Nanoscopes AGuIX marqués au ⁶⁴Cu : radiothérapie guidée par TEP et radiosensibilisation chez la souris porteuse de tumeur HepG2

Résumé

La radiothérapie du cancer du foie est limitée par la faible tolérance du foie aux rayonnements ionisants, rendant les radiosensibilisateurs essentiels pour réduire les doses requises. Les nanoparticules AGuIX — porteurs ultra-petits à base de gadolinium — sont particulièrement adaptées pour délivrer des radioisotopes ou fluorophores pour l'imagerie SPECT, TEP, fluorescence et multimodale, tandis que leur numéro atomique élevé confère également des propriétés radiosensibilisantes tumorales. Comprendre leur biodistribution et pharmacocinétique est donc crucial pour quantifier la rétention tumorale pendant la radiothérapie. Dans cette étude, nous avons efficacement marqué les AGuIX avec du ⁶⁴Cu via son chélateur DOTA intrinsèque. Les données de biodistribution ont révélé une accumulation prononcée de ⁶⁴Cu-AGuIX dans les xénogreffes HepG2 chez les souris nues, indiquant sa promesse comme sonde théranostique pour la radiothérapie guidée par l'imagerie dans le carcinome hépatocellulaire (CHC). La microscopie électronique à transmission a confirmé l'absorption des nanoparticules dans les cellules HepG2. Les expériences de radiations ont montré une réduction significative de l'absorption de ¹⁸F-FDG dans les tumeurs irradiées 1 h après l'injection d'AGuIX, fournissant la preuve de concept que les AGuIX fonctionnent comme un radiosensibilisateur visible en TEP pour la radiothérapie du cancer du foie.

Contexte

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) se classe parmi les malignités les plus communes au monde, avec 782 500 nouveaux cas et 745 500 décès rapportés en 2012, dont 70-90 % étaient des CHC. La plupart des patients se présentent à un stade avancé, limitant les options curatives à 20-25 % des cas. Par conséquent, la radiothérapie est devenue un élément clé de la prise en charge multidisciplinaire du CHC. Cependant, le tissu hépatique normal limite l'escalade de dose, car la maladie hépatique induite par les radiations (MHIR) pose un risque sévère. Les radiosensibilisateurs qui s'accumulent préférentiellement dans le tissu tumoral peuvent augmenter la destruction des cellules tumorales à des doses plus faibles, atténuant ainsi la toxicité des tissus normaux.

AGuIX, une nanoparticule novatrice à base de gadolinium (~5 nm de diamètre) décrite pour la première fois en 2013, est rapidement éliminée par voie rénale et peut être fonctionnalisée avec des marqueurs radioactifs ou fluorescents pour l'imagerie SPECT, TEP, IRM ou fluorescence. La haute teneur en gadolinium dote les AGuIX de capacités de radiosensibilisation tumorale, démontrées in vitro sur diverses lignées cellulaires avec des ratios d'amélioration de la radiosensibilisation (RAR) allant de 1,1 à 2,5. Comme les AGuIX montrent un faible fond hépatique mais une forte absorption tumorale — grâce à l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR) — ils sont un candidat attractif pour la radiosensibilisation du CHC.

Malgré des travaux précliniques étendus sur les AGuIX pour la radiothérapie guidée par IRM, leur pharmacocinétique reste incomplètement caractérisée. Des données précises de biodistribution sont essentielles pour optimiser les schémas de dosage et prédire les fenêtres thérapeutiques. L'émetteur de positons ⁶⁴Cu (T₁/₂ = 12,4 h) offre la flexibilité temporelle pour imager à la fois les agents à élimination rapide et lente. Ici, nous rapportons la première biodistribution in vivo et imagerie TEP de ⁶⁴Cu-AGuIX marqué chez des souris nues porteuses de tumeurs HepG2, et nous évaluons son effet radiosensibilisant en utilisant la TEP/TDM ¹⁸F-FDG.

Méthodes

Informations Générales

Les nanoparticules AGuIX (sub-5 nm, déshydratées, sphériques) provenaient de Nano-H (Lyon, France) et étaient réhydratées dans de l'eau traitée DEPC stérile. Les cellules de CHC humain HepG2 (ATCC) étaient cultivées en MEM supplémenté avec 10 % FCS. L'isotope ⁶⁴Cu était obtenu de l'Université du Wisconsin. Des souris mâles BALB/c athymiques nues (6 semaines, 16-18 g) étaient utilisées, avec tous les protocoles approuvés par le Comité Institutionnel de Soins et d'Utilisation des Animaux de l'Université de Virginie.

Microscopie Électronique à Transmission (MET)

Les AGuIX (0,5 mM) étaient incubés avec des cellules HepG2 pendant 1 h, suivis d'un lavage avec du PBS 0,1 M et d'une centrifugation. Les culots cellulaires étaient fixés dans 4 % formaldéhyde et 1 % glutaraldéhyde pour l'imagerie MET.

Radiomarquage au ⁶⁴Cu

Les AGuIX (10 µmol) étaient mélangés avec 100 µl d'acétate d'ammonium 0,5 M (pH 5,5) et incubés pendant 5 min. 1-3 mCi de ⁶⁴CuCl₂ (0,1 N HCl) étaient ajoutés, et le mélange était chauffé à 37 °C pendant 1 h. Le produit était purifié par filtration Amicon 3 kDa. La pureté radiopharmaceutique était confirmée par CCM (acide citrique 20 mM) et dépassait constamment 98 %. L'activité spécifique variait de 3-10 MBq µmol⁻¹, avec des rendements finaux de 50-100 MBq par synthèse.

Modèles Tumoraux

Des cellules HepG2 (5 × 10⁶) étaient resuspendues dans 0,1 ml HBSS et injectées sous-cutanéement dans le flanc droit de chaque souris nue. Les tumeurs devenaient palpables après ~2 semaines.

Biodistribution du ⁶⁴Cu-AGuIX

Dix souris (5 mâles, 4 femelles) ont reçu des injections intrapéritonéales de ~0,9 MBq ⁶⁴Cu-AGuIX (0,2 ml). À 9, 21 et 40 h post-injection, les souris étaient euthanasiées, et les organes (cœur, muscle, poumon, rein, rate, foie, tumeur) étaient prélevés, pesés, et comptés dans un compteur γ. Les données étaient exprimées en % dose injectée par gramme (% DI/g).

Imagerie Micro-TEP

Chaque souris porteuse de tumeur a reçu 22,2 MBq ⁶⁴Cu-AGuIX intrapéritonéalement. Les acquisitions TEP étaient effectuées à 9 h et 21 h sous anesthésie à l'isoflurane, utilisant un système SuperArgus (Sedecal, Espagne).

Irradiation et TEP/TDM ¹⁸F-FDG

Douze souris étaient divisées en trois groupes (n = 4). L'imagerie TEP de référence était réalisée 30 min après injection en veine caudale de 16,4 ± 4,7 MBq ¹⁸F-FDG. Les groupes recevaient soit du sérum physiologique, 1 mg, ou 10 mg d'AGuIX intrapéritonéalement 1 h avant l'irradiation. L'irradiation était délivrée à 250 kV, 8 mA, filtre Al 2 mm (1,2 Gy min⁻¹) pour un total de 6 Gy ; le protocole était répété le lendemain. 24 h après la seconde dose, un second scanner TEP ¹⁸F-FDG (11,1 ± 1,0 MBq) était réalisé. Les valeurs d'absorption standardisées (SUV_max) étaient mesurées dans les tumeurs et normalisées au SUV_moyen du foie pour obtenir les rapports T/L.

Analyse Statistique

Toutes les expériences étaient effectuées en triplicat. Les données sont présentées comme moyenne ± EE. La significativité était évaluée par tests t bilatéraux non appariés ou ANOVA à un facteur (p < 0,05 considéré significatif).

Résultats et Discussion

Alors que l'IRM avec rehaussement de contraste peut détecter les AGuIX, la TEP offre une sensibilité et une précision quantitative supérieures, permettant la détection de concentrations nanomolaires en dessous du seuil de l'IRM. Ici, nous démontrons que les ⁶⁴Cu-AGuIX marqués fournissent une délimitation tumorale claire et une rétention prolongée dans les xénogreffes HepG2, soutenant leur utilisation pour la radiothérapie guidée par TEP.

Étude MET

L'incubation de cellules HepG2 avec 0,5 mM AGuIX pendant 1 h a entraîné une absorption cytoplasmique, visualisée à ×6 500 et ×52 000 grossissements (Figure 1). Les nanoparticules ont maintenu une morphologie bien dispersée, indiquant une stabilité et une compatibilité cellulaires.

Localisation des AGuIX dans les cellules HepG2. a. Images MET (× 6500) montrant l'absorption. b. Vue agrandie (× 52000) montrant la distribution cytoplasmique.

Radiomarquage

La chélation en une étape du ⁶⁴Cu aux AGuIX via le DOTA intégré a atteint >98 % de rendement radiopharmaceutique. L'activité spécifique résultante était de 3-10 MBq µmol⁻¹, avec une activité du produit final de 50-100 MBq par synthèse.

Études de Biodistribution

Après injection intrapéritonéale, les ⁶⁴Cu-AGuIX ont présenté une absorption tumorale robuste (7,82 ± 1,50, 8,43 ± 6,23, 6,84 ± 1,40 % DI/g à 9, 21 et 40 h, respectivement). Les organes non-cibles ont retenu <1 % DI/g, confirmant une élimination rapide. L'absorption rénale était notablement plus faible (~5 % DI/g) que rapportée pour l'administration intraveineuse, probablement due à l'absorption péritonéale continue. Ces données soutiennent l'utilisation de ⁶⁴Cu-AGuIX comme outil quantitatif pour guider le dosage du radiosensibilisateur.

Biodistribution du ⁶⁴Cu-AGuIX chez des souris porteuses de tumeur (% DI/g à 9, 21 et 40 h). Moyenne ± ET, n = 3.

Imagerie Micro-TEP

Un signal tumoral clair était observé à 9 h, avec un contraste encore plus élevé à 21 h alors que l'activité de fond déclinait (Figure 3). Les données corroborent les résultats de biodistribution et démontrent la faisabilité pratique de la planification de traitement guidée par TEP.

Images micro-TEP de souris porteuses de tumeur. Panneau supérieur (vue coronale) et panneau inférieur (vue transversale) à 9 h et 21 h post-injection. Tumeur indiquée par flèche rouge.

Évaluation par TEP/TDM ¹⁸F-FDG des Xénogreffes Irradiées

Toutes les souris irradiées ont affiché une absorption tumorale de ¹⁸F-FDG réduite. Les rapports SUV_max (B/A) étaient 1,03 ± 0,03 (sérum physiologique), 1,04 ± 0,04 (1 mg AGuIX), et 1,24 ± 0,02 (10 mg AGuIX). Le groupe 10 mg a montré une augmentation statistiquement significative du rapport d'absorption tumeur-foie comparé aux groupes 1 mg et sérum physiologique (p < 0,001), confirmant une radiosensibilisation dose-dépendante. Aucune différence n'était observée entre 1 mg AGuIX et sérum physiologique, indiquant que des doses plus élevées sont requises pour un bénéfice clinique.

Images TEP ¹⁸F-FDG pré- et post-irradiation pour sérum physiologique (gauche), 1 mg AGuIX (milieu), et 10 mg AGuIX (droite). Images partagent des échelles de couleurs identiques.

Analyse quantitative : T/L (B) – tumeur/foie SUV_moyen avant irradiation ; T/L (A) – après irradiation ; T/L (B/A) – rapport des deux. Groupes 1 mg et 10 mg AGuIX montrés.

Bien que l'absorption rénale des AGuIX radiomarqués puisse être élevée après injection intraveineuse, l'administration intrapéritonéale atténue cette exposition, résultant en une rétention tumorale soutenue avec une exposition rénale minimale. De futures études de dosimétrie clarifieront la tolérance radiologique organe-spécifique et soutiendront la translation clinique.

Conclusions

Nous avons radiomarqué avec succès les AGuIX au ⁶⁴Cu, atteignant >98 % de pureté et une absorption tumorale substantielle persistant >40 h dans les xénogreffes HepG2. L'imagerie TEP démontre une délimitation tumorale claire et fournit une lecture quantitative pour la planification du traitement. Les études de radiosensibilisation utilisant la TEP ¹⁸F-FDG confirment qu'une dose intrapéritonéale de 10 mg d'AGuIX améliore l'effet thérapeutique de 6 Gy de radiothérapie dans les modèles de CHC. Ces résultats valident les AGuIX comme sonde nanothéranostique à double fonction pour la radiothérapie guidée par l'imagerie et soulignent la nécessité d'une dosimétrie complète avant l'application clinique.