Supports lipidiques hybrides lyophilisés nanostructurés pour améliorer l'absorption cellulaire du vérapamil :optimisation statistique et évaluation in vitro

Contexte

Le vérapamil est un agent bloquant les canaux calciques de type L de la classe des phénylalkylamines et un antagoniste du récepteur α-adrénergique. Il est largement utilisé pour le traitement de l'hypertension, de la tachyarythmie supraventriculaire, de l'angine de poitrine et des céphalées en grappe. Selon le système de classification biopharmaceutique, le vérapamil est classé comme médicament de classe I. Les médicaments de cette classe sont connus pour avoir une bonne absorption via la membrane intestinale (≤  90 %) après administration orale. Cependant, seulement 20 à 35 % de la dose orale de vérapamil est transmise à la circulation sanguine en raison du métabolisme de premier passage rapide par la circulation portale [1]. Par conséquent, il est important de développer des supports appropriés qui peuvent améliorer l'absorption cellulaire du vérapamil et éventuellement améliorer sa biodisponibilité.

Les nanoformulations à base de lipides de deuxième génération, telles que les transporteurs lipidiques nanostructurés (NLC), ont présenté un grand potentiel d'utilisation dans l'administration d'agents thérapeutiques [2, 3]. Les NLC ont une stabilité chimique et physique plus élevée que les nanoparticules lipidiques solides (SLN), et elles ont également des propriétés de libération contrôlée. De plus, les NLC présentent une capacité de charge élevée pour les molécules médicamenteuses en formant un réseau cristallin moins ordonné de matrice lipidique, ce qui pourrait minimiser l'expulsion du médicament pendant le stockage. Les NLC sont préparés à partir de lipides, qui accélèrent la formation de chylomicrons à l'intérieur des intestins et facilitent l'absorption des NLC qui peuvent augmenter la biodisponibilité des médicaments [4]. Par conséquent, la présente étude a développé des transporteurs lipidiques hybrides vérapamil-dextrane nanostructurés (HVD-NLC) pour améliorer l'absorption cellulaire du médicament, ce qui peut conduire à augmenter sa biodisponibilité.

La plupart des médicaments lipophiles peuvent facilement être incorporés dans les NLC, mais il est assez difficile de piéger des médicaments hydrophiles comme le vérapamil dans une nanoformulation à base de lipides. Ainsi, dans la présente étude, des NLC hybrides utilisant un contre-ion de dextrane sulfate de sodium ont été préparées pour améliorer l'encapsulation du vérapamil et prolonger sa libération à partir des NLC (Fig. 1). Les formulations HVD-NLC ont été préparées par la méthode d'homogénéisation à chaud et à haut cisaillement et optimisées statistiquement à l'aide d'un 2 ⁴ conception factorielle complète. Deux types de lipides ont été utilisés dans l'étude, le lipide solide, le Compritol 888 ATO® et le lipide liquide acide oléique. Les HVD-NLC préparés ont été caractérisés pour leur taille de particule (PS), leur potentiel zêta (ZP), leur indice de polydispersité (PDI) et le pourcentage d'efficacité de piégeage du médicament (% EE). Les HVD-NLC optimisées ont été lyophilisées en utilisant du tréhalose comme cryoprotecteur. Les profils de libération in vitro ont été réalisés dans des environnements alcalins et acides. L'étude d'absorption cellulaire in vitro du vérapamil à partir des HVD-NLC sélectionnés a été réalisée à l'aide de lignées cellulaires Caco-2. L'étude de stabilité de la formulation optimisée a été menée pendant 6 mois dans trois conditions différentes (5 °C ± 3 °C, 25 °C ± 2 °C/60% RH ± 5% RH et 40 °C ± 2 °C/ 75 % d'HR ± 5 % d'HR).

Formation d'un complexe électrostatique de chlorhydrate de vérapamil, un médicament cationique hydrosoluble et de contre-ion polymère sulfate de dextrane sodique

Méthodes

Matériel

Le vérapamil HCl a été acheté à l'usine pharmaceutique de Wenzhou (Wenzhou, Chine). Le Compritol 888 ATO® (Glycerol dibehenate EP – Glyceryl behenate NF) a été obtenu auprès de Gattefosse (Saint-Priest, France). L'acide oléique a été acheté auprès de R &M Chemicals (Essex, Royaume-Uni). Le Tween 80® (Polysorbate 80) a été acheté auprès d'Euro chemo-pharma Sdn. Bhd. (Penang, Malaisie). Le Poloxamer 188 (Pluronic® F-68) a été acheté auprès de Molekula (Dorset, Royaume-Uni). Le tréhalose, le Sephadex® G-25 et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). La lignée cellulaire Caco-2 a été obtenue auprès de l'ATCC (Virginie, USA). La solution de pénicilline-streptomycine 100 X a été obtenue auprès de Biowest (Nuaillé, France). La trypsine 0,25% et le milieu Eagles modifié de Dulbecco (DMEM) ont été achetés auprès de GE Healthcare Life Sciences, Hyclone Laboratories (Utah, États-Unis). Tampon de lyse passif, 5X a été acheté auprès de Promega (Wisconsin, États-Unis).

Méthodes

Préparation des HVD-NLC

Les HVD-NLC ont été préparés par la méthode d'homogénéisation à chaud à cisaillement élevé. La phase lipidique consistait en Compritol ATO 888® et l'acide oléique a été fondu par chauffage à 85 °C (10 °C au-dessus du point de fusion du lipide solide). La quantité requise de vérapamil a été pesée et dissoute dans la phase aqueuse contenant un mélange de Tween 80® et de poloxamère 188 dans un rapport de 1:1 w /w . La phase aqueuse a été chauffée à la même température que la phase lipidique. La phase aqueuse a été versée dans la phase lipidique et homogénéisée à l'aide d'un homogénéisateur numérique T25 Ultra-Turrax®, IKA® (Staufen, Allemagne) à 24 000 tr/min, 85 °C. Par la suite, la solution aqueuse de sulfate de dextrane (rapport 1:1 au vérapamil) a été ajoutée lentement au mélange pendant le processus d'homogénéisation. Les HVD-NLC préparés ont été laissés à refroidir à température ambiante (25 ± 2 °C).

Optimisation statistique des paramètres de formulation à l'aide de 2 ⁴ Approches complètes de conception factorielle et de fonction de désirabilité

Un plan factoriel complet à deux niveaux et quatre variables a été réalisé pour optimiser et évaluer l'effet des variables indépendantes de la formulation (facteurs) sur les caractéristiques (variables dépendantes ou réponses) (Tableau 1). Les vrais niveaux haut et bas pour chaque variable indépendante ont été sélectionnés sur la base des études préliminaires.

Les réponses expérimentales obtenues à partir des variables dépendantes étaient les résultats des effets individuels et combinés des quatre variables indépendantes. Cette conception expérimentale à deux niveaux fournit suffisamment de données pour s'adapter à l'équation polynomiale suivante.

Où X est une variable dépendante ; β₀ est une interception ; β₁ , ₂ , ₃ , et ₄ sont les coefficients des variables indépendantes A , B , C , et D respectivement. Tandis que β₁₂ , ₁₃ , ₁₄ , ₂₃ , ₂₄ , et ₃₄ sont les interactions respectives (c'est-à-dire AB, AC, AD, BC, BD et CD). Les résultats expérimentaux ont été analysés par un logiciel Design-Expert® version 6.0.10 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA) suivi d'une analyse de variance (ANOVA) pour déterminer la significativité des facteurs et leurs interactions. L'analyse statistique a été considérée comme significative lorsque le p les valeurs étaient < 0,05.

Les formulations finales ont été sélectionnées sur la base de l'approche de la fonction de désirabilité. La fonction de désirabilité combine toutes les réponses en une seule variable pour prédire les niveaux optimaux des facteurs étudiés. Par conséquent, il a été déterminé qu'il était souhaitable de sélectionner les formulations optimisées avec la taille de particule (PS) et l'indice de polydispersité (PDI) les plus faibles et les valeurs de potentiel zêta (ZP) et de pourcentage d'efficacité de piégeage (% EE) les plus élevées. La fonction de désirabilité convertit toutes les réponses en une échelle commune (0, 1) et les combine par moyenne géométrique pour l'optimisation de la métrique globale. La valeur de désirabilité 1 désigne une valeur acceptable (valeur la plus souhaitée) pour les réponses, tandis que la valeur de désirabilité 0 indique une valeur inacceptable.

Mesures de la taille des particules, de l'indice de polydispersité et du potentiel Zeta

Le PS et le PDI des nanoparticules préparées ont été mesurés à l'aide d'un spectromètre à corrélation de photons (Zetasizer 1000HS/3000HS, Malvern Instrument, Malvern, Royaume-Uni). Le ZP a été déterminé à l'aide d'un analyseur de potentiel zêta (série Zetasizer nano, badge Nano Z-red, Malvern Instrument, Malvern, Royaume-Uni). Tous les échantillons ont été dilués à l'aide d'eau distillée filtrée (filtre en nylon de 0,45 μm) et les mesures ont été effectuées en triple.

Détermination du pourcentage d'efficacité de piégeage

L'échantillon préparé contenant le complexe vérapamil-dextrane libre et les HVD-NLC ont été séparés par une méthode de centrifugation sur mini-colonne en utilisant Sephadex® G25. Un volume de 1 mL de l'échantillon a été placé en haut de la colonne, puis centrifugé pendant 2 min à 2000 rpm. L'éluant contenant les HVD-NLC a été collecté et lyophilisé à l'aide d'un lyophilisateur (Labconco, Free Zone Freeze Dry Systems, Kansas City, USA).

Les HVD-NLC lyophilisés (10 mg) ont été dissous dans du chloroforme et évaporés sous azote gazeux à 40°C. L'échantillon séché a ensuite été dissous dans 1 ml d'eau distillée, vortexé pendant 2 minutes et centrifugé (Eppendorf, Allemagne) à 12 000 tr/min pendant 5 minutes. Le surnageant a été recueilli et la quantité de vérapamil a été déterminée en utilisant une méthode validée de chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le %EE a été calculé à l'aide de l'équation suivante :

L'analyse HPLC pour la quantification du vérapamil a été réalisée à l'aide du système chromatographique Shimadzu équipé d'une pompe de distribution LC 20AD (Kyoto, Japon) et d'une colonne Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm). La phase mobile se composait d'acétate d'ammonium 20 mM et d'acétonitrile dans un rapport de 40:60 (v /v ). Le pH de la phase mobile a été ajusté à pH 6,5 avec de l'acide acétique glacial. Le volume d'injection était de 20 μL et la longueur d'onde de détection du vérapamil a été fixée à 278 nm et le débit a été fixé à 1,5 mL/min.

Étude de lyophilisation

La lyophilisation a été effectuée à - 40 °C pendant 24 h en utilisant un Labconco, FreeZone Freeze Dry Systems (Kansas City, USA). Cinq types de sucres couramment utilisés, y compris le mannitol, le fructose, le saccharose, le lactose et le tréhalose à un rapport lipide:cryoprotecteur de 1:1 ont été criblés, afin de sélectionner un cryoprotecteur approprié pour la lyophilisation des HVD-NLC. Le cryoprotecteur qui a produit le PS et le PDI moyens les plus bas de la formulation lyophilisée après reconstitution dans de l'eau distillée a été sélectionné pour une étude plus approfondie.

Dans l'étude suivante, la formulation HVD-NLC a été mélangée avec le cryoprotecteur sélectionné en utilisant deux méthodes. Dans la première méthode, le cryoprotecteur a été ajouté après la préparation de la formulation HVD-NLC, et il a été nommé « après le processus d'homogénéisation ». Alors que dans la deuxième méthode, le cryoprotecteur a été ajouté lors de la préparation de la formulation HVD-NLC, et il a été nommé « pendant le processus d'homogénéisation ». Dans la première méthode, plusieurs lipides et ratios cryoprotecteurs de 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 et 1:8 ont été préparés et lyophilisés. Les formulations de HVD-NLC lyophilisées ont été redispersées dans l'eau distillée filtrée (filtre en nylon de 0,45 μm) et les échantillons ont été évalués pour le PS moyen, le PDI et le % EE. Les rapports lipide:cryoprotecteur qui ont produit le PS et le PDI les plus bas et le % d'EE le plus élevé ont été sélectionnés pour des études supplémentaires dans la deuxième méthode de mélange.

Étude de diffusion in vitro

L'étude de libération in vitro du vérapamil à partir de CNL a été réalisée à l'aide d'une poche de dialyse placée dans un milieu de liquide intestinal simulé (pH 6,8) ou de liquide gastrique simulé (pH 1,2). Dans cette étude, 2 mL de dispersion de HVD-NLC ont été versés dans le sac de dialyse (seuil de 12 000 Da MW). Le sac a été scellé puis immergé dans 150 mL de milieu de libération préchauffé. L'étude de libération a été réalisée sur un agitateur magnétique à plaque chauffante réglé à une vitesse d'agitation de 100 tr/min et à 37 °C. À des intervalles de temps programmés de 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 et 72 h, 1 mL d'échantillon a été prélevé et remplacé par le même volume de milieu frais. La concentration de vérapamil libérée a été déterminée par HPLC.

Calorimétrie différentielle à balayage

L'analyse calorimétrique différentielle à balayage (DSC) a été réalisée en utilisant un Perkin-Elmer Pyris 6 DSC (Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK). Les échantillons ont été pesés (5 à 7 mg) dans un plateau en aluminium et scellés à l'aide d'une presse à sertir standard (Perkin-Elmer, Beaconsfield, Royaume-Uni). Les courbes DSC ont été enregistrées à la vitesse de 10 °C/min de 0 à 260 °C.

Diffusion des rayons X à grand angle

L'analyse par diffusion des rayons X grand angle (WAXS) θ/2θ a été réalisée à température ambiante à l'aide d'un PANalytical X'Pert PRO MRD PW3040 (Almelo, Pays-Bas) appliquant un rayonnement Cu Kα. Les échantillons ont été analysés dans une plage de températures de 2 à 60 °C avec une vitesse de balayage de 5 °C/min.

Microscope électronique à transmission et Microscope électronique à balayage

La morphologie (c'est-à-dire la forme et la taille) des HVD-NLC a été observée par un microscope électronique à transmission (MET) en utilisant (Philips CM12, Eindhoven, Pays-Bas). Une goutte de dispersion diluée de HVD-NLC a été placée sur une grille de cuivre de 400 mesh suivie d'une coloration négative avec de l'acide phosphotungstique à 2 %. L'échantillon préparé a été séché à l'air avant l'examen MET.

La morphologie des HVD-NLC lyophilisées a été observée à l'aide d'un microscope électronique à balayage (MEB) (Leo Supra 50 VP field Emission SEM, Oberkochen, Allemagne). L'échantillon de HVD-NLC lyophilisé a été fixé sur un talon en aluminium puis recouvert d'or (10 nm d'épaisseur) dans un dispositif de pulvérisation cathodique à 15 mA pendant 15 min. L'échantillon a été visualisé à l'aide d'un système de microanalyse à rayons X à dispersion d'énergie Oxford INCA avec une tension d'accélération de 10 kV.

Captation cellulaire des HVD-NLC

L'étude d'absorption cellulaire in vitro du vérapamil à partir d'une formulation HVD-NLC a été étudiée à l'aide d'une lignée cellulaire Caco-2. Les cellules ont été cultivées dans des milieux de croissance DMEM complétés par une solution à 1 % de pénicilline-streptomycine et à 10 % de FBS dans un flacon de culture tissulaire T-25. Ensuite, les cellules Caco-2 ont été collectées et ensemencées dans des plaques à 48 puits, à une densité de 60 000 cellules par puits avec un milieu complet DMEM jusqu'à ce que les cellules deviennent confluentes et forment une monocouche au fond de la plaque à puits. Plusieurs solutions contenant la même concentration de vérapamil ont été préparées en diluant des HVD-NLC, une solution de vérapamil et un complexe vérapamil-dextrane avec du milieu DMEM uniquement. Une solution de vérapamil et un complexe vérapamil-dextrane ont été utilisés comme témoins. Par la suite, les milieux complets DMEM de la monocouche de cellules Caco-2 dans des plaques à 48 puits ont été échangés avec différentes dilutions de HVD-NLC, une solution de vérapamil et un complexe vérapamil-dextrane et incubés à 37 °C pendant 6 h. Une fois la période d'incubation terminée, les échantillons de HVD-NLC, de solution de vérapamil et de complexe vérapamil-dextrane ont été retirés des puits. Le résidu des échantillons d'essai et les cellules mortes ont été retirés des monocouches par lavage trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les cellules de la monocouche ont été lysées en ajoutant du tampon de lyse passive (200 μL) à chaque puits d'échantillon. Les échantillons ont été pipetés et centrifugés à 12 000 tr/min pendant 10 minutes pour extraire le vérapamil des cellules. Les surnageants ont été collectés et la concentration de vérapamil a été quantifiée par HPLC.

Étude de stabilité à court terme

L'étude de stabilité à court terme de la formulation optimisée des HVD-NLC a été réalisée conformément aux directives Q1A (R2) du Conseil international pour l'harmonisation des exigences techniques des produits pharmaceutiques pour l'homme (ICH). La formulation HVD-NLCs lyophilisée fraîchement préparée (VER-9) a été placée dans trois conditions différentes (5 ± 3 °C, 25 ± 2 °C/60 ± 5% d'humidité relative (HR) et 40 ± 2 °C/75 ± 5% HR) pendant 6 mois. La stabilité de la formulation optimisée des HVD-NLC a été examinée en mesurant le PS, le PDI, le ZP et la teneur totale en médicament à 0, 1, 3 et 6 mois.

Analyse statistique

Les résultats ont été analysés à l'aide d'une analyse de variance à un facteur (ANOVA) et suivis d'un Tukey-HSD post-hoc. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel IBM® SPSS® Statistical (Version 22, NY, USA). Toutes les valeurs ont été exprimées sous forme de moyenne et d'écart type (moyenne ± SD). La différence était statistiquement significative lorsque p < 0,05.

Résultats et discussion

Analyse utilisant 2 ⁴ Conception factorielle complète

Les valeurs des variables indépendantes sélectionnées, c'est-à-dire le temps d'homogénéisation (A), la concentration en lipides solides (B), la concentration en lipides liquides (C) et la concentration en surfactant (D) et les résultats obtenus des réponses sélectionnées, c'est-à-dire PS, PDI , ZP et %EE sont présentés dans le tableau 2. Chaque variable indépendante et leurs interactions ont été évaluées statistiquement à l'aide de l'ANOVA. Le coefficient polynomial pour chaque variable dépendante a été généré par le logiciel Design-Expert® pour quantifier l'effet de chaque variable indépendante, comme indiqué dans les équations. 3, 4, 5 et 6. Les équations ne représentaient que les facteurs significatifs et leurs interactions.

où A est le temps d'homogénéisation (min), B est la concentration en lipides solides (mg), C est la concentration en lipides liquides (mg), et D est la concentration en tensioactif (mg). Les signes positifs et négatifs avant chaque facteur ou facteurs d'interaction dans les équations représentent respectivement un effet synergique ou antagoniste. Les graphiques de surface de réponse ont été générés pour observer l'effet simultané de chaque facteur ou interactions de facteurs sur les paramètres de réponse.

Effets des variables sur la taille moyenne des particules

Comme le montre l'éq. 3, facteurs A , C , et D ont des effets antagonistes sur la taille des particules (PS). On pourrait conclure que l'augmentation du temps d'homogénéisation (facteur A ) est simultanément associée à une diminution significative du PS des NLC (p < 0,05). Ceci est probablement dû à la force de cisaillement élevée de l'homogénéisation qui brise efficacement les globules lipidiques en particules plus petites. De même, l'augmentation de la concentration en lipides liquides (C ) a été trouvé pour diminuer simultanément le PS des NLC. Cela pourrait être attribué à la capacité de l'acide oléique à diminuer la viscosité du système ainsi que la tension superficielle lorsqu'il est combiné avec le Compritol 888 ATO®, produisant ainsi une plus petite taille de particule de NLC. La capacité du lipide liquide à diminuer la viscosité du système lorsqu'il est combiné avec le lipide solide a également été rapportée par Jenning et al. lorsqu'ils ont préparé une dispersion de SLN [5]. Les auteurs ont observé que l'augmentation de la concentration en lipides liquides de 0 à 38 % dans la composition de la matrice lipidique réduirait la taille des particules. De plus, l'augmentation de la concentration en tensioactif (D ) réduirait le PS, car une quantité plus élevée de tensioactif présent dans le système émulsifierait facilement la teneur totale en lipides de la formulation, formant ainsi des nanoparticules plus petites.

La figure 2 montre les (p <0,05) effet des interactions des facteurs (AC, BD et CD) sur le PS du NLC. L'impact positif du facteur (BD) et l'impact négatif des facteurs (interaction AC et CD) ont montré un effet significatif sur la taille des particules des NLC. L'impact négatif du facteur (AC) a montré qu'un temps d'homogénéisation plus long et une concentration plus élevée en lipides liquides provoquaient une diminution de PS. L'interaction entre des concentrations plus élevées de lipide solide et de tensioactif dans la formulation NLC (interaction BD) a montré un impact positif significatif sur la taille des particules, ce qui a entraîné une plus grande taille des particules. En revanche, l'interaction entre des concentrations plus élevées de lipide liquide et de tensioactif (interaction CD) a montré un impact négatif significatif sur la taille des particules là où une plus petite taille était produite.

Graphique de la surface de réponse décrivant l'importance (p < 0,05) effet du temps d'homogénéisation, de la concentration en lipides liquides, de la concentration en surfactant et de l'interaction entre a CA, b BD, et c CD sur le PS des HVD-NLC. Un temps d'homogénéisation, B lipide solide, C lipide liquide, D tensioactif

Effets des variables sur PDI

Comme illustré dans l'éq. 4, il est démontré que l'acide oléique a un impact négatif sur le PDI, ce qui signifie que l'augmentation de la concentration d'acide oléique abaisserait les valeurs PDI et conduirait à une meilleure distribution des particules NLC. Un effet similaire de l'acide oléique sur la NLC a également été observé par certaines recherches [6]. La figure 3 a représenté l'interaction entre le temps d'homogénéisation et la concentration en lipides liquides (interaction AC). Cette interaction a montré un effet négatif significatif sur le PDI. Cela signifie qu'un temps d'homogénéisation plus long et une concentration plus élevée en lipides liquides entraîneraient une diminution des valeurs PDI. De plus, l'interaction entre les concentrations de lipides liquides et de surfactant (interaction CD) a montré un effet synergique sur les valeurs de PDI. Ainsi, l'augmentation simultanée des concentrations de lipides liquides et d'agents tensioactifs augmenterait les valeurs de PDI et produirait des particules de HVD-NLC moins homogènes. Cela pourrait être dû à une augmentation supplémentaire de la concentration de tensioactif au-delà de la valeur optimisée pouvant provoquer une accumulation de tensioactif sur les surfaces externes des nanoparticules, ce qui augmente à son tour les valeurs PDI. Le même schéma a également été observé par Shamma et al., selon lequel l'augmentation de la concentration de surfactant a entraîné une augmentation des valeurs PDI des NLC [7].

Graphique de la surface de réponse représentant les (p < 0,05) effet de la concentration en lipides liquides et interactions entre a CA et b CD sur PDI de HVD-NLC. Un temps d'homogénéisation, C lipide liquide, D tensioactif

Effets des variables sur ZP

Les formulations HVD-NLC avaient une charge négative due à l'ionisation du béhénate de glycéryle (un acide gras dans le Compritol 888 ATO®), de l'acide oléique et du résidu de sulfate de dextrane. Basé sur l'éq. 5, l'augmentation de la quantité d'acide oléique a eu un impact négatif sur les nanoparticules et a entraîné une augmentation de la charge négative des nanoparticules, augmentant ainsi la ZP des HVD-NLC. Ceci est peut-être dû à une ionisation excessive de groupes carboxyliques abondants dans l'acide oléique (lipide liquide) [8]. De plus, le béhénate de glycéryle (lipide solide) a également montré un effet négatif sur les valeurs ZP, où l'augmentation de sa concentration augmente le ZP des nanoparticules. Cela est dû à une ionisation plus élevée du carboxylique dans le béhénate de glycéryle qui conduit à des charges négatives plus élevées à la surface externe des nanoparticules.

L'interaction BD a eu un effet positif significatif sur le ZP des NLC, tandis que l'interaction CD a montré un effet négatif (Fig. 4). Augmenter la concentration de lipide solide et diminuer la concentration de tensioactif réduit la charge négative des nanoparticules et diminue les valeurs ZP. Probablement, à ce stade, une concentration plus faible en tensioactif ne serait pas en mesure d'ioniser la quantité totale de lipide solide, ce qui conduirait à réduire les charges négatives à la surface des nanoparticules, réduisant ainsi le ZP des HVD-NLC. De plus, l'augmentation simultanée de la concentration de lipide liquide et de tensioactif (interaction CD) augmenterait considérablement la valeur ZP des HVD-NLC. C'est parce que plus d'acide carboxylique serait ionisé en présence d'une concentration de surfactant plus élevée dans la formulation.

Graphique de la surface de réponse représentant les (p < 0,05) effet de la concentration en lipides liquides, de la concentration en surfactant et des interactions entre a BD et b CD sur le ZP des HVD-NLC. B lipide solide, C lipide liquide, D tensioactif

Effets des variables sur %EE

L'équation 6 a montré que l'augmentation du temps d'homogénéisation serait significativement (p <0,05) diminuent le % EE du médicament. Un temps d'homogénéisation plus long pourrait éliminer ou décoller les molécules de médicament attachées à la surface externe des nanoparticules, ce qui a entraîné un % EE inférieur du médicament dans les HVD-NLC. En revanche, l'augmentation de la concentration de surfactant a entraîné un % EE plus élevé du médicament dans les HVD-NLC. Cela pourrait être dû à une concentration de surfactant plus élevée qui augmenterait son revêtement de surface externe de NLC, où une partie du médicament serait piégée dedans. Zhuang et al. et Das et al. ont suggéré qu'une concentration adéquate de surfactant est essentielle pour la solubilisation des molécules médicamenteuses à l'intérieur du réseau lipidique et à la surface externe des nanoparticules [9, 10].

Comme le montre la figure 5, l'interaction AD a eu un impact significatif (p <0,05) impact négatif, par lequel l'augmentation du temps d'homogénéisation et la diminution de la quantité de tensioactif abaissent le % EE du médicament dans les HVD-NLC. En revanche, l'interaction entre les concentrations de lipides solides et de surfactant (interaction BD) a montré un effet positif sur le % EE du médicament. Par conséquent, l'augmentation de la concentration de lipide solide et de surfactant augmentera le % EE du médicament dans les HVD-NLC. Cela est probablement dû à la concentration plus élevée de tensioactif qui solubiliserait les molécules de médicament en excès, et en même temps, une quantité plus élevée de lipides solides présents dans le système a accueilli les molécules de médicament en excès, augmentant ainsi le % EE du médicament dans le HVD- NLC.

Graphique de la surface de réponse représentant les (p < 0,05) effet du temps d'homogénéisation, de la concentration en lipides liquides, de la concentration en surfactant et des interactions entre a AD et b BD sur l'EE du vérapamil dans les HVD-NLC. Un temps d'homogénéisation, B lipide solide, D tensioactif

Sélection de HVD-NLC optimisés à l'aide de la fonction de désirabilité

Les formulations HVD-NLC avec les numéros de code VER-9, VER-11, VER-13 et VER-15 avaient des valeurs de désirabilité plus élevées de 0,863, 0,852, 0,811 et 0,840, respectivement. Ces formulations ont été sélectionnées pour une étude plus approfondie car les valeurs de désirabilité étaient plus proches de 1. La fonction de désirabilité individuelle et combinée de toutes les réponses pour les formulations sélectionnées est illustrée à la figure 6. La moyenne PS, PDI, ZP et % EE de ces les formulations étaient comprises entre 173,46 ± 0,757 et 190,3 ± 8,22, 0,451 ± 0,033 à 0,501 ± 0,019, − 46,73 ± 1,13 à − 49,16 ± 1,55 et 93,95 ± 4,10 à 98,81 ± 1,01, respectivement.

Bar graph displaying the individual and combined desirability of several responses on selected HVD-NLCs formulations. un VER-9, b VER-11, c VER-13, and d VER-15

Lyophilization Study

Lyophilization is one of the commonly used methods in the pharmaceutical field to change aqueous formulation into the dried form to prolong the physical and chemical stability of the nanoparticle during storage [11, 12]. However, the lyophilization step produces various stresses to the sample during the process. So, the need of cryoprotectant is essential to avoid the stress condition and protect the sample. Among the screened cryoprotectants, trehalose was found to be the most suitable one for protecting the HVD-NLCs formulations from aggregation after the lyophilization process. The HVD-NLCs formulations protected with trehalose had the smallest particle size and lowest PDI (Table 3). Trehalose offers many advantages over other cryoprotectants including less chemical interactions and exhibit higher glass transition temperature which may help to prolong the stability of nanoparticles. Furthermore, trehalose has been demonstrated as an efficient cryoprotectant for freeze drying of Compritol 888 ATO® (Glyceryl behenate) in the lipid-based nanoparticles [13, 14]. Thus, in the present study, trehalose was selected as cryoprotectant for the HVD-NLCs formulations.

In the next study, different ratios of trehalose were used in the HVD-NLCs formulations after or during the homogenization process. Table 4 shows the effects of different ratios of trehalose added into the formulations after homogenization on PS, PDI, and %EE.

The mean PS was found in the nano size range, while PDI was < 1 in all ratios of lipids to trehalose used in the study. However, the %EE of verapamil was decreased significantly with increasing the ratio of trehalose to lipids. The %EE of lipid:trehalose at the ratio of 1:1 was significantly higher than the lipid:trehalose ratio of> 1:1. Increasing the amount of trehalose beyond the lipid trehalose ratio of 1:1 enhanced the removal of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex. This is possibly due to the interaction between trehalose and dextran at the outer surface of nanoparticles, which promotes the displacement of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex and hence, lowers the %EE of drug in the HVD-NLCs. The interaction between trehalose and dextran takes place due to the formation of sugar-salt complex (trehalose-dextran complex), in that the trehalose (sugar) competes with cationic verapamil and forms complex with polyanionic dextran [15]. Miller et al. measured the viscosity and glass transition temperature of trehalose with boric acid and proposed the formation of chemical complex between trehalose and borate ion (B(OH)₄ ⁻ ) [15]. Therefore, based on the obtained results, the lipid to trehalose ratios of 1:1 and 1:2 were selected for the next study of trehalose addition during homogenization. Table 5 shows that the results of PS, PDI, and %EE were significantly better when trehalose were added during homogenization. This could be due to better mixing of trehalose in the HVD-NLCs formulation by the homogenization process. It is evident from the data that there was no significant difference in the %EE of lipid:trehalose ratios of 1:1 and 1:2. Therefore, formulation VER-9 and VER-11 at lipid:trehalose ratio of 1:1 was selected for further studies.

In Vitro Release of HVD-NLCs

The release profile of verapamil solution from the selected HVD-NLCs formulations (VER-9 and VER-11) in SGF and SIF are shown in Fig. 7. The release profile of verapamil from the VER-9 and VER-11 formulations was significantly longer than verapamil solution in both SGF and SIF media. Verapamil was loaded as an ionic complex with dextran sulfate in the HVD-NLCs formulation. This could be the reason for the sustained release of verapamil from the HVD-NLCS. The formulations released about ~ 85% of verapamil after 48 h and the drug had a prolonged release profile up to 72 h. On the other hand, the verapamil solution released approximately 99% of verapamil within 4 h. The release profiles of the selected formulations VER-9 and VER-11 were found almost similar in SGF and SIF release media. However, the release of verapamil from VER-9 was found slightly better as compared to VER-11 in the SGF release medium. The percentage cumulative release of verapamil at 72 h from VER-9 (95.91 ± 1.40) was found significantly higher as compared to VER-11 (90.67 ± 1.16) in the SGF medium. Therefore, VER-9 was selected as a final formulation and proceeded for further investigations.

Cumulative percentage of verapamil released in a SIF (pH 6.8) and b SGF (pH 1.2) release media for 72 h

DSC Study

The DSC analysis of verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, physical mixture (including Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), lyophilized blank formulation (Placebo), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 8. Verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, and trehalose had the melting peak at 144.96 °C, 220.41 °C, 72.46 °C, 50.80 °C, and 100.13 °C, respectively. The thermograms showed that there was no significant shift in the peaks of physical mixture, lyophilized blank formulation, and HVD-NLCs formulation (VER-9) when compared to the individual peak components such as Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate. This indicated the physical compatibility between the components. The endothermic peak of verapamil at 144.96 °C was no longer seen in the thermogram of HVD-NLCs formulation (VER-9) (Fig. 8f), which could be due to verapamil that had changed to amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs matrix [16].

DSC thermograms of a Compritol 888 ATO, b Polomxamer 188, c verapamil HCl, d dextran sulfate, e trehalose, f verapamil HCl and dextran sulfate physical mixture, g physical mixture (including Compritol 888 ATO, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), h placebo, and i HVD-NLCs formulation (VER-9)

WAXS Study

The WAXS/2θ scans of pure verapamil, dextran sulfate, bulk Compritol 888 ATO®, trehalose, lyophilized blank formulation (containing Compritol 888 ATO®, oleic acid, poloxamer 188, Tween 80®, trehalose, and dextran sulfate), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 9. The diffraction peaks of pure verapamil showed specific crystalline nature of the drug at 2θ scattered angles 14.42°, 16.67°, 17.07°, 18.07°, 18.82°, 20.22°, 23.77°, and 26.27° [17]. However, the WAXS/2θ scans of HVD-NLCs formulation (VER-9) showed that the peaks of verapamil diminished indicating a decrease in the crystallinity of the drug when incorporated in the lipids of HVD-NLCs. The scan also showed the predominant peaks at 2θ scattered angles 12.47°, 15.17°, 16.87°, 21.07°, and 23.82° which possibly attributed to the crystalline structure of Compritol 888 ATO® and trehalose because none of these peaks showed similarity with any of the pure verapamil peaks [10]. The results suggested that verapamil was in the amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs formulation. The Compritol 888 ATO® revealed polymorphic crystalline transformation upon heating, whereby it changed to a more stable form, and showed reduced intensity peaks at 21.1° and 23.3° in the HVD-NLCs and blank formulations. The WAXS pattern of pure dextran sulfate indicated its amorphous form.

X-ray patterns of a lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9), b lyophilized blank formulation, c trehalose, d dextran sulfate, e verapamil HCl, and f Compritol 888 ATO

Electron Microscopic Examinations

The particle shape and size of the HVD-NLCs formulation (VER-9) were examined using the electron microscope. The liquid preparation of HVD-NLCs formulation (VER-9) observed under transmission electron microscope (TEM) showed that the particles had a spherical shape with the size less than 200 nm (Fig. 10). In contrast, observation under scanning electron microscope (SEM) revealed that the nanoparticles no longer had a spherical shape following lyophilization of the formulation without trehalose. However, the cryoprotective effect of trehalose could be seen when it was incorporated in the HVD-NLCs formulation (VER-9). The SEM image indicated that the trehalose helped to protect the structure of the nanoparticle to such extent when compared to the lyophilized formulation without the cryoprotectant (Fig. 11).

TEM image of VER-9 before lyophilization

SEM images of VER-9 formulation a without trehalose; b with trehalose

Cellular Uptake Study of HVD-NLCs

Caco-2 cells have been extensively used to study drugs intestinal cellular uptake [18]. The Caco-2 cells lines is spontaneously differentiating to form monolayer which has significant morphological and biological resemblance to the intestinal epithelium [19]. Several researchers have reported the in vitro cytotoxicity studies of Compritol ATO 888® [20], oleic acid [21, 22], Tween 80® [23, 24], and poloxamer 188 [25]. These substances were used as excipients in the optimized formulation of HVD-NLCs (VER-9). Based on their finding, these excipients were safe within the concentration used, the cell line type, and cell density that have been employed in the present study. The concentration of verapamil in the samples of VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex used in the cellular uptake study was in the range of 10.03 μg/200 μL to 30.1 μg/200 μL. It was found that the verapamil cellular uptake was increased with increasing the verapamil concentration in the samples. The cellular uptake values of verapamil from VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex were increased from 6.45 ± 2.62 to 15.92 ± 4.78 μg, 0.89 ± 0.28 to 1.46 ± 0.65 μg, and 0.064 ± 0.019 to 0.118 ± 0.003 μg, respectively (Fig. 12). The verapamil cellular uptake from the VER-9 formulation was 10.90- and 134.91-fold higher than the verapamil solution and verapamil-dextran complex, respectively. The results indicated that verapamil was passively transported from HVD-NLCs, verapamil solution, and verapamil-dextran complex in the caco2-cells. A similar finding of higher cellular uptake of drugs from a lipid-based nanoformulation was reported [26].

In vitro model of Caco-2 cell line showing cellular uptake of HVD-NLCs (VER-9), verapamil solution, and verapamil-dextran complex (mean ± SD, n = 3)

Caco-2 cells act similarly as cell in animals when stimulated by fatty acid. van Greevenbroek et al. suggested that the incorporation of long-chain unsaturated fatty acids (e.g., oleic acid and linoleic acid) into the Caco-2 cells stimulate the secretion of very low-density lipoproteins (VLDL) and chylomicrons. In contrast, administration of saturated fatty acids primarily secretes intermediate- and low-density lipoproteins (IDL and LDL) [27]. Similar findings of increasing chylomicron secretion by the long-chain fatty acids were also reported by Caliph et al. in animal model [28]. In the present investigation, the long-chain fatty acids (Compritol 888 ATO® and oleic acid) used in the preparation of the HVD-NLCs may also stimulate the secretion of chylomicron, and hence increase the cellular uptake of the model drug.

Stability Study

The lyophilized VER-9 formulation was found stable for 6 months at refrigerated condition (5 ± 3 °C) (Table 6). There were no significant differences in the PS, PDI, ZP, and %EE after 6 months of stability study at storage temperature of 5 ± 3 °C. However, the VER-9 formulation was not stable after 1-month storage at the temperatures of 25 ± 2 °C/60 ± 5%RH and 40 ± 2 °C/75 ± 5% RH. The PS and PDI were increased significantly, while the total drug content decreased significantly. After 1 month of stability study, the samples were not measurable due to aggregation and sticky behavior of the nanoparticles.

Conclusion

The lyophilized HVD-NLCs formulation was successfully developed and optimized. The lipid carriers had prolonged the release of verapamil from the HVD-NLCs formulation. The formulation was in the nano size range and stable for 6 months at 5 ± 3 °C. The cellular uptake of verapamil lipid formulation (NLCs) was found higher than the non-lipid formulations. This suggested that the NLCs as a lipid carrier for verapamil may play an important role in improving the absorption of the drug.

Abréviations

%EE:

Percentage of entrapment efficiency

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagles medium

DSC :

Calorimétrie différentielle à balayage

FBS:

Fetal bovine serum

HVD-NLCs:

Hybrid verapamil-dextran nanostructured lipid carriers

ICH:

The international council for harmonization of technical requirements for pharmaceuticals for human

IDL:

Intermediate density lipoproteins

LDL:

Low density lipoproteins

NLCs:

Nanostructured lipid carriers

PBS :

Phosphate-buffered saline

PDI :

Indice de polydispersité

PS :

Particle size

RH:

Relative humidity

SEM :

Microscope électronique à balayage

TEM :

Microscope électronique à transmission

VLDL:

Very low-density lipoproteins

WAXS:

Wide-angle X-ray scattering

ZP:

Zeta potential