Nanoparticules de chitosan-albumine sérique bovine chargées en curcumine améliorent l'élimination de l'amyloïde-β42 et modulent la polarisation macrophagique dans la maladie d'Alzheimer

Résumé

La maladie d'Alzheimer (MA) reste le trouble neurodégénératif principal chez les personnes âgées, mais les thérapies efficaces sont limitées par la barrière hémato-encéphalique (BHE), l'élimination médiocre de l'amyloïde-β (Aβ) et la neuroinflammation chronique. Nous avons conçu des nanoparticules (NP) de chitosan (CS)–albumine sérique bovine (BSA) pour administrer la curcumine — un polyphénol puissant anti-inflammatoire et anti-amyloïdogène — directement au cerveau. Les NP de curcumine-chargées CS-BSA ont atteint une efficacité d'encapsulation de 95,4 %, un diamètre moyen de 143,5 nm et une charge de surface négative de -10,8 mV, assurant stabilité et perméabilité favorable à la BHE. Des modèles in vitro de BHE ont montré une pénétration de 60,2 % des NP après 3 h, nettement supérieure à la curcumine libre (29,8 %). Les études d'absorption cellulaire ont révélé des niveaux intracellulaires de curcumine accrus dans les macrophages RAW 264.7, qui à leur tour ont augmenté la phagocytose de l'Aβ42. Mécanistiquement, les NP ont supprimé l'axe TLR4-MAPK/NF-κB, régulé à la baisse les cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6) et déplacé les macrophages d'un phénotype M1 neurotoxique vers un phénotype M2 protecteur. Ces résultats démontrent que les NP de curcumine-chargées CS-BSA potentialisent l'élimination de l'Aβ42 tout en modulant la neuroinflammation, offrant une plateforme de nanomédecine prometteuse pour la thérapie de la MA.

Introduction

La MA se caractérise par un déclin cognitif progressif et le dépôt caractéristique de fibrilles extracellulaires d'Aβ42. Alors que l'Aβ42 monomérique est physiologiquement bénin, les agrégats oligomériques sont hautement neurotoxiques et font progresser la maladie. Cibler l'agrégation de l'Aβ42 et promouvoir son élimination sont donc centraux aux stratégies thérapeutiques. Les cellules microgliales, les macrophages résidents du cerveau, reconnaissent l'Aβ via les récepteurs de type toll (TLR) et phagocytent le peptide. Cependant, une activation chronique polarise les microglies vers un phénotype M1 pro-inflammatoire, exacerbant les lésions neuronales. Favoriser un passage vers le phénotype M2 anti-inflammatoire est apparu comme une approche modificatrice de la maladie viable.

La curcumine, dérivée du curcuma (Curcuma longa), présente des propriétés anti-amyloïdogènes, antioxydantes et chélatrices de métaux. Elle peut moduler la polarisation des macrophages en inhibant la cascade de signalisation TLR4-MAPK/NF-κB. Malheureusement, la faible solubilité de la curcumine, son métabolisme rapide et sa perméabilité limitée à la BHE entravent son utilité clinique.

Les porteurs nanoparticulaires peuvent surmonter ces barrières. Le CS est un polysaccharide cationique, biocompatible, capable de former des complexes stables avec des protéines anioniques telles que la BSA. La BSA est abondante dans le plasma, non immunogène et confère des caractéristiques de libération soutenue aux nanoparticules. En combinant CS et BSA, nous avons fabriqué des NP chargées en curcumine optimisées pour la traversée de la BHE et la livraison ciblée aux microglies.

Matériaux

Le CS (déacétylation 80 %, ~400 kDa) provenait de Haixin Biological Product Co., Ltd. La BSA (Sigma-Aldrich), la curcumine (Dalian Meilun Biotechnology) et l'Aβ42 marqué FITC (Chinese Peptide Co.) ont été achetés commercialement. Les lignées cellulaires RAW 264.7 (macrophages monocytes de souris) et hCMEC/D3 (endothéliaux microvasculaires cérébraux humains) ont été cultivées en DMEM supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin et antibiotiques. Le LPS (1 µg/ml) a été utilisé pour polariser les cellules RAW 264.7 vers le phénotype M1, imitant l'activation microgliale dans la MA.

Préparation des NP de curcumine-chargées CS-BSA

Le CS a été dissous dans de l'acide acétique 0,1 % (0,5 mg/ml). La curcumine (0,05 mg/ml dans 100 µl DMSO) a été mélangée à la solution de CS sous agitation magnétique à température ambiante. Une solution de BSA (1,0 mg/ml) a ensuite été ajoutée goutte à goutte, produisant une suspension opalescente qui s'est condensée en nanoparticules solides via interaction électrostatique. La taille des particules, le potentiel zêta et la morphologie ont été caractérisés par diffusion dynamique de la lumière et MET. La libération in vitro a été évaluée dans du tampon phosphate salin (pH 7,4) à 37 °C, et l'efficacité d'encapsulation (EE) a été calculée comme EE % = (W_total – W_libre)/W_total × 100 % où W_total est la quantité initiale de curcumine et W_libre le surnageant.

Évaluation de l'apoptose cellulaire par MTT

Des NP CS-BSA vides (0-2,0 mg/ml) ont été incubées avec des cellules RAW 264.7 (M1) et hCMEC/D3 pendant 24 h pour évaluer la cytotoxicité via le test MTT.

Études de pénétration utilisant un modèle in vitro de BHE

Une monocouche de cellules hCMEC/D3 (TEER > 300 Ω) a été cultivée sur des inserts Transwell. De la curcumine libre ou des NP de curcumine-chargées CS-BSA (équivalent curcumine 100 µg/ml) ont été ajoutées à la chambre supérieure. Après 3 h d'incubation à 37 °C, l'intensité de fluorescence de la curcumine (excitation 425 nm, émission 530 nm) dans la chambre inférieure a été mesurée. Le rapport de fluorescence relatif (RFR %) a quantifié l'efficacité de pénétration. Des inhibiteurs de l'endocytose (chlorpromazine, genistéine, cytochalasine D, azide de sodium) ont été appliqués pour élucider les mécanismes de transport.

Absorption cellulaire des NP de curcumine-chargées CS-BSA

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) a évalué la distribution intracellulaire de la curcumine dans les cellules RAW 264.7 (M1) après exposition à de la curcumine libre ou des NP chargées via le système Transwell. La fluorescence verte de la curcumine a été surveillée aux intervalles de 6, 12 et 24 h.

Détection de la phagocytose de l'Aβ42 induite par la curcumine libre et les NP de curcumine-chargées CS-BSA

Les cellules RAW 264.7 (M1) prétraitées avec de la curcumine libre ou des NP chargées ont été incubées avec de l'Aβ42 marqué FITC pendant 3 h. La phagocytose a été quantifiée par fluorescence CLSM et cytométrie de flux.

Essai Western blot

Les niveaux d'expression de TNF-α, IL-6, TLR4 et les états de phosphorylation d'ERK, JNK, p38, IκBα et NF-κB ont été examinés par Western blot pour élucider l'impact des NP chargées en curcumine sur l'axe TLR4-MAPK/NF-κB.

Résultats

Caractérisation des NP de curcumine-chargées CS-BSA

La diffusion dynamique de la lumière a révélé un diamètre moyen de 143,5 nm, un potentiel zêta de -10,8 mV et un indice de polydispersité de 0,021. Les images MET ont confirmé des particules sphériques, monodisperses (Figure 1). L'efficacité d'encapsulation a atteint 95,4 %. Le profil de libération a montré une libération initiale de 11,3 % en 3 h, suivie d'une libération soutenue sur 48 h, indiquant une protection efficace de la curcumine pendant la circulation.

Pénétration à travers un modèle in vitro de BHE

La pénétration de la curcumine libre était de 12,3 % (1 h), 20,3 % (2 h) et 29,8 % (3 h). Les NP chargées en curcumine ont atteint 37,7 %, 45,6 % et 60,2 % de pénétration aux mêmes points temporels, respectivement (Figure 2). Les expériences d'inhibition de l'endocytose ont démontré que les NP reposaient sur des voies dépendantes de l'énergie, médiées par les caveoles et la macropinocytose, tandis que la curcumine libre entrait dans les cellules principalement par diffusion passive.

Évaluation de la cytotoxicité

Les tests MTT ont confirmé que les NP CS-BSA vides étaient non cytotoxiques pour les cellules RAW 264.7 (M1) et hCMEC/D3 à des concentrations jusqu'à 2,0 mg/ml (Figure 3).

Absorption cellulaire

L'imagerie CLSM a montré une accumulation temps-dépendante de la curcumine au sein des cellules RAW 264.7 (M1). Les NP chargées en curcumine ont produit une fluorescence intracellulaire nettement plus élevée que la curcumine libre, indiquant une livraison améliorée (Figure 4).

Phagocytose accrue de l'Aβ42

La co-localisation de la curcumine (rouge) et de l'Aβ42-FITC (vert) a démontré que les NP chargées en curcumine augmentaient la présence intracellulaire de l'Aβ42 dans les cellules RAW 264.7 (M1), comme en témoigne une densité plus élevée de fluorescence verte (Figure 5). Cela suggère que l'augmentation de la curcumine intracellulaire augmente la capacité phagocytaire des microglies.

Analyse Western blot

Comparés aux témoins non traités, les cellules RAW 264.7 (M1) polarisées par LPS présentaient une expression élevée de TNF-α, IL-6 et TLR4, et une phosphorylation accrue d'ERK, JNK, p38 et NF-κB. Les NP chargées en curcumine ont nettement réduit ces marqueurs pro-inflammatoires et événements de signalisation, soulignant leur capacité à inhiber la polarisation M1 (Figure 6).

Discussion

Nos résultats confirment que les nanoparticules CS-BSA améliorent significativement la livraison de curcumine à travers la BHE, principalement via des voies médiées par les caveoles et la macropinocytose. La pénétration cérébrale améliorée se traduit par des concentrations intracellulaires de curcumine plus élevées, ce qui, à son tour, stimule la phagocytose de l'Aβ42 par les microglies et réduit le fardeau pathologique des plaques amyloïdes.

L'effet anti-inflammatoire des NP chargées en curcumine est évident par la suppression de la cascade TLR4-MAPK/NF-κB et la régulation à la baisse de TNF-α, IL-6 et TLR4. Cette modulation des cytokines repolarise les macrophages d'un phénotype M1 neurotoxique vers un état M2 anti-inflammatoire, une stratégie thérapeutique de plus en plus reconnue pour la modification de la maladie dans la MA.

Collectivement, ces résultats positionnent les NP de curcumine-chargées CS-BSA comme une plateforme de nanomédecine multifacette qui aborde simultanément la livraison du médicament, l'élimination de l'amyloïde et la neuroinflammation — obstacles clés dans le traitement de la MA.

Conclusion

Les nanoparticules de curcumine-chargées CS-BSA pénètrent efficacement la BHE, augmentent l'accumulation intracellulaire de curcumine et favorisent la phagocytose de l'Aβ42 par les microglies. Elles atténuent également la neuroinflammation en inhibant la voie TLR4-MAPK/NF-κB et en favorisant la polarisation des macrophages M2. Ces attributs soulignent collectivement la promesse thérapeutique de cette nanoplatforme pour la maladie d'Alzheimer.

Abréviations

MA

Maladie d'Alzheimer

BHE

Barrière hémato-encéphalique

BSA

Albumine sérique bovine

CS

Chitosan

LPS

Lipopolysaccharide

NP

Nanoparticules

TLR

Récepteurs de type toll