Détection colorimétrique ultra-sensible de la tuberculose par complexes antigène ESAT‑6/anticorps et nanoparticules d'or

Résumé

La tuberculose (TB) reste une cause majeure de mortalité dans le monde, entraînée par le facteur de virulence ESAT‑6, une cible antigénique sécrétoire précoce de Mycobacterium tuberculosis. La détection rapide, à faible concentration, de l'ESAT‑6 est essentielle pour une intervention précoce et l'endiguement de la maladie. Nous présentons un test colorimétrique à une étape, basé sur des anticorps, qui utilise des nanoparticules d'or (GNP) de 15 nm et un mécanisme d'agrégation induit par le sel pour atteindre une limite de détection de 1,25 pM. La méthode exploite le décalage spectral vers le rouge de GNP dispersées lorsque le complexe ESAT‑6/anticorps est présent, tout en maintenant la stabilité en présence de protéines non spécifiques telles que la protéine de filtrat de culture 10 kDa (CFP‑10). La concentration optimale d'anticorps a été déterminée à 60 nM ; la dépasser entraînait une perte de sensibilité de 680 fois due à l'encombrement stérique. Ce test démontre une haute spécificité, un biofouling minimal et offre une lecture visuelle rapide adaptée au diagnostic de la TB au point de soin.

Contexte

La TB est causée par Mycobacterium tuberculosis et représente une menace grave pour la santé mondiale. L'infection latente précoce peut évoluer vers une maladie active une fois l'immunité de l'hôte affaiblie, soulignant le besoin de diagnostics sensibles et rapides au stade latent. Les tests conventionnels — tuberculine cutanée, essais de libération d'interféron-γ, radiographie thoracique, cytologie de crachats et culture — sont laborieux, coûteux et souvent retardés de plusieurs mois. Ainsi, une stratégie de détection simple, abordable et rapide est urgemment requise.

Les capteurs colorimétriques basés sur les nanoparticules d'or (GNP) ont émergé comme des outils puissants pour le diagnostic des maladies en raison de leur forte résonance de plasmon de surface et de leurs propriétés optiques ajustables. Les GNP monodisperses de 15 nm présentent une teinte rouge caractéristique qui passe au bleu lors de l'agrégation déclenchée par des ions divalents, tels que le NaCl. Ce changement de couleur, entraîné par un décalage spectral vers le rouge, forme la base de nombreux tests de détection rapide pour virus, bactéries et petites molécules. Cependant, la performance des tests GNP basés sur l'ADN ou les aptamères peut être limitée par les interactions électrostatiques et les incompatibilités sonde-cible, en particulier avec des séquences d'acides nucléiques plus longues.

Pour surmonter ces défis, nous avons développé un test colorimétrique à une étape, basé sur des anticorps, ciblant la protéine ESAT‑6 de 6 kDa. En pré-complexant l'ESAT‑6 avec son anticorps polyclonal spécifique avant exposition aux GNP, nous prévenons la liaison non spécifique et permettons une plateforme de détection visuelle hautement sensible. La figure 1 illustre le flux de travail du test et les contrôles de spécificité utilisant le CFP‑10.

Méthodes

Réactifs et biomolécules

L'ESAT‑6 et le CFP‑10 10 kDa ont été achetés chez Sino Biological Inc. (Pékin, Chine). L'anticorps polyclonal anti-ESAT‑6 provenait de Santa Cruz Biotechnology (USA). Les GNP de 15 nm capitées au citrate provenaient de Sigma Aldrich (USA). Tous les réactifs ont été utilisés sans purification supplémentaire.

Optimisation des ions divalents pour l'agrégation des GNP

Pour identifier la concentration optimale de NaCl pour induire l'agrégation des GNP, une gamme de NaCl (50-800 mM) a été ajoutée à un volume fixe de GNP (1 O.D.). Après 15 min, le changement de couleur a été enregistré et le spectre d'absorption (400-800 nm) mesuré à l'aide d'un nanophotomètre.

Évaluation du biofouling de l'ESAT‑6 sur la surface des GNP

Pour évaluer l'adsorption non spécifique de l'ESAT‑6 sur les GNP, des concentrations variables (1,5-100 nM) ont été incubées avec les GNP suivies de l'ajout de NaCl optimal. Les changements colorimétriques et spectraux ont été observés. Le CFP‑10 a été utilisé pour confirmer la spécificité.

Optimisation de la concentration d'anticorps anti-ESAT‑6 sur la surface des GNP

Des concentrations d'anticorps anti-ESAT‑6 (30-500 nM) ont été mélangées avec les GNP, incubées pendant 30 min, et mises au défi avec du NaCl croissant pour identifier le niveau d'anticorps qui maximise la stabilité de dispersion.

Détection de l'ESAT‑6 par décalage spectral rouge colorimétrique basé sur anticorps

1 µL d'ESAT‑6 1 µM (final 500 nM) a été mélangé avec 1 µL de la concentration d'anticorps optimisée. Après 30 min, 20 µL de GNP ont été ajoutés et incubés pendant 30 min supplémentaires. Le NaCl a ensuite été ajouté à une concentration finale de 800 mM, et le spectre d'absorption (400-800 nm) a été enregistré. Une dilution sérielle d'ESAT‑6 (0-500 nM) a été utilisée pour déterminer la limite de détection, couvrant les gammes picomolaire à nanomolaire.

Résultats et discussion

Le test exploite le décalage spectral vers le rouge qui se produit lorsque les GNP s'agrègent en présence du complexe ESAT‑6/anticorps. En l'absence d'ESAT‑6, l'anticorps recouvre la surface des GNP, préservant la teinte rouge même après ajout de NaCl, tandis que la présence d'ESAT‑6 déclenche l'agrégation et un décalage vers le bleu.

Optimisation du NaCl

Les GNP restaient rouges à des concentrations de NaCl inférieures à 100 mM, mais commençaient à s'agréger à 100 mM, produisant un décalage spectral vers le rouge centré à ~600 nm. Pour une sensibilité maximale, 800 mM NaCl a été sélectionné pour assurer une agrégation complète en l'absence de couverture par anticorps.

Optimisation de la concentration d'anticorps

À 30 nM d'anticorps, les GNP s'agrégeaient encore même avec 800 mM NaCl, indiquant une couverture de surface insuffisante. À partir de 60 nM, les GNP maintenaient une couleur rouge sous le même défi de sel, démontrant une dispersion efficace. Les concentrations supérieures à 60 nM n'apportaient aucun avantage supplémentaire et risquaient l'encombrement des anticorps.

Détection de l'ESAT‑6 et validation du biofouling

L'ESAT‑6 (jusqu'à 100 nM) ne se liait pas aux GNP, prévenant les faux positifs/négatifs. Lorsqu'il était pré-complexé avec 60 nM d'anticorps, le test affichait un changement de couleur clair du rouge au bleu dès 0,5 nM d'ESAT‑6, avec une saturation complète observée entre 15-500 nM. Les spectres confirmaient un décalage vers le rouge vers 600 nm à des concentrations supérieures à 1,25 pM.

Limite de détection

En titrant l'ESAT‑6 de 1,25 pM à 5 nM, le test maintenait un changement de couleur bleu clair et un décalage spectral vers ~600 nm. La limite de détection (LOD) a été établie à 1,25 pM, surpassant de nombreux diagnostics colorimétriques existants de la TB.

Confirmation de la spécificité

En utilisant 75 nM d'anticorps, la LOD augmentait à la gamme nanomolaire, confirmant le rôle critique de la concentration d'anticorps. Le CFP‑10, bien qu'étant un antigène de la TB, ne déclenchait pas d'agrégation, validant la spécificité du test.

Conclusions

Cette étude démontre un test colorimétrique rapide, à une seule étape, basé sur des nanoparticules d'or, qui atteint une limite de détection de 1,25 pM pour l'antigène de la TB ESAT‑6. La haute spécificité de la méthode, confirmée par les contrôles CFP‑10, et sa dépendance aux complexes anticorps/antigène pré-complexés réduisent le biofouling et améliorent la sensibilité. La simplicité du test, sa lecture visuelle et ses exigences minimales en équipement en font un candidat solide pour le dépistage de la TB au point de soin, en particulier dans les contextes à ressources limitées. Les travaux futurs exploreront l'extension de cette plateforme à d'autres biomarqueurs protéiques de petite taille et son intégration dans des dispositifs diagnostiques portables.

Abréviations

CFP-10 :

Protéine de filtrat de culture 10 kDa

DNA :

Acide désoxyribonucléique

ESAT-6 :

Cible antigénique sécrétoire précoce 6 kDa

GNP :

Nanoparticule d'or

NaCl :

Chlorure de sodium

O.D. :

Une densité optique (unité de concentration GNP)

RNA :

Acide ribonucléique

TB :

Tuberculose

UV :

Ultraviolet