SUNE-1 co-cultivées avec macrophages M2 non transféctés, ou transféctés mimiques miR-18a ou si-TGFBR3 manifestaient une distance de migration et cellules invasives accrues (Fig. 4c et 5c).

À la fois distance de migration et cellules invasives augmentaient dans cellules CNE2 co-cultivées avec macrophages M2 non transféctés. Sur co-culture avec macrophages M2 transféctés inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3, cellules CNE2 montraient distance de migration et cellules invasives réduites (Fig. 4d et 5d).

Le miR-18a des Macrophages M2 Arrête Moins de Cellules CNP en Phase G0/G1 et Supprime l'Apoptose

La distribution du cycle cellulaire et l'apoptose ont été testées par cytométrie de flux pour stratifier les effets du miR-18a et TGFBR3 sur les cellules CNP. Il était indiqué que transfection mimiques miR-18a ou si-TGFBR3 réduisait les cellules SUNE-1 arrêtées en phase G0/G1, augmentait cellules en phases S et G2/M, et réduisait le taux d'apoptose (Fig. 6a et 7a).

Sur transfection inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3, cellules CNE2 en phase G0/G1 tendaient vers une élévation tandis que celles en phases S et G2/M vers une réduction, et taux d'apoptose augmentait (Fig. 6b et 7b).

Pour décoder le mécanisme du miR-18a des macrophages M2 dans la distribution du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules CNP, macrophages M2 transféctés mimiques miR-18a, inhibiteurs miR-18a, si-TGFBR3, ou OE-TGFBR3 étaient co-cultivés avec cellules SUNE-1 ou CNE2 en chambre Transwell. Co-cultivées avec macrophages M2 non transféctés, ou transféctés mimiques miR-18a ou si-TGFBR3, cellules SUNE-1 montraient moins de cellules en phase G0/G1 et plus en phases S et G2/M, et taux d'apoptose diminué (Fig. 6c et 7c).

Co-cultivées avec macrophages M2 non transféctés, cellules CNE2 en phase G0/G1 réduisaient, cellules en phases S et G2/M augmentaient, et taux d'apoptose déclinait. Inversement, co-cultivées avec macrophages M2 transféctés inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3, cellules CNE2 en phase G0/G1 augmentaient tandis que celles en phases S et G2/M diminuaient, et taux d'apoptose augmentait (Fig. 6d et 7d).

Le miR-18a des Macrophages M2 Réduit p-Smad1/t-Smad1 et Élève p-Smad3/t-Smad3 dans les Cellules CNP

Le Western blot a détecté les protéines liées à la voie de signalisation TGF dans les cellules CNP pour expliquer les effets du miR-18a et TGFBR3 sur la voie TGF.

Il a été expliqué que transfection mimiques miR-18a ou si-TGFBR3 réduisait p-Smad1/t-Smad1 et élevait p-Smad3/t-Smad3 dans cellules SUNE-1 (Fig. 8a).

Transfection inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3 entraînait déclin p-Smad3/t-Smad3 et augmentation p-Smad1/t-Smad1 dans cellules CNE2 (Fig. 8b).

Le miR-18a des macrophages M2 influençant la voie TGF dans cellules CNP a été déterminé par Western blot en testant protéines voie TGF dans cellules SUNE-1 et CNE2 co-cultivées avec macrophages M2 transféctés mimiques miR-18a, inhibiteurs miR-18a, si-TGFBR3, ou OE-TGFBR3 en chambre Transwell.

Cellules SUNE-1 co-cultivées avec macrophages M2 non transféctés, transféctés mimiques miR-18a, ou transféctés si-TGFBR3 manifestaient p-Smad1/t-Smad1 réduit et p-Smad3/t-Smad3 incrémental (Fig. 8c).

Co-cultivées avec macrophages M2 non transféctés, cellules CNE2 tendaient vers p-Smad1/t-Smad1 déclinant et p-Smad3/t-Smad3 élevé. Inversement, cellules CNE2 démontraient p-Smad1/t-Smad1 augmenté et p-Smad3/t-Smad3 diminué quand co-cultivées avec macrophages M2 transféctés inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3 (Fig. 8d).

Le miR-18a des Macrophages M2 Induit la Croissance Tumorale chez Souris Nues avec CNP

Les xénogreffes tumorales ont été conduites sur souris nues pour élucider les impacts du miR-18a et TGFBR3 sur la croissance tumorale du CNP.

Il était indiqué qu'injectées avec cellules SUNE-1 transféctées mimiques miR-18a ou si-TGFBR3, les souris manifestaient volume tumoral élargi et poids tumoral plus lourd (Fig. 9a).

Volume tumoral réduit et poids réduit étaient présentés chez souris injectées avec cellules CNE2 transféctées inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3 (Fig. 9b).

La croissance tumorale était observée chez souris injectées avec macrophages M2 transféctés mimiques miR-18a, inhibiteurs miR-18a, si-TGFBR3, ou OE-TGFBR3 pour illustrer le mécanisme du miR-18a des macrophages M2 dans le CNP.

Après co-culture avec macrophages M2 non transféctés, transféctés mimiques miR-18a ou si-TGFBR3, cellules SUNE-1 injectées dans souris montraient volume tumoral plus large et poids plus lourd (Fig. 9c).

Cellules CNE2 co-cultivées avec macrophages M2 et injectées dans souris suggéraient volume et poids tumoraux croissants. Les deux volume et poids tumoraux inclinaient à réduire quand souris injectées avec cellules CNE2 co-cultivées avec macrophages M2 transféctés inhibiteurs miR-18a ou OE-TGFBR3 (Fig. 9d).

Discussion

Le CNP désigne une maladie polygénique menacée par une large gamme de facteurs [21]. Les miARN sont antérieurement impliqués dans la pathogenèse du CNP via régulation de leurs gènes cibles indicateurs de processus cellulaires et voies [22]. Concrètement, le miR-18a avance la progression du CNP par altération de la biogenèse des miARN [6]. Cette étude va de l'avant pour décrypter les interactions combinées du miR-18a des macrophages M2 et TGFBR3 dans le CNP avec la conclusion élucidée que le miR-18a des macrophages M2 stimule la progression du CNP via l'inhibition de TGFBR3 (Fig. 10).

Au début de cette étude, les macrophages sont stimulés par IL-4 pour se différencier en macrophages M2 qui enrichissent l'expression du miR-18a. Pendant la polarisation des macrophages, l'expression des miARN était altérée [23]. De plus, la polarisation M2 enrichit les gènes impliqués dans le cycle cellulaire et processus métaboliques, et le phénotype M2 est propice à la croissance tumorale et angiogenèse dans tissus néoplasiques [24]. Basé sur le miR-18a enrichi par macrophages M2, une série d'expériences a été menée avec succès.

Initialement, notre étude a découvert que miR-18a est hautement exprimé tandis que TGFBR3 faiblement exprimé dans cellules CNP. D'après une étude antérieure, miR-18a est surexprimé dans tissus CNP avec association à métastase ganglionnaire et stade clinique [5]. De plus, les membres du cluster miR-17-92 incluant miR-18a sont documentés surexprimés dans tissus CNP [25]. En outre, miR-18a upregulé est rapporté dans tissus CNP lié au stade métastase ganglionnaire et taille tumorale [4]. Expérimentalement, sauf pour TGFBR3 downregulé dans carcinome épidermoïde de la langue [26], une autre étude dépeint TGFBR3 réduit dans carcinomes à cellules claires rénaux accompagné de pronostic défavorable [27]. Quoi qu'il en soit, les résultats de cette étude sont cohérents avec ces découvertes dans une certaine mesure.

Pour explorer les rôles du miR-18a et TGFBR3 dans la progression des cellules CNP, nous avons conduit une série d'essais avec résultats indiquant que miR-18a upregulé ou TGFBR3 downregulé déclenche la progression des cellules CNP tandis que répression miR-18a ou élévation TGFBR3 a effets opposés. Largement, la suppression de miR-18a entrave la progression cellulaire dans malignités incluant cancer ovarien, cancer colorectal associé à colite, et carcinome hépatocellulaire [28,29,30]. Étroitement, une étude existante a prononcé que miR-18a upregulé favorise progression cellules CNP via médiation DICER1 [6]. De plus, miR-18a surexprimé dans CNP est cru lié à métastase CNP et miR-18a réprimé contribue partiellement à meilleur pronostic patients CNP [31]. Récemment, downregulation miR-18a capable de décourager prolifération, invasion, migration CNP [4]. De plus, diminution expression TGFBR3 considérée liée à invasion carcinome épidermoïde laryngé (LSCC) et axe miR-223/TGFBR3 participe inhibition progression LSCC [32]. Élévation TGFBR3 documentée pour restreindre viabilité cellules CNP, induire apoptose, activer voies pro-apoptotiques [14]. Précédemment, étude a indiqué que upregulation TGFBR3 favorise apoptose et cellules arrêtées phase G2/M, résultant viabilité et migration altérées dans carcinome kystique adénoïde glandes salivaires [33]. Intriguant, il est anciennement décrit que induction TGFBR3 contribue à perturber progression cholangiocarcinome intrahépatique [34].

Malgré le rôle protecteur de miR-18a faiblement exprimé et TGFBR3 surexprimé dans cellules CNP in vitro, nous avons réalisé xénogreffes tumorales chez souris nues in vivo pour vérification supplémentaire avec résultats expliquant que knockdown miR-18a ou élévation TGFBR3 retient croissance tumorale chez souris nues. Comme démontré dans étude antérieure, souris nues injectées miR-18a montrent croissance tumorale accrue [5] et inversement, souris nues injectées antagomir miR-18a affichent croissance tumorale supprimée dans CNP [4]. Au vu de réduction TGFBR3 dans croissance tumorale, il est suggéré que TGFBR3 faiblement exprimé provoque formation tumeur dans carcinome rénal à cellules claires [27]. Inversement, augmentation TGFBR3 reconnue pour entraver croissance tumorale dans cancer poumon avec présence ARN long non-codant ADAM métallopeptidase avec motif thrombospondine type 1, 9 antisense RNA 2 élévation, et suppression miR-223-3p [35]. Cette étude a aussi prédit et vérifié que TGFBR3 est gène cible de miR-18a. Mais, plus d'études nécessaires pour vérification supplémentaire.

Conclusion

Généralement, cette étude élabore les mécanismes concrets par lesquels le miR-18a des macrophages M2 inhibe l'expression de TGFBR3 pour exacerber la progression du CNP via la voie de signalisation TGF-β, résultats abrogés par knockdown miR-18a ou élévation TGFBR3. Cette étude met à jour la cible thérapeutique pour le CNP. Cependant, des recherches sur large cohorte sont encore nécessaires pour explorations approfondies.

Disponibilité des Données et Matériaux

Non applicable.