Nouveau double mitochondrial et récepteur CD44 ciblant des nanoparticules pour une libération déclenchée par des stimuli redox

Contexte

Ces dernières années, afin de parvenir à un traitement efficace du cancer, de nombreux systèmes d'administration de médicaments [1] ont été étudiés pour préparer des supports de médicaments polymères macromoléculaires multifonctionnels avec des modifications structurelles qui pourraient présenter de nombreux avantages tels que l'amélioration de la biodisponibilité des médicaments en réduisant leur taux de dégradation. , améliorant l'absorption cellulaire, permettant le ciblage et le contrôle de la libération du médicament et réduisant les effets secondaires [2, 3].

La curcumine (Cur), un composé diphénolique, a été isolée à partir d'un Curcuma longa de la médecine traditionnelle chinoise. . Par rapport aux médicaments antitumoraux généraux, Cur a eu de larges effets antitumoraux sur de nombreuses tumeurs telles que le cancer de la prostate, du sein et du côlon, et cette cytotoxicité relativement plus faible [4]. Mais sa solubilité inadéquate, son instabilité et sa faible biodisponibilité limitent considérablement son application clinique [5, 6]. Afin d'améliorer la solubilité et la biodisponibilité des médicaments hydrophobes, de nombreux nanomatériaux bien conçus ont été fabriqués par incorporation de médicaments hydrophobes et d'acide hyaluronique oligomère (oHA) [7]. Nous avons conçu une sorte de conjugués polymère-médicament amphipathiques en tant que nanosupport en chargeant de la curcumine dans des micelles polymères par auto-assemblage, qui présentaient une bonne stabilité et pouvaient prolonger la demi-vie du médicament dans la circulation sanguine. Les micelles avec une petite taille de particule peuvent s'accumuler passivement dans une tumeur solide grâce à l'effet EPR de l'angiogenèse tumorale de manière efficace pour obtenir un meilleur effet de traitement [8, 9].

L'oHA, une petite molécule dérivée de la dégradation de l'HA, possède des propriétés uniques, telles qu'une bonne hydrophilie, une bonne biocompatibilité, une stabilité dans le plasma et un ciblage vers le récepteur CD44 à la surface de la cellule [7, 10, 11], tandis que les récepteurs CD44 sont surexprimés dans les cellules cancéreuses du poumon et les cellules cancéreuses du sein, par rapport à une expression plus faible dans les cellules normales [12]. Les cellules tumorales ont les signaux cellulaires uniques, y compris le glutathion (GSH, 2-10 mM), un pH bas et certaines enzymes, contrairement aux cellules humaines normales [13,14,15,16,17,18,19,20 ], tandis que les liaisons disulfure ont une sensibilité réduite et pourraient se fracturer sous l'action du GSH réduit dans le cytoplasme [21, 22].

Les mitochondries sont les organites vitaux pour la survie des cellules et jouent un rôle important dans la production d'énergie et les voies apoptotiques [23,24,25,26,27]. Par conséquent, les mitochondries ont longtemps été considérées comme les cibles subcellulaires appliquées pour le traitement du cancer dans les rapports précédents [28]. En raison du potentiel membranaire plus élevé des mitochondries parmi les organites cellulaires, la triphénylphosphine, le triphénylméthylphosphonium et d'autres types de cations lipophiles peuvent être facilement enrichis dans les mitochondries grâce à leur barrière hydrophile bicouche lipidique [29, 30].

Dans ce travail, afin d'améliorer la solubilité de Cur et d'améliorer la spécificité aux cellules cancéreuses, des conjugués polymère-médicament, composés d'oHA, de TPP, de liaisons disulfure et de Cur, ont été conçus et synthétisés, qui ciblaient spécifiquement le récepteur CD44 et les mitochondries. . En outre, il avait une sensibilité de réduction et peut être utilisé comme marqueur de fluorescence. Ce nouveau nanosupport multifonctionnel a été nommé d'après le bromure de (5-carboxypentyl)triphénylphosphonium, l'acide hyaluronique oligomère, la liaison disulfure et la curcumine (TPP-oHA-S-S-Cur). Cur a été chargé dans des micelles TPP-oHA-S-S-Cur via un auto-assemblage dans l'eau [1, 31]. Les micelles polymères TPP-oHA-S-S-Cur encapsulées Cur (ci-après appelées micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur) pourraient améliorer l'efficacité thérapeutique et la charge médicamenteuse de la curcumine, ainsi que réduire les effets secondaires. Après avoir ciblé les tissus tumoraux, les micelles Cur/TPP-oHA-SS-Cur ont pénétré dans les cellules par endocytose médiée par CD44, puis les mitochondries ont été ciblées et les liaisons disulfure se sont rompues en réponse à un taux élevé de GSH (2-10 mM) conduisant à la libération rapide du médicament (Fig. 1). Ici, nous pouvons proposer une hypothèse selon laquelle ces nouvelles nanoparticules multifonctionnelles sensibles au redox et à double ciblage des récepteurs mitochondriaux et CD44 seront une nouvelle plate-forme pour le système d'administration de médicaments ciblant les tumeurs. Après la préparation des micelles, des investigations préliminaires sur les caractéristiques des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur ont été menées dans cette étude.

Illustration schématique de nanoparticules sensibles au redox à double ciblage mitochondrial et des récepteurs CD44

Méthodes

Matériaux

Curcumine (Cur, Shanghai Zhanyun Chemical Co. Ltd); acide hyaluronique oligomère (oHA, Mn =10 kDa, Shandong Freda Biological Engineering Co. Ltd.); L'acide 3,3'-dithiodipropionique a été fourni par Adamas Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Chine). (5-carboxypentyl)triphénylphosphoniumbromure (TPP), tétrahydrofurane anhydre (THF), diméthylsulfoxyde (DMSO), triéthylamine (TEA), chlorhydrate de carbodiimide carbonisé de 1-éthyl-(3-deux méthylaminopropyle) (EDC) et 4-diméthylaminopyridine (DMAP) ont été obtenus auprès d'Aladdin Chemistry Co. Ltd. Tous les autres réactifs étaient de qualité analytique et fournis par Sinopharm Group Chemical Reagent Corp.

Synthèse et caractérisation de TPP-oHA-S-S-Cur

Les nanoporteurs multifonctionnels ont été synthétisés en trois étapes, comme le montre la figure 2.

Voie synthétique de TPP-oHA, S-S-Cur et TPP-oHA-S-S-Cur

Étape 1

Le TPP a été combiné avec l'oHA via une liaison ester en utilisant une méthode précédemment rapportée [32]. Tout d'abord, le TPP, l'EDC et le DMAP ont été dissous dans du DMSO pour réagir pendant 1 h à 60 °C. Ensuite, oHA a été dissous dans DMSO:H₂ O (v /v = 1 :1) et y a ajouté la réaction ci-dessus pendant 8 h à température ambiante. Le mélange réactionnel a été dialysé avec un sac de dialyse (MWCO 2000 Da) dans de l'eau désionisée pendant 48 h pour éliminer les impuretés et lyophilisé pour obtenir des polymères TPP-oHA.

Étape 2

En bref, de l'acide 3,3'-dithiodipropionique a été dissous dans du THF et activé par du chlorure d'oxalyle. Ensuite, le mélange a été mis à réagir avec Cur catalysé par TEA. Le produit obtenu a été isolé par chromatographie sur colonne de gel de silice pour obtenir le produit pur S-S-Cur.

Étape 3

Le S-S-Cur, l'EDC et le DMAP ont été dissous dans du DMSO et activés à 60 °C pendant 2 h, puis du TPP-oHA a été ajouté dans la solution ci-dessus et mis à réagir pendant 24 h à température ambiante. Le mélange a été dialysé dans de l'eau distillée avec un tube de dialyse (MWCO 2000 Da) pendant 48 h, suivi d'une lyophilisation pour obtenir le produit final TPP-oHA-S-S-Cur.

Les structures de TPP-oHA, S-S-Cur et TPP-oHA-S-S-Cur ont été confirmées avec ¹ HNMR (Advance Bruker 400M ; Switzerland Bruker Company, Madison, WI, États-Unis) utilisant du DMSO-d₆ deutéré , CD₃ Cl et DMSO-D₆ :D₂ O (DMSO-d₆ :D₂ O = 1:1, v /v ) comme solvant, respectivement.

Préparation et caractérisation des micelles

Les micelles TPP-oHA-S-S-Cur et oHA-Cur ont toutes deux été préparées par des méthodes de dialyse [33]. Tout d'abord, le TPP-oHA-S-S-Cur (10 mg) et la curcumine (1,5 mg) ont été dissous dans du formamide (6 mL). Ensuite, le mélange a été dialysé dans de l'eau déminéralisée avec un sac de dialyse (MWCO 2000 Da) à l'obscurité pendant 24 h pour éliminer les solvants organiques. Après cela, la solution dialysée a été centrifugée à 2500 tr/min pendant 10 min pour éliminer le Cur non chargé. Enfin, la suspension micellaire a été filtrée sur membranes filtrantes seringues de 0,45 µm. Les micelles oHA-Cur fonctionnelles uniques ont été obtenues par la même méthode.

La taille des particules, le potentiel zêta et l'indice de polydispersité (P.I.) des micelles chargées en Cur ont été observés par Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.). La morphologie des micelles chargées en Cur a été contrôlée par microscope électronique à transmission (MET, H-600; Hitachi, Tokyo, Japon). La stabilité des micelles chargées en Cur a été réalisée dans du PBS contenant 20% de FBS par le Delsa Nano C.

L'efficacité de piégeage (EE) et la charge médicamenteuse (DL) ont été mesurées par la méthode de filtration sur membrane. Après filtration sur membrane de 0,45 µm, la solution obtenue a été mesurée par chromatographie liquide haute performance (HPLC, Agilent Technologies) à 425 nm pour obtenir EE et DL. Les équations pour calculer EE et DL des micelles étaient les suivantes :

Libération de médicament in vitro en présence de GSH

La réactivité redox du GSH intracellulaire des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur a été évaluée en utilisant la méthode de dialyse. Quatre millilitres de suspensions de micelles Cur/TPP-oHA-SS-Cur (50 μg de curcumine/mL) ont été placés dans un sac de dialyse (MWCO 7000 Da) et dialysés contre 45 mL de PBS (pH 7,4, contenant 45 % de sérum bovin fœtal et 0,5 % de Tween 80) avec différents niveaux de GSH (0, 10, 2 et 10 mM). Les échantillons dans des tubes à centrifuger ont été conservés à 37 °C dans un incubateur à agitateur (BS-2F, Changzhou, Chine) à 100 rpm. À des intervalles de temps prédéfinis (0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 et 120 h), 2 mL de milieu de libération ont été prélevés dans les tubes à centrifuger et remplis d'un volume égal de les milieux frais correspondants et les concentrations de Cur ont été analysés par HPLC. Chaque expérience a été réalisée en triple.

Culture cellulaire

Des cellules de carcinome du sein humain MDA-MB-231 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Hyclone) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS). Les récepteurs CD44 étaient fortement exprimés dans les cellules MDA-MB-231, donc les lignées cellulaires MDA-MB-231 ont été sélectionnées et cultivées dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂ ambiance complétée.

Dosages de cytotoxicité in vitro

Le test de cytotoxicité in vitro du TPP-oHA-S-S-Cur a été évalué par la méthode MTT [32]. Des cellules MDA-MB-231 (récepteur CD44 hautement exprimé) ont été cultivées à une densité de 1 × 10 ⁴ cellules/puits dans des plaques à 96 puits. Cent microlitres de micelles Cur, Cur/oHA-Cur et Cur/TPP-oHA-SS-Cur libres comprenant différentes concentrations de Cur (0,5, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 μg/mL) ont été ajoutés à différents puits, tandis que du PBS comme contrôle a été ajouté. Après avoir été incubés pendant 24 h, 100 μL de solution de MTT (5 mg/mL) ont été ajoutés à chaque puits, puis incubés pendant 4 h. Ensuite, le MTT a été remplacé par 100 μL de DMSO et les a placés dans un incubateur à agitateur pour dissoudre le cristal de formazan. Après incubation pendant 20 min, l'absorbance a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) à 570 nm.

Captation cellulaire in vitro et localisation mitochondriale

Des analyses qualitatives de l'absorption cellulaire des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur et des micelles Cur/oHA-Cur ont été observées en utilisant la microscopie à fluorescence (Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokyo, Japon). Les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits à une densité de 5000 cellules par puits et incubées avec du DMEM (1 mL) contenant 10 % de FBS puis cultivées pendant 24 h à 37 °C dans 5 % de CO ₂ . Après cela, un milieu de culture frais (1 mL) avec des micelles chargées de médicament (micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur et micelles Cur/oHA-Cur) a été ajouté dans chaque puits. Les cellules ont été cultivées avec du Cur libre servant de contrôle ; la concentration finale en Cur était de 20 μg/mL. De plus, les cellules ont été incubées avec le médicament pendant différents intervalles de temps. Ensuite, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min.

De plus, pour évaluer la capacité de ciblage du CD44 des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur, du HA (2 mg/mL) a été ajouté au milieu en tant que groupe témoin pour se lier aux récepteurs CD44.

De plus, pour marquer les mitochondries cellulaires afin de localiser les micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur et les micelles Cur/oHA-Cur dans les cellules, les cellules ont ensuite été incubées avec un tracker mitochondrial (Mito-tracker Red CMXROS) pendant 15 min. Enfin, les cellules ont été lavées trois fois et observées par microscopie à fluorescence.

Cytométrie en flux

Les analyses quantitatives ont été mesurées par cytométrie en flux. Les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées dans des plaques à six puits à une densité de 10 ⁵ cellules/puits dans 2 mL de milieu avec 10 % de FBS et traité comme décrit ci-dessus. Après incubation avec des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur et des micelles Cur/oHA-Cur (20 μg Cur/mL) pendant différents intervalles de temps, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et trypsinisées par 0,25% de trypsine. Ensuite, les cellules ont été centrifugées à 1500 tr/min pendant 5 min. Après remise en suspension dans du PBS (0,5 mL), les cellules ont été analysées par cytométrie en flux (EPICS XL, Beckman, USA).

Analyse statistique

Les données ont été présentées sous forme de moyennes ± SD (n = 3). De plus, le logiciel SPSS (ver. 20, USA) a été utilisé; les données ont été analysées pour des différences significatives à des niveaux de probabilité de *p < 0,05 (significatif) en utilisant une analyse de variation unidirectionnelle (ANOVA).

Résultats et discussion

Caractérisation des supports TPP-oHA-S-S-Cur

Les voies de synthèse de TPP-oHA, S-S-Cur et TPP-oHA-S-S-Cur ont été présentées sur la Fig. 2.

De plus, le ¹ Les spectres HNMR de oHA, TPP-oHA, S-S-Cur et TPP-oHA-S-S-Cur ont été observés sur la figure 3. TPP-oHA a été synthétisé par TPP et oHA. Des pics caractéristiques de trois cycles benzéniques dans le TPP ont été observés entre 7,570 et 7,717 ppm dans le ¹ Spectre HNMR de TPP-oHA, qui a confirmé que TPP-oHA a été synthétisé avec succès. De plus, S-S-Cur a été synthétisé par l'acide 3,3'-dithio-dipropionique et Cur. De plus, TPP-oHA-S-S-Cur a été synthétisé par TPP-oHA et S-S-Cur. Le TPP dans TPP-oHA-S-S-Cur a été observé dans la région entre 7,570 et 7,717 ppm. Les pics caractéristiques de Cur ont été observés dans le ¹ Spectre HNMR de S-S-Cur et TPP-oHA-S-S-Cur à 6,795-7,467 ppm, et le pic de proton (-CH₂ -S-S-CH₂ -) d'acide 3,3-dithiodipropionique a été observé à 2,502 ppm conformément à TPP-oHA-S-S-Cur. Ces résultats ont confirmé la synthèse réussie de TPP-oHA-S-S-Cur.

¹ Spectres HNMR de oHA, TPP-oHA, S-S-Cur et TPP-oHA-S-S-Cur

Préparation et évaluation des micelles TPP-oHA-S-S-Cur

La taille des particules, l'indice de polydispersité, les potentiels zêta, la DL et l'EE des micelles chargées de médicament sont présentés dans le tableau 1. Les tailles moyennes des micelles Cur/oHA-Cur et Cur/TPP-oHA-SS-Cur étaient de 145,5 ± 2,1 et 122,4 ± 4,6 nm, respectivement. Cela pourrait être dû au fait que le TPP a modifié les propriétés physicochimiques de la surface des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur qui conduisent aux différences de deux micelles. Et les DL et EE des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur étaient supérieures à celles des micelles ordinaires préparées par TPP-oHA. De plus, les micelles Cur/TPP-oHA-SS-Cur avaient un potentiel zêta négatif plus fort (− 21,56 ± 1,46 mV) que celui des micelles Cur/oHA-Cur (− 19,17 ± 0,55 mV), ce qui indiquait une stabilité accrue de TPP-oHA -SS-Cur due à l'agrégation de micelle principalement causée par la présence de TPP.

De plus, l'apparence, la distribution de la taille des particules, le potentiel zêta et la caractérisation de l'image TEM des micelles TPP-oHA-SS-Cur ont été montrés sur la Fig. 4. Les résultats ont révélé que les micelles Cur/TPP-oHA-SS-Cur étaient approximativement sphériques ( Fig. 4d), distribué de manière homogène (Fig. 4b), et avait un diamètre moyen d'environ 122,4  ± 4,6 nm. De plus, l'indice de polydispersité des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur était inférieur de 0,132 à 0,2, ce qui indique l'uniformité de la taille des micelles, ce qui correspond à la MET (Fig. 4c).

Apparence (a ), distribution granulométrique (b ), potentiel zêta (c ) et image TEM (d ) caractérisation des micelles TPP-oHA-S-S-Cur

Comme le montre le tableau 1, la taille des particules des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur était plus petite dans le PBS que dans le PBS contenant du FBS. De 2 à 24 h, la taille est passée de 133,45 ± 6,8 à 160,27 ± 7,1 nm dans du PBS contenant du FBS. Ce phénomène a indiqué que les micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur pouvaient maintenir une meilleure stabilité in vivo.

Étude sur la libération de micelles in vitro

La sensibilité redox de TPP-oHA-S-S-Cur a été étudiée par des micelles dans différentes concentrations de GSH. La libération de Cur à partir de micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur en présence ou en l'absence de GSH a été réalisée pour simuler les environnements tumoraux. Comme le montre la Fig. 5, dans le milieu sans GSH, seulement 32,5% de Cur a été libéré du TPP-oHA-SS-Cur en 120 h, et l'ajout de 10 μM de GSH au milieu n'a entraîné qu'une légère augmentation (37 %). . En revanche, la libération de médicament des groupes avec 2 mM de GSH et 10 mM de GSH était de 57,5 ​​et 75,3 %, respectivement. Cela a été vérifié que la libération de médicament a été augmentée avec la concentration de GSH. Ce résultat a été attribué à la rupture de la liaison disulfure de TPP-oHA-S-S-Cur, ce qui indiquait que les micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur avaient une sensibilité réduite.

Libération in vitro de micelles TPP-oHA-S-S-Cur chargées en Cur à différentes concentrations de GSH (n = 3)

Études de cytotoxicité

La cytotoxicité de différentes formulations de curcumine dans les cellules MDA-MB-231 a été étudiée par dosage MTT. Comme le montre la figure 6, différentes concentrations de formulations de curcumine avaient une viabilité cellulaire différente à 24 h. Les micelles chargées en Cur étaient moins toxiques que le Cur libre, ce qui pourrait s'expliquer par le fait que le matériau polymère diminuait fortement la cytotoxicité cellulaire. Pendant ce temps, la figure 6b a montré un profil de viabilité cellulaire dépendant de la concentration, tandis que les micelles Cur/TPP-oHA-SS-Cur avaient la viabilité cellulaire la plus faible que les micelles Cur/oHA-Cur et d'autres formulations, ce qui pourrait expliquer que Cur/TPP- Les micelles oHA-SS-Cur ont pu facilement entrer dans les cellules et libérer le médicament sous l'effet du GSH. L'IC₅₀ les valeurs des micelles libres Cur, Cur/oHA-Cur et Cur-TPP-oHA-SS-Cur dans les cellules MDA-MB-231 étaient respectivement de 6,534, 5,092 et 3,871 μg/mL, ce qui présentait une meilleure cytotoxicité cellulaire de Cur -Micelles TPP-oHA-SS-Cur dans les cellules MDA-MB-231.

un Cytotoxicité des formulations de curcumine après incubation pendant 24 h. Les données représentent la moyenne  ± SD (n = 6). *p < 0,05, par rapport au Cur libre. b Cytotoxicité des micelles chargées en Cur avec différentes concentrations de Cur (0,5, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 μg/mL). L'IC₅₀ les valeurs des micelles libres Cur, Cur/oHA-Cur et Cur-TPP-oHA-SS-Cur étaient respectivement de 6,534, 5,092 et 3,871 μg/mL

De plus, les micelles vierges présentaient une certaine toxicité (Fig. 6) car le Cur était lié au polymère par une méthode chimique. Cela augmenterait la capacité de charge médicamenteuse des micelles, puis renforcerait l'effet antitumoral.

Images de microscopie à fluorescence de l'absorption cellulaire

L'absorption cellulaire des micelles libres Cur, Cur/oHA-Cur et Cur/TPP-oHA-S-S-Cur ont été étudiées au microscope à fluorescence. Dans ce travail, Cur lui-même n'était pas seulement un médicament anticancéreux mais aussi une sonde de fluorescence verte. Comme le montre la Fig. 7, les micelles Cur/oHA-Cur et les micelles Cur/TPP-oHA-SS-Cur ont montré une bonne absorption cellulaire dans les lignées cellulaires et l'intensité de fluorescence était directement proportionnelle au temps, tandis que l'intensité de fluorescence était plus forte à 4 h. Pendant ce temps, l'intensité de fluorescence du groupe traité avec des micelles Cur/oHA-Cur était plus forte que le groupe Cur libre aux mêmes moments. Cela pourrait être dû au fait que oHA-Cur avec la capacité de cibler le récepteur CD44 a favorisé l'entrée de médicaments dans les cellules. De plus, peut-être grâce à la capacité de sensibilité redox des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur, ses signaux de fluorescence étaient évidemment supérieurs à ceux des micelles Cur/oHA-Cur. En augmentant l'accumulation de Cur, elle serait induite par la cytotoxicité et l'apoptose des cellules cancéreuses, ce qui est cohérent avec les résultats des études de cytotoxicité.

Images de microscopie à fluorescence de l'absorption cellulaire de Cur libre (a ), oHA-Cur/ Cur-micelles (b ), et TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-micelles (c ) à un moment différent. d Cellules traitées avec TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-micelles en présence d'HA libre (2 mg/mL), montrant l'effet de complétion de l'HA dans les cellules MDA-MB-231

De plus, l'intensité de fluorescence du groupe de micelles Cur/TPP-oHA-SS-Cur avec HA était inférieure à celle sans groupe HA, très probablement en raison du fait que les molécules HA libres préoccupaient les récepteurs CD44, ce qui démontrait en outre la capacité de ciblage. du TPP-oHA-SS-Cur contre CD44.

De plus, la localisation mitochondriale de TPP-oHA-S-S-Cur a été confirmée dans les lignées cellulaires MDA-MB-231 par coloration avec Mito-tracker Red CMXRos (Fig. 8). Les images ont révélé que la fluorescence verte des micelles Cur/TPP-oHA-SS-Cur chevauchait bien la fluorescence rouge du tracker mitochondrial, ce qui indiquait que le médicament pouvait s'accumuler dans les mitochondries des cellules cancéreuses, et le TPP-oHA-SS -Cur avait un ciblage mitochondrial.

Localisation mitochondriale. La localisation mitochondriale a été déterminée par coloration avec des trackers mitochondriaux dans des cellules MCF-7 avec le traitement de Cur libre (a ), oHA-Cur (b ), et TPP-oHA-S-S-Cur (c ); barre d'échelle :100 μm

Cytométrie en flux

L'intensité moyenne de fluorescence (MFI) a été mesurée par cytométrie en flux. Comme le montre la figure 9, le MFI des cellules MDA-MB-231 incubées avec des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur et des micelles Cur/oHA-Cur était directement proportionnel au temps d'administration. Conformément à l'observation microscopique confocale, le MFI des cellules traitées avec des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur était significativement plus élevé que le groupe de micelles Cur/oHA-Cur aux mêmes moments (p < 0,05).

Intensité de fluorescence des cellules MDA-MB-231 incubées avec différentes formulations de Cur (20 μg Cur/mL). Données représentées par la moyenne ± SD (n = 3). *p < 0,05, ANOVA unidirectionnelle

Conclusions

Dans cette étude, pour améliorer la solubilité et l'effet du traitement de Cur, réduire les effets secondaires de la thérapie traditionnelle et augmenter le ciblage tumoral du médicament, nous avons pris le disulfurebond sensible à l'oxydoréduction comme bras de connexion et construit un double ciblage mitochondrial et récepteur CD44 conjugués polymère-médicament sensibles à l'oxydoréduction (TPP-oHA-SS-Cur). Le TPP ciblait les mitochondries, le médicament antitumoral Cur servait de fraction hydrophobe et le récepteur CD44 ciblant l'oHA agissait comme fractions hydrophiles. Cur, en tant que médicament modèle, a été chargé dans le copolymère séquencé amphiphile et a formé des micelles par auto-assemblage.

Ce système d'administration de médicament encapsulant Cur par une méthode chimique et une méthode physique améliore non seulement sa DL/EE, mais augmente également sa stabilité et son temps de circulation sanguine, et il pourrait permettre un meilleur ciblage tumoral. Des tests de libération de médicament in vitro ont montré que la liaison disulfure de TPP-oHA-SS-Cur s'est rompue par l'effet d'un taux élevé de GSH (2 à 10 mM) dans les cellules tumorales, suivi de la libération rapide du médicament, puis a démontré sa réduction. sensible. Les résultats de l'absorption cellulaire, de la localisation mitochondriale et de la cytotoxicité ont montré que les micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur avaient une capacité de ciblage du récepteur CD44 et une capacité de ciblage mitochondrial. Prochaine étape, nous évaluerons l'activité antitumorale des micelles Cur/TPP-oHA-S-S-Cur in vivo.

De plus, cette plate-forme de nanocarrier multifonctionnelle intelligente développée dans cette étude a montré le potentiel d'être utilisée pour un médicament hydrophobe avec une solubilité, une stabilité et une efficacité thérapeutique considérablement améliorées. Pendant ce temps, cette méthode a fourni une nouvelle idée pour le traitement des tumeurs.

Abréviations

oHA :

Acide hyaluronique oligomère

S-S-Cur :

Acide dithiodipropionique-curcumine

TPP :

Bromure de (5-Carboxypentyl)triphényl-phosphonium