Le MicroARN-499-5p restaure la fonction pulmonaire dans la lésion induite par la sepsis en ciblant Sox6

Résumé

Contexte

Les microARN (miARN) sont connus pour participer à la sepsis ; nous visons donc à discuter l'effet protecteur du miR-499-5p ciblant la boîte à groupe de mobilité élevée liée à la région déterminante du sexe Y 6 (Sox6) sur la lésion pulmonaire induite par la sepsis chez la souris.

Méthodes

Le modèle de lésion pulmonaire induite par sepsis a été établi par ligature et ponction cécale. Le rapport poids humide/poids sec (P/H), l'expression du miR-499-5p, Sox6, Caspase-3 et Caspase-9 dans les tissus pulmonaires de souris ont été testés. Le score de lésion pulmonaire, les fibres de collagène et le degré de fibrose pulmonaire dans les tissus pulmonaires ont été déterminés. De plus, l'apoptose cellulaire dans les tissus pulmonaires a été mesurée. Les teneurs en facteurs inflammatoires et les indices de stress oxydatif dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) et les tissus pulmonaires ont été détectés via des essais de perte et de gain de fonction. La relation de ciblage entre miR-499-5p et Sox6 a été vérifiée.

Résultats

Le rapport P/H et Sox6 étaient augmentés tandis que miR-499-5p était diminué dans les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis. La restauration de miR-499-5p ou l'appauvrissement de Sox6 a atténué la pathologie des tissus pulmonaires, réduit le score de lésion pulmonaire, les fibres de collagène, le degré de fibrose pulmonaire, les cellules positives TUNEL, l'expression protéique de Caspase-3 et Caspase-9 et les teneurs en facteurs inflammatoires dans le BALF et les tissus pulmonaires ainsi que la réponse au stress oxydatif dans les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis. miR-499-5p cible Sox6.

Conclusion

Une forte expression de miR-499-5p peut atténuer l'apoptose cellulaire dans les tissus pulmonaires et inhiber l'inflammation de la lésion pulmonaire induite par sepsis chez la souris via l'appauvrissement de Sox6, et constitue un marqueur candidat potentiel et une cible thérapeutique pour la lésion pulmonaire induite par sepsis.

Introduction

La sepsis est une inflammation systémique résultant d'une infection et causant des dysfonctionnements multiviscéraux, incluant le syndrome de détresse respiratoire aiguë. Elle se caractérise par une hypotension profonde, une hypoxémie progressive, des dommages tissulaires et des changements inflammatoires. Le poumon est l'organe le plus critique et vulnérable dans la sepsis, et la lésion pulmonaire aiguë (LPA) est une maladie inflammatoire fréquente induite par la sepsis. La gravité de la LPA induite par sepsis peut être attribuée à une perméabilité altérée du réseau alvéolo-capillaire, résultant en une réduction de l'apport en oxygène. L'apoptose des cellules pulmonaires est un facteur critique dans la lésion pulmonaire induite par sepsis. La pathophysiologie de la LPA induite par sepsis est inconnue, les mesures de soutien et les antibiotiques sont les seuls traitements disponibles chez les patients atteints de sepsis et LPA, et leur impact sur les taux de mortalité élevés de la sepsis est limité.

Les microARN (miARN) sont de petits segments d'ARN non codants exprimés endogènement, consistant en environ 18-24 nucléotides, qui peuvent contrôler une large gamme de fonctions cellulaires et se lier aux régions cibles d'un gène particulier pour contrôler leur expression en inhibant ou activant la traduction/transcription de l'ARNm. Le miR-499-5p est un membre récemment découvert des miARN codés par la myosine. Une étude a rapporté que les taux sériques de miR-499-5p pourraient être utilisés pour indiquer l'insuffisance d'organes chez les patients atteints de sepsis. Une autre étude a révélé que l'expression de miR-499-5p participe à l'apoptose cardiaque induite par sepsis. La famille de la boîte à mobilité élevée (HMG) liée à la région déterminante du sexe Y (SRY) (SOX) est définie par un ensemble de gènes incluant un domaine de liaison à l'ADN de classe HMG, dont l'identité de séquence avec SRY est supérieure à 50 %. Le facteur de transcription Sox6 fait partie de la famille de la boîte HMG liée à SRY et est exprimé dans de multiples tissus au cours de la progression, où il joue un rôle critique dans la transition des cellules progénitrices proliférantes vers des cellules fonctionnellement matures. Une étude rapporte que l'augmentation de Sox6 est impliquée dans l'apoptose cardiaque induite par sepsis. Des études ont montré que l'expression de Sox2 et Sox4 est accrue dans le cancer pulmonaire à petites cellules humain. Mais la relation entre Sox6 et la lésion pulmonaire induite par sepsis nécessite une étude plus approfondie. Ainsi, notre étude visait à explorer l'effet protecteur du miR-499-5p sur la lésion pulmonaire induite par sepsis chez la souris en ciblant Sox6.

Matériels et Méthodes

Conformité aux normes éthiques

Tous les expériences animales étaient conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts Nationaux de Santé. Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique des expériences animales de l'Hôpital Municipal de Weihai, Collège de Médecine Cheeloo, Université du Shandong.

Animaux d'expérience

Des souris mâles saines, exemptes de pathogènes spécifiques, de grade BALB/c (âgées de 6-8 semaines, poids 18-22 g) ont été achetées au centre d'animaux expérimentaux de l'Université du Shandong (Shandong, Chine). L'environnement était réglé à 24 ± 2 °C avec un cycle jour-nuit de 12 h alterné. Les souris avaient un accès libre à une nourriture aseptique et de l'eau stérile. Les expériences ont commencé après une adaptation de 7 jours.

Établissement du modèle de lésion pulmonaire induite par sepsis par ligature et ponction cécale (CLP) chez la souris

Les souris ont été réparties aléatoirement en 2 groupes : groupe sham (n = 8) et groupe modèle. Les souris ont été mises à jeun 12 h avant l'opération puis anesthésiées avec 1 % de pentobarbital sodique (70 mg/kg) par injection intrapéritonéale. L'effet de l'anesthésie a été observé ; la respiration et les battements cardiaques des souris ont été notés. La tête et les membres des souris ont été fixés en position supine, et la peau abdominale a été préparée et désinfectée avec des boules de coton iodées. Les souris du groupe modèle ont été traitées par une incision longitudinale (1,0 cm) au segment moyen de la ligne médiane abdominale, la cavité abdominale a été ouverte, et le cæcum a été extrait en évitant de blesser les vaisseaux mésentériques. Il a été ligaturé avec un fil de soie 1-0 à 1/2 de l'extrémité du cæcum, et le cæcum a été ponctionné à la marge controlatérale du mésentère avec une aiguille de ponction n° 16. Une quantité appropriée de contenu intestinal a été extrudée, le cæcum a été remis en place, et l'incision a été suturée. Après ouverture de la cavité abdominale, les souris du groupe sham ont seulement eu le cæcum extrait, puis remis en place. Les souris ont reçu une injection sous-cutanée de 1 mL de solution de chlorure de sodium à 0,9 % post-opératoire, séparées en cages et nourries régulièrement.

Transfection in vivo

Avant le modèle, les souris ont été assignées en 7 groupes (n = 8) : groupe modèle, groupe miR-499-5p agomir, groupe contrôle négatif (CN) agomir, groupe petit ARN interférant (si)-Sox6, groupe si-CN, groupe miR-499-5p agomir + surexpression (oe)-Sox6 et groupe miR-499-5p agomir + oe-CN. Une heure avant le modèle, les souris ont été traitées selon le groupe. Les souris ont été anesthésiées avec 1 % de pentobarbital sodique par injection intrapéritonéale, puis fixées en position supine à 45°, et la langue déplacée de l'autre côté de la bouche pour assurer la perméabilité des voies respiratoires. La peau antérieure du cou a été désinfectée et incisée pour exposer la trachée. Le complexe de transfection (50 µL) a été aspiré par un microsampler (goutté selon le groupe, la même quantité de solution saline phosphate (PBS) a été gouttée dans le groupe modèle) et lentement goutté dans la trachée. Après la transfection, les souris ont été tournées verticalement et le complexe de transfection a été entièrement distribué dans les poumons. Pendant le processus de transfection, la respiration et les battements cardiaques des souris ont été observés. Si un arrêt respiratoire et cardiaque survenait, la transfection était arrêtée immédiatement, et les voies respiratoires étaient dégagées. La transfection était reprise lorsque la respiration et les battements cardiaques étaient stables. Le miR-499-5p agomir et son CN ainsi que les plasmides correspondants de Sox6 ont été achetés auprès de Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Après transfection, les souris ont été séparées en cages et nourries pendant 1 jour, puis euthanasiées. Les souris ont été anesthésiées avec 1 % de pentobarbital sodique par injection intrapéritonéale, fixées en position supine puis euthanasiées par section de l'aorte abdominale. La peau a été localement désinfectée, la cavité thoracique ouverte, la trachée et le bronchus principal droit ligaturés, le bronchus principal droit sectionné, et le poumon droit retiré. Le lobe inférieur droit a été placé dans du formol neutre à 10 % pour examen pathologique, le lobe moyen pesé rapidement pour calculer le poids humide (H) et cuit à 56 °C, et le poids sec (D) calculé après 72 h, ainsi le rapport P/H a été calculé. Le lobe supérieur droit a été stocké dans l'azote liquide pour détection d'ARNm et de protéines. Le poumon gauche a été lavé trois fois avec 0,4 mL de sérum physiologique, et environ 1 mL de liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) a été collecté, transféré dans un tube Eppendorf (EP) de 1,5 mL et mis sur glace. Le BALF a été centrifugé à 1500 tr/min pendant 5 min et transféré dans un nouveau tube EP, puis stocké à -80 °C pour la détection des facteurs inflammatoires.

En outre, les souris ont été divisées en 3 groupes (n = 10/groupe) : groupe sham, groupe modèle et groupe miR-499-5p agomir (50 µL de miR-499-5p agomir instillé dans la trachée 1 h avant la chirurgie). Le taux de survie a été surveillé toutes les 12 h, pendant 7 jours au total. Le statut de survie des souris dans les 7 jours a été observé, et la toxicité du miR-499-5p a été déterminée.

Coloration Hématoxyline-Éosine (H&E) et Score de lésion

Les tissus pulmonaires ont été préparés en coupes paraffine, colorés avec H&E et observés au microscope optique. La lésion pulmonaire a été notée (congestion alvéolaire, hémorragie, infiltration ou agrégation de neutrophiles dans la cavité alvéolaire ou la paroi vasculaire, épaississement de la paroi alvéolaire et/ou formation de membrane hyaline) par le système de notation pathologique pour lésion pulmonaire émis par la Société Thoracique Américaine. 0 point indiquait aucune lésion ou très légère ; 1 point indiquait lésions légères ; 2 points indiquaient lésions modérées ; 3 points indiquaient lésions sévères ; 4 points indiquaient lésions très sévères. Le score total des quatre items représentait le score total de lésion pulmonaire.

Coloration de Masson et Score

Les tissus pulmonaires ont été transformés en coupes paraffine (4 µm) et traités avec la coloration de Masson. Les fibres de collagène, le mucus et le cartilage étaient bleus, le cytoplasme, le muscle, la cellulose et la glie étaient rouges, et les noyaux cellulaires étaient bleu-noir. Dans le système de notation semi-quantitatif d'Ashcroft, 0 point indiquait poumon normal ; 1 point indiquait épaississement fibreux léger de la paroi alvéolaire ou bronchique ; 3 points indiquaient épaississement modéré de la paroi alvéolaire ou bronchiolaire sans dommage à la structure pulmonaire ; 5 points indiquaient fibrose s'aggravant accompagnée de dommage à la structure pulmonaire, formant des bandes ou masses fibreuses ; 7 points indiquaient dommage sévère de la structure pulmonaire et grandes zones de fibrose, formant des bandes ou amas fibreux ; 8 points indiquaient compactage fibreux de toutes les régions.

Coloration TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transerase-Mediated Deoxyuridine Triphosphate-Biotin Nick End-Labeling)

L'apoptose des tissus pulmonaires a été testée par kit TUNEL (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne) et observée au microscope optique. Les cellules apoptotiques étaient colorées en brun dans le noyau. L'indice d'apoptose indiquait le pourcentage de cellules positives TUNEL.

Immunohistochimie

Les coupes de tissus pulmonaires ont été déparaffinées au xylène, incubées avec 3 % de peroxyde d'hydrogène et bloquées avec du sérum de chèvre. Ensuite, Caspase-3 (ab13847, 1:500), Caspase-9 (ab32539, 1:250) et SOX6 (ab30455, 1:500, tous d'Abcam, MA, USA) ont été utilisés comme anticorps pour immunomarquer les coupes. Un microscope optique (Leica Microsystems, IL, USA) a été utilisé pour capturer les images qui ont ensuite été analysées avec le logiciel Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MA, USA).

RT-qPCR (Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction)

Le kit OMEGA (Solarbio science & technology Co., Ltd., Beijing, Chine) a été adopté pour l'extraction de l'ARN total dans les tissus pulmonaires et la détermination de la concentration d'ARN. L'ADN complémentaire (ADNc) a été composé par transcription inverse selon le kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Les amorces ont été conçues par Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), comme montré Tableau 1. La réaction PCR a été réalisée selon le kit FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche). L'expérience a été analysée quantitativement par la méthode 2⁻ΔΔCt. U6 était le contrôle de charge du miR-499-5p, et GAPDH le paramètre interne des autres gènes.

Analyse par Western Blot

La protéine totale a été collectée en utilisant un tampon de lyse radio-immunoprécipitation pour traiter les tissus pulmonaires. La concentration totale en protéines a été mesurée par la méthode de l'acide bicinchoninique. L'échantillon de protéine (30 µg) a été traité par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium à 10 %, transféré sur membrane de fluorure de polyvinylidène, bloqué avec 5 % de lait écrémé en poudre et réagi avec les anticorps primaires Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase-3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA), Caspase-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam), interleukine-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, USA), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) et GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA). Ensuite, la membrane a été incubée avec l'anticorps secondaire (1:2000) et révélée par chimiluminescence amplifiée.

Test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Les taux d'IL-1β, IL-6 et TNF-α dans le BALF ont été déterminés par kit ELISA (Boster, Hubei, Chine). La détermination colorimétrique a été réalisée à 450 nm.

Détection des indices de stress oxydatif

Les tissus pulmonaires dans l'azote liquide ont été pesés et dilués dans une certaine proportion de sérum physiologique à basse température, puis homogénéisés et centrifugés à 4 °C, 3000 tr/min pendant 20 min à basse température, et le surnageant a été prélevé pour détermination. L'activité de la myélopéroxydase (MPO) a été testée par kit de détection MPO (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine), et le malondialdéhyde (MDA), la superoxyde dismutase (SOD), la glutathion peroxydase (GSH-Px) et la catalase (CAT) ont été testés par kits fournis par JianCheng Bioengineering Institute.

Essai de gène rapporteur luciférase double

Sox6 pourrait être le gène cible du miR-499-5p prédit par un site web biologique (https://www.targetscan.org/vert_72/). Il y avait quatre sites de liaison entre miR-499-5p et la région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm Sox6. Les vecteurs pmiR-RB-REPORT-Sox6 type sauvage (WT) et pmiR-RB-REPORT-Sox6 type mutant (MUT) ont été construits par Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, Chine), et les plasmides rapporteurs luciférase correspondants ont été générés. Des cellules TC-1 (cellules épithéliales pulmonaires de souris, 1 × 10⁵ cellules/puits, Shanghai Yiyan biological technology Co., Ltd., Shanghai, Chine) ont été ensemencées dans une plaque à 24 puits, et transféctées avec miR-499-5p agomir ou agomir-CN, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT ou pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT via Lipofectamine2000. Le système d'essai de gène rapporteur luciférase double (Promega, WI, USA) a été appliqué pour mesurer l'activité luciférase.

Analyse statistique

Toutes les données ont été analysées par le logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Les données de mesure ont été exprimées par moyenne ± écart-type. Les comparaisons entre deux groupes ont été conduites par test t, les comparaisons entre groupes multiples évaluées par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA), et le test post-hoc de Tukey utilisé pour la comparaison par paires après analyse ANOVA. La courbe de survie a été faite par la méthode Kaplan-Meier. Une valeur P < 0,05 indiquait une différence statistiquement significative.

Résultats

Le rapport P/H et Sox6 sont augmentés tandis que miR-499-5p est diminué dans les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis

La toxicité du miR-499-5p a été testée sur les souris pour détecter le temps de survie des souris septiques. Les résultats ont montré (Figure 1a) que le taux de survie dans les 7 jours des souris du groupe sham était de 100 %, et celui des souris septiques était réduit. Le taux de survie des souris septiques après traitement par miR-499-5p était amélioré. Les résultats du rapport P/H des tissus pulmonaires ont démontré que (Figure 1b) : versus le groupe sham, le rapport P/H était élevé dans le groupe modèle (P < 0,05). En comparaison avec le groupe agomir CN et le groupe si-CN, le rapport P/H était réduit dans le groupe miR-499-5p agomir et le groupe si-Sox6 (tous deux P < 0,05). Le rapport P/H était marquantement accru dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 par rapport au groupe miR-499-5p agomir + oe-CN (P < 0,05).

L'expression de miR-499-5p et Sox6 a été détectée et nous avons trouvé que (Figure 1c-f) : en contraste avec le groupe sham, miR-499-5p diminuait et Sox6 augmentait dans le groupe modèle (tous deux P < 0,05). Par rapport au groupe agomir CN, miR-499-5p augmentait et Sox6 diminuait dans le groupe miR-499-5p agomir (tous deux P < 0,05). Versus le groupe si-CN, Sox6 diminuait dans le groupe si-Sox6 (P < 0,05). Par comparaison avec le groupe miR-499-5p agomir + oe-CN, Sox6 augmentait dramatiquement dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

La teneur en protéine de Sox6 dans les tissus pulmonaires de souris septiques a été déterminée par immunohistochimie (Figure 1g). Il a été observé que versus le groupe sham, l'expression protéique de Sox6 était augmentée dans le groupe modèle (P < 0,05) ; comparé aux groupes agomir CN et si-CN, une expression protéique de Sox6 plus faible était examinée dans les groupes miR-499-5p agomir et si-Sox6 (tous deux P < 0,05) ; relatif au groupe miR-499-5p agomir + oe-CN, l'expression protéique de Sox6 était augmentée dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

La restauration de miR-499-5p ou l'appauvrissement de Sox6 atténue la pathologie des tissus pulmonaires, réduit le score de lésion pulmonaire, les fibres de collagène et le degré de fibrose pulmonaire chez les souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis

Les résultats de coloration HE ont présenté que (Figure 2a) : dans le groupe sham, la structure du tissu pulmonaire était intacte, le septum alvéolaire était essentiellement manifesté sans œdème ni inflammation, et la cavité alvéolaire était claire. Dans les groupes modèle, agomir CN, si-CN et miR-499-5p agomir + oe-Sox6, on pouvait voir exsudation, œdème et hémorragie dans la plupart des cavités alvéolaires des tissus pulmonaires, et une infiltration massive de cellules inflammatoires montrait dans l'interstitiel pulmonaire. Dans les groupes miR-499-5p agomir, si-Sox6 et miR-499-5p agomir + oe-CN, la lésion des tissus pulmonaires était réduite versus le groupe modèle.

Les résultats de score de lésion tissulaire murine et de score semi-quantitatif d'Ashcroft ont montré que (Figure 2b,d) : par rapport au groupe sham, le score de lésion pulmonaire et le degré de fibrose pulmonaire étaient évidemment augmentés dans le groupe modèle (P < 0,05). Versus les groupes agomir CN et si-CN, le score de lésion pulmonaire et le degré de fibrose pulmonaire étaient réduits dans les groupes miR-499-5p agomir et si-Sox6 (tous deux P < 0,05). En contraste avec le groupe miR-499-5p agomir + oe-CN, le score de lésion pulmonaire et le degré de fibrose pulmonaire étaient marquantement élevés dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

Les résultats de coloration de Masson ont révélé que (Figure 2c) : dans le groupe sham, les tissus pulmonaires de souris contenaient une petite quantité de fibres de collagène bleues. Dans les groupes modèle, agomir CN, si-CN et miR-499-5p agomir + oe-Sox6, les fibres de collagène étaient augmentées. Dans les groupes miR-499-5p agomir, si-Sox6 et miR-499-5p agomir + oe-CN, les fibres de collagène étaient diminuées versus le groupe modèle.

La restauration de miR-499-5p ou l'appauvrissement de Sox6 réduit les cellules positives TUNEL, l'expression protéique de Caspase-3 et Caspase-9 dans les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis

Les résultats de Western blot, coloration TUNEL et immunohistochimie ont indiqué que (Figure 3a-f) : noyau normal bleu et noyau apoptotique brun dans différentes nuances. Versus le groupe sham, les cellules positives TUNEL, l'expression protéique de Caspase-3 et Caspase-9 étaient augmentées dans le groupe modèle (tous P < 0,05). Versus les groupes agomir CN et si-CN, les cellules positives TUNEL, l'expression protéique de Caspase-3 et Caspase-9 étaient réduites dans les groupes miR-499-5p agomir et si-Sox6 (tous P < 0,05). Versus le groupe miR-499-5p agomir + oe-CN, les cellules positives TUNEL, l'expression protéique de Caspase-3 et Caspase-9 étaient accrues dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (tous P < 0,05).

La restauration de miR-499-5p ou l'appauvrissement de Sox6 diminue les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 dans le BALF et les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis

Il a été affiché par les résultats d'ELISA et Western blot que (Figure 4a-g) : les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 étaient augmentées dans le groupe modèle par rapport au groupe sham (tous P < 0,05). Versus les groupes agomir CN et si-CN, les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 étaient diminuées dans les groupes miR-499-5p agomir et si-Sox6 (tous P < 0,05). Versus le groupe miR-499-5p agomir + oe-CN, les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 étaient augmentées dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (tous P < 0,05).

La restauration de miR-499-5p ou l'appauvrissement de Sox6 augmente les activités de SOD, CAT et GSH-Px ainsi que réduit les teneurs en MDA et MPO dans les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis

Les résultats de détection des indices de stress oxydatif ont présenté que (Figure 5a-e) : versus le groupe sham, les activités de SOD, CAT et GSH-Px étaient altérées tandis que les teneurs en MDA et MPO augmentaient dans le groupe modèle (tous P < 0,05). Versus les groupes agomir CN et si-CN, les activités de SOD, CAT et GSH-Px étaient augmentées tandis que les teneurs en MDA et MPO réduites dans les groupes miR-499-5p agomir et si-Sox6 (tous P < 0,05). Versus le groupe miR-499-5p agomir + oe-CN, les activités de SOD, CAT et GSH-Px étaient supprimées tandis que les teneurs en MDA et MPO augmentées dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (tous P < 0,05).

miR-499-5p cible directement Sox6

Nous avons prédit via le site web bioinformatique TargetScan qu'il y avait des sites de liaison ciblés entre miR-499-5p et SOX4/6. En utilisant RT-qPCR, il a été trouvé que comparé au groupe sham, l'expression de SOX2/4/6 augmentait dans le groupe modèle, et l'expression de SOX6 augmentait le plus (tous P < 0,05) ; versus le groupe agomir CN, le groupe miR-499-5p agomir ne montrait pas de changement dans l'expression de SOX2 tandis qu'une réduction de SOX4 était montrée, surtout SOX6 diminuée (Fichier additionnel 1 : Figure S1a, b). Par conséquent, nous avons finalement sélectionné SOX6 comme gène cible de miR-499-5p. Le site web de prédiction biologique (https://www.targetscan.org/vert_72/) a révélé que miR-499-5p pouvait cibler Sox6 (Figure 6a). L'essai de gène rapporteur luciférase double a démontré que (Figure 6b) versus le groupe contrôle, l'activité luciférase était évidemment détruite après co-transfection du vecteur pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT et miR-499-5p agomir dans les cellules TC-1 (P < 0,05), tandis que l'activité luciférase ne montrait pas de différence distincte après co-transfection de miR-499-5p agomir avec pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT ou agomir-CN co-transfecté avec pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT (P > 0,05), suggérant que miR-499-5p pouvait se lier directement à la 3'UTR WT de Sox6, et inhiber l'activité luciférase.

Discussion

La sepsis est une cause critique de choc et de syndrome de dysfonctionnement multiviscéral, parmi lesquels la LPA est la complication organique la plus fréquente et significative. La LPA induite par sepsis apparaît non seulement la plus tôt, avec l'incidence la plus élevée, mais progresse aussi rapidement, le taux de mortalité est élevé, et il n'y a pas de thérapie efficace actuellement. Une étude précédente a affirmé que la régulation positive du miR-218 atténuait la sécrétion de facteurs inflammatoires et prévenait la lésion pulmonaire induite par sepsis. Aussi, la promotion des niveaux de miR-146a pourrait réduire l'inflammation dans la LPA et la restauration de miR-125b améliore la survie des souris avec LPA et supprime l'inflammation. Bien que des études aient mis en évidence le rôle des miARN dans la lésion pulmonaire, le mécanisme détaillé du miR-499-5p dans la lésion pulmonaire induite par sepsis a été peu étudié, ainsi nous nous sommes concentrés sur miR-499-5p pour découvrir son potentiel thérapeutique dans la LPA induite par sepsis. Aussi, une étude a fourni une preuve que l'augmentation de Sox6 était impliquée dans l'apoptose cardiaque induite par sepsis. Des efforts doivent être faits pour comprendre profondément la lésion pulmonaire induite par sepsis. Nous visons à discuter l'effet protecteur du miR-499-5p ciblant Sox6 sur la lésion pulmonaire induite par sepsis chez la souris.

Le rapport P/H des tissus pulmonaires a été calculé dans notre étude, et l'expression de Sox6 et miR-499-5p dans les tissus pulmonaires de souris a été évaluée. Les résultats ont montré que le rapport P/H et Sox6 étaient augmentés tandis que miR-499-5p était diminué dans les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis. Une étude récente a proposé que l'expression de miR-499-5p chez les patients avec sepsis légère, sepsis sévère et choc septique était dramatiquement diminuée par rapport aux témoins normaux. Une autre étude a présenté que l'expression de miR-499-5p était marquantement déclinée dans les tissus de cancer pulmonaire non à petites cellules (CPNPC) et liée à de mauvais résultats cliniques. Il est rapporté que l'expression de Sox6 était élevée dans les tissus de cancer pulmonaire comparée aux tissus normaux. De même, une étude précédente a révélé que l'expression de Sox6 était remarquablement élevée dans les tissus rénaux de souris avec néphropathie diabétique. Notre étude a aussi présenté que miR-499-5p ciblait directement Sox6. Une découverte importante était que Sox6 est un gène cible de miR-499. Une autre étude a fourni des données que Sox6 était un gène cible de miR-499-5p, et la restauration de miR-499-5p supprimait l'expression de Sox6. Cependant, la relation de ciblage de miR-499-5p et Sox6 dans les tissus pulmonaires de souris septiques n'avait pas encore été découverte.

En outre, il a été révélé que la restauration de miR-499-5p ou l'appauvrissement de Sox6 atténuait la pathologie des tissus pulmonaires, réduisait le score de lésion pulmonaire, les fibres de collagène et le degré de fibrose pulmonaire, et réduisait les cellules positives TUNEL, l'expression protéique de Caspase-3 et Caspase-9 dans les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis. Il a été précédemment suggéré que la régulation positive de miR-499-5p supprimait la prolifération cellulaire et promouvait l'apoptose in vivo et in vitro du CPNPC. Une autre étude a vérifié que la restauration de miR-499-5p et l'appauvrissement de Sox6 atténuaient l'apoptose cellulaire induite par hypoxie/réoxygénation et réduisaient l'expression de Caspase-3. Il a été présenté que la régulation négative de Sox6 atténue la lésion pathologique et réprime l'apoptose neuronale dans les tissus hippocampaux de la maladie d'Alzheimer. De plus, une étude a révélé que l'appauvrissement de Sox6 inhibait l'apoptose cellulaire induite par glucose élevé et la fibrose interstitielle rénale dans les cellules mésangiales rénales de souris. Une autre étude a démontré que la faible expression de Sox6 déclinait l'activité de Caspase-3 et le pourcentage de cellules apoptotiques dans les cellules P19CL6 de souris. En plus, nous avons vérifié que la restauration de miR-499-5p ou l'appauvrissement de Sox6 déclinait les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 dans le BALF et les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis. Xia et al. ont illuminé que les niveaux de TNF-α et IL-6 étaient dramatiquement élevés chez les souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis. Une étude a démontré que la faible expression de Sox6 déclinait la réaction inflammatoire dans les tissus hippocampaux de la maladie d'Alzheimer. Un autre résultat de cette étude impliquait que la restauration de miR-499-5p ou l'appauvrissement de Sox6 augmentait les activités de SOD, CAT et GSH-Px ainsi que réduisait les teneurs en MDA et MPO dans les tissus pulmonaires de souris avec lésion pulmonaire induite par sepsis. Il a été présenté que la LPA induite par CLP était caractérisée par l'inflammation en morphologie, le rapport P/H accru, la concentration protéique élevée dans le BALF, le niveau plus élevé de MPO et MDA ainsi que le niveau plus bas de SOD, GSH-Px et CAT dans les poumons après CLP. Il a été suggéré que l'activité de SOD et CAT étaient diminuées dans la LPA induite par sepsis chez les souris. De plus, une étude a rapporté que le miR-499-5p surexprimé et le Sox6 sous-exprimé diminuaient le niveau de MDA.

Conclusion

En conclusion, nous avons trouvé qu'une forte expression de miR-499-5p peut atténuer l'apoptose des cellules des tissus pulmonaires et inhiber l'inflammation de la lésion pulmonaire induite par sepsis chez la souris via l'appauvrissement de Sox6, ce qui peut avoir d'importantes implications thérapeutiques dans le traitement de la lésion pulmonaire induite par sepsis. Néanmoins, des recherches cliniques sont nécessaires pour détecter l'efficacité pour le traitement de la lésion pulmonaire induite par sepsis.