Cibler miR-410/Wnt-11 régule la formation osseuse et inhibe les ostéoclastes pour traiter l'ostéonécrose de la tête fémorale

Résumé

Contexte

Le rôle fonctionnel du microARN-410 (miR-410) dans l'ostéonécrose de la tête fémorale (ONFH) est peu connu. Cette étude vise à étudier la régulation de la formation osseuse et de l'ostéoclastogenèse par le ciblage de Wnt-11 par miR-410 dans la prévention de l'ONFH.

Méthodes

Quinze échantillons d'ONFH et quinze échantillons normaux ont été collectés. Les changements pathologiques de la tête fémorale, des ostéoblastes et des ostéoclastes ont été observés. Un modèle rat d'ONFH a reçu des injections d'agomir-miR-410, de Wnt-11-siRNA ou d'oe-Wnt-11. L'expression de miR-410, Wnt-11, des facteurs ostéoblastiques (ALP, BGLAP, Collα1) et ostéoclastiques (ACP5, CTSK, MMP9), ainsi que de Bcl-2 et Bax, a été mesurée par RT-qPCR et Western blot. Les indices de fonction ostéogénique (ALP, OCN) et ostéoclastique (NTX-1, CTX-1) dans le sérum ont été dosés par ELISA.

Résultats

Dans les tissus d'ONFH, miR-410, ALP, BGLAP et Collα1 sont diminués, tandis que Wnt-11, ACP5, CTSK et MMP9 sont augmentés. La surexpression de miR-410 et l'inhibition de Wnt-11 augmentent la densité minérale osseuse (DMO) et le rapport BV/TV chez le rat, élèvent la DMO du fémur, de la tête fémorale et de la colonne vertébrale, augmentent le calcium et le phosphore sériques, réduisent l'apoptose des ostéocytes, augmentent l'expression d'OCN, ALP, BGLAP, Collα1 et diminuent celle d'ACP5, CTSK, NTX-1, CTX-1, MMP9.

Conclusion

Cette étude suggère que la surexpression de miR-410 ou l'inhibition de Wnt-11 augmentent les ostéoblastes et réduisent les ostéoclastes, atténuant ainsi l'ONFH. miR-410 pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour l'ONFH.

Introduction

L'ostéonécrose de la tête fémorale (ONFH), l'une des maladies les plus fréquentes affectant l'articulation de la hanche, entraîne de vives douleurs ou une invalidité articulaire et touche principalement les sujets d'âge moyen [1]. Le traitement de l'ONFH de l'adulte, qui compte 8,12 millions de patients en Chine, reste un défi pour les chirurgiens [2]. De nombreux facteurs de risque sont associés : hyperlipidémie, maladies auto-immunes, troubles de la coagulation, alcoolisme, hypercorticisme [3]. Le traitement chirurgical comprend la décompression centrale avec ou sans adjuvant (moelle osseuse autologue), tandis que l'arthroplastie totale de la hanche (ATH) est réservée aux patients âgés ou aux stades avancés non traitables par conservation articulaire [4]. Cependant, le pronostic de l'ONFH reste insatisfaisant chez les patients nécessitant souvent une ATH [5]. Il est urgent d'identifier une cible thérapeutique précise.

Les microARN (miARN) sont des régulateurs majeurs de la fonction cellulaire et de l'expression génique, influençant l'homéostasie endothéliale et représentant une nouvelle piste thérapeutique [6]. Des études ont montré que miR-410 est anormalement exprimé dans plusieurs cancers humains et agit comme suppresseur de tumeur dans les cancers de l'endomètre, du poumon, du myélome et du sein [7-10]. Un effet neuroprotecteur de miR-410 dans un modèle cellulaire de Parkinson induit par la 6-hydroxydopamine via la voie PTEN/AKT/mTOR a été rapporté [11]. miR-410 module aussi les comportements malignes de la leucémie lymphoblastique aiguë de l'enfant via FKBP5 et la voie AKT [12]. Un effet inhibiteur de miR-410 ciblant le récepteur de l'angiotensine II de type 1 dans le cancer du pancréas a été démontré [13]. Les protéines Wnt sont des glycoprotéines sécrétées riches en cystéine, jouant un rôle majeur dans le développement et la maladie [14]. Wnt-11 appartient à la voie de signalisation Wnt et est un régulateur positif impliqué dans la carcinogenèse [15]. L'expression de Wnt11 a une signification clinique dans le carcinome épidermoïde du col utérin [16]. TGF-β1 et Wnt11 agissent en synergie pour induire l'expression de sm-α-actine dans le muscle lisse via la signalisation Rho kinase-actine-MRTF-A [17]. Sur la base de ces données, cette étude explore le rôle de miR-410 régulant Wnt-11 dans la prévention de l'ONFH, avec l'hypothèse que miR-410 ciblant Wnt-11 module les mécanismes ostéogénique et ostéoclastique.

Matériels et méthodes

Déclaration d'éthique

L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'hôpital Beijing Shijitan, Université médicale de la capitale, et suit la déclaration d'Helsinki. Les participants ont donné leur consentement écrit. Les expériences animales respectent les directives du NIH. Le protocole a été autorisé par le comité d'éthique animale du même hôpital.

Sujets d'étude

Trente patients traités au service d'orthopédie de l'hôpital Beijing Shijitan de janvier 2017 à septembre 2018 ont été sélectionnés. Quinze patients ONFH (groupe ONFH) opérés par ATH : âge médian 50,6 ± 4,3 ans, poids 57,0 ± 5,6 kg, 7 hommes, 8 femmes. Quinze patients avec fracture du col fémoral (groupe contrôle) opérés par ATH : âge 59,6 ± 3,3 ans, poids 50,0 ± 5,6 kg, 9 hommes, 6 femmes. Aucune différence significative en genre, âge, poids (P > 0,05). Les tissus de la zone nécrose sous-chondrale ont été prélevés par ciseau le long de l'axe longitudinal de la tête fémorale et conservés à -80 °C. Chaque groupe a été examiné par pathologie et biologie moléculaire.

Coloration hématoxyline-éosine (HE)

Les échantillons ont été fixés au formol 4% et décalcifiés à l'EDTA 10% (remplacement hebdomadaire). Après décalcification complète, inclusion en paraffine, coupes de 4 μm. Les lames ont été déparaffinées (xylène I/II 10 min), réhydratées (alcools gradués 2 min), colorées à l'hématoxyline 3 min, différenciées à l'alcool chlorhydrique 1% 2 min, réhydratées (alcools 50%, 70%, 80% 2 min), colorées à l'éosine 5 s, déshydratées (alcools 95%, absolu I/II 3 min, xylène I/II 5 min), montées en gomme neutre et observées au microscope.

Coloration phosphatase alcaline (ALP)

Une coupe par échantillon, cuite 60 °C 60 min. Déparaffinage (xylène I/II 15 min), réhydratation (alcools gradués 5 min), lavage eau distillée (3 × 2 min). Dépôt de substrat ALP (kit Nanjing JianCheng), incubation 37 °C 15 min à l'abri de la lumière. Élimination du substrat, ajout agent chromogène A 5 min, lavage 30 s, agent chromogène B 30 s, contre-coloration 30 s. Photographie au microscope 200×, comptage des ostéoblastes par analyse d'image (Image-Proplus 6.0).

Coloration phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP)

Une coupe par échantillon, cuite 60 °C 60 min. Déparaffinage (xylène I/II 15 min), réhydratation (alcools gradués 5 min). Fixation 30 s. Incubation dans solution de coloration TRAP fraîche (Sigma) à 37 °C 1 h dans le noir. Contre-coloration hématoxyline 2 min, séchage. Observation directe au microscope (pas de montage). Photographie 200×, comptage des ostéoclastes (Image-Proplus 6.0).

Immunohistochimie

Après décalcification, inclusion paraffine, coupes 4 μm. Déparaffinage, déshydratation, blocage peroxydases (H₂O₂ 3% 7 °C 30 min), récupération antigénique (citrate 0,01 M 95 °C 20 min). Blocage sérum mouton 10 min, anticorps primaire Wnt-11 (1:100, Invitrogen) 4 °C overnight, anticorps secondaire (kit PV-6000, ZSGB-Bio) 20 min, streptavidine peroxydase (S-A/HRP, ComWin) 2 min. Révélation DAB (Sigma), contre-coloration hématoxyline (Bogoo), montage. PBS comme contrôle négatif. Au microscope, cellules positives : brun dans le cytoplasme. Évaluation en double aveugle : 5 champs 400×, 100 cellules/champ. Score : négatif (-) <5% ; faiblement positif (+) 5-24% ; positif (++) 25-50% ; fortement positif (+++) >50%.

RT-qPCR

ARN total extrait par kit Trizol (Invitrogen). Concentration et pureté vérifiées. Amorces conçues par Takara Bio (Otsu, Japon) (Fichier supplémentaire 1: Tableau S1). Transcription inverse avec kit PrimeScript RT (Takara). PCR quantitative avec SYBR Premix Ex Taq II (Takara) sur système ABI PRISM 7300. U6 comme contrôle de charge pour miR-410 ; GAPDH comme référence pour Wnt-11, ALP, BGLAP, Collα1, ACP5, CTSK, MMP9, Bcl-2, Bax. Niveaux relatifs calculés par méthode 2^{-ΔΔCt} [18].

Western blot

Protéines totales extraites des tissus de tête fémorale. Concentration mesurée, chargement égalisé. Gels SDS 10% (gel de séparation et de concentration). Électrophorèse, transfert sur membrane nitrocellulose. Blocage lait écrémé 5% 4 °C overnight. Incubation anticorps primaires : Wnt-11 (1:150, Santa Cruz), ALP (1:100, Sigma), BGLAP, Collα1, MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam), Bcl-2, Bax (1:500, Proteintech) overnight. Anticorps secondaire IgG-HRP (1:1000, Boster) 1 h. Révélation chimiluminescence (Pierce). GAPDH comme référence. Analyse d'image par ImageJ2x.

Modèle rat d'ONFH

Quatre-vingt-dix rats Sprague-Dawley mâles (300-350 g, SLAC Shanghai). Environnement 18-25 °C, humidité 45-70%, cages individuelles, calme. Après 1 semaine d'adaptation, modèle par traumatisme : anesthésie intrapéritonéale, épilation, préparation cutanée, incision, section du ligament rond, grattage du périoste du col fémoral, destruction de la vascularisation de la tête fémorale, suture par plans, stérilisation.

Groupes animaux

Soixante-dix rats modèles réussis répartis en 7 groupes (n=10) : ONFH ; agomir-NC (0,5 mL agomir NC miR-410 200 nM, RiboBio) ; agomir-miR-410 (0,5 mL agomir miR-410 200 nM) ; siRNA-NC (0,4 mL vecteur siRNA Wnt-11 NC 1×10⁹ PFU, GenePharma) ; Wnt-11-siRNA (0,4 mL siRNA Wnt-11 1×10⁹ PFU) ; agomir-miR-410 + OE-NC (0,5 mL agomir-miR-410 + 0,4 mL OE-NC Wnt-11 1×10⁹ PFU) ; agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (0,5 mL agomir-miR-410 + 0,4 mL OE-Wnt-11 1×10⁹ PFU). Injections autour de l'articulation de la hanche 1 semaine après modélisation. Groupe normal (saline intrapéritonéale, n=10) comme contrôle. Après 4 semaines : micro-CT, ostéométrie, radiographie, densitométrie osseuse, dosage calcium/phosphore sérique.

Micro-CT et ostéométrie

Tête fémorale droite sur micro-CT (GE Healthcare). Paramètres : résolution 27 μm³, courant 450 mA, tension 80 kV, temps 88 min. Trois régions d'intérêt (ROI) cuboïdes aléatoires (0,5 cm³) reconstruites par logiciel GE Microview. Paramètres : densité minérale osseuse (DMO) et fraction de volume osseux (BV/TV).

Radiographie, DMO, calcium/phosphore sérique

À 4 semaines, anesthésie (chloral hydrate 10% IP), position dorsale, radiographie. Observation forme et densité tête fémorale. Densitométrie biphotonique (DEXA) sur fémur gauche, tête fémorale, colonne. Prélèvement sanguin (5 mL, ponction cardiaque, jeûne 12 h) à 4 semaines, centrifugation 3000 tr/min 15 min, dosage calcium/phosphore par analyseur biochimique automatique.

Microscopie électronique

Tissu osseux fixé glutaraldéhyde 3,5%, décalcifié HCl 5% + acide osmique 1%, déshydratation acétone graduée, double coloration acétate d'uranyle/acide citrique, inclusion Epon-61. Coupes semi-fines puis ultra-fines observées en MET.

Test TUNEL

Coupes paraffine déparaffinées, déshydratées. Incubation pepsine (0,25-0,5% HCl) 25 min. Dépôt 50 μL mélange réaction TUNEL, incubation boîte humide 60 min. Dépôt 50 μL agent peroxydase, incubation 30 min. Révélation DAB, arrêt à l'eau, coloration hématoxyline 2 min, déshydratation (éthanol 95% I/II, absolu I/II 3-5 min, xylène I/II 3-5 min), montage gomme neutre. Analyse au microscope optique.

ELISA

Sang artère fémorale après anesthésie, sérum par centrifugation 1 h. Selon kit ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology). 7 puits standards (100 μL concentrations variées), puits blancs (100 μL diluant), puits échantillons (100 μL). Incubation 1 h, lavage, solution A 100 μL 1 h, lavage, solution B 100 μL 30 min, substrat TMB 90 μL 10-20 min, arrêt 50 μL. Lecture OD au lecteur de microplaques, calcul concentration.

Test double luciférase

Sites de liaison miR-410/Wnt-11 3'UTR prédits par TargetScan (https://www.targetscan.org). Séquence 3'UTR Wnt-11 contenant site miR-410 clonée dans pMIR-REPORT Luciferase (Ambion) → plasmide Wnt-11-WT. Mutant Wnt-11-MUT construit par mutagenèse. Extraction plasmides (Promega), cellules 293T en plaques 96 puits (confluence 70%), transfection Lipofectamine 2000. Co-transfection Wnt-11-WT ou MUT avec mimics NC ou miR-410 mimics (GenePharma). Lyse 48 h post-transfection, dosage luciférase (BioVision) sur luminomètre Glomax 20/20 (Promega).

Analyse statistique

SPSS 21.0. Données : moyenne ± écart-type. ANOVA à un facteur pour comparaisons multiples, test t pour deux groupes, test LSD-t de Fisher post-ANOVA. P < 0,05 = significatif.

Résultats

Changements pathologiques dans les tissus ONFH des échantillons cliniques

La coloration HE montre que dans le groupe contrôle (fracture col fémoral), les trabécules osseuses sont bien distribuées, structure intacte. Dans le groupe ONFH, de nombreuses lacunes osseuses vides dans le cervelet osseux, cellules osseuses diminuées, trabécules continuellement modifiées, hyperplasie tissulaire autour du cervelet (Figure 1a).

La coloration TRAP révèle que le TRAP se trouve principalement dans les ostéoclastes (identification ostéoclastes matures). Comparé au contrôle, le nombre d'ostéoclastes TRAP+ augmente dans le groupe ONFH, morphologie diverse, grandes cellules multinucleées. Défects osseux évidents adjacents aux ostéoclastes, résorption osseuse (Figure 1b).

La coloration ALP (marqueur ostéoblastes matures) montre des granules bruns/café dans le cytoplasme. Comparé au contrôle, le nombre d'ostéoblastes ALP+ diminue dans le groupe ONFH (Figure 1c).

miR-410, ALP, BGLAP, Collα1 diminués et Wnt-11, ACP5, CTSK, MMP9 augmentés dans les tissus ONFH

Western blot et RT-qPCR montrent que dans le groupe ONFH : miR-410 diminué, Wnt-11 augmenté ; facteurs ostéoblastiques (ALP, BGLAP, Collα1) diminués ; facteurs ostéoclastiques (ACP5, CTSK, MMP9) augmentés (tous P < 0,05) (Figure 2a-c).

L'immunohistochimie confirme : Wnt-11 exprimé dans le cytoplasme, positif brun/brun-jaune. Taux de positivité Wnt-11 augmenté dans le groupe ONFH vs contrôle (P < 0,05) (Figure 2d).

miR-410 surexprimé et Wnt-11 sous-exprimé augmentent DMO et BV/TV des rats

Micro-CT : groupe normal : tête fémorale ronde, col uniforme, trabécules continues et régulières. Groupes ONFH, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11 : effondrement progressif de la tête, zone de résorption, col aminci, trabécules brisées. Groupes agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC : aspect intact, pas d'effondrement, pas de résorption évidente, trabécules normales (Figure 3a).

Ostéométrie : vs groupe normal, DMO et BV/TV diminués dans ONFH (P < 0,05). vs agomir-NC et siRNA-NC, DMO et BV/TV augmentés dans agomir-miR-410 et Wnt-11-siRNA (P < 0,05). vs agomir-miR-410+OE-NC, DMO et BV/TV diminués dans agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Figure 3b, c).

Surexpression miR-410 et sous-expression Wnt-11 augmentent DMO du fémur, tête fémorale, colonne, et calcium/phosphore sérique

Radiographie : groupe normal : tête ronde, densité uniforme, structure complète. Groupes ONFH, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt11 : tête amincie, zone de résorption. Groupes agomir-miR-410, Wnt11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC : tête uniforme, épaisseur complète (Figure 4a).

DMO et calcium/phosphore : vs normal, DMO (fémur, tête, colonne) et calcium/phosphore sérique diminués dans ONFH (P < 0,05). vs agomir-NC et siRNA-NC, DMO et calcium/phosphore augmentés dans agomir-miR-410 et Wnt-11-siRNA (P < 0,05). vs agomir-miR-410+OE-NC, DMO et calcium/phosphore diminués dans agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Figure 4b, c).

Silence Wnt-11 et surexpression miR-410 atténuent les lésions tissulaires et inhibent l'apoptose des ostéocytes

HE : groupe normal : trabécules nettes, régulières, serrées ; ostéocytes remplissent les lacunes ; zone calcifiée bien connectée. Groupes ONFH, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11 : trabécules clairsemées, amincies, brisées, structure désordonnée, fragments ; ostéocytes nécrotiques, nombreuses lacunes vides, prolifération de tissu de granulation autour des trabécules nécrotiques. Groupes agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC : aspect intact, pas de résorption, trabécules normales (Figure 5a).

MET : groupe normal : ostéocytes conformes aux lacunes, petit espace, organelles abondantes, noyau ovale, membrane intacte, chromatine non agglomérée, pseudopodes cytoplasmiques connectés aux ostéocytes adjacents. Ostéoblastes à la surface des trabécules, allongés, nombreuses organelles. Groupes ONFH, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11 : nombreux dépôts lipidiques dans cytoplasme ostéoblastes, espace capsule-lacune élargi, bandes brillantes d'œdème entre membrane nucléaire et cytoplasme, margination nucléaire, membrane nucléaire intacte, mitochondries gonflées, réticulum et appareil de Golgi disparus. Groupes agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC : morphologie ostéoblastes normale, agrégation chromatine dans quelques noyaux, pas de gouttelettes lipidiques évidentes, membrane nucléaire intacte (Figure 5b).

TUNEL : vs normal, taux d'apoptose ostéocytes augmenté dans ONFH (P < 0,05). vs agomir-NC et siRNA-NC, taux diminué dans agomir-miR-410 et Wnt-11-siRNA (P < 0,05). vs agomir-miR-410+OE-NC, taux augmenté dans agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Figure 5c, d).

Western blot et RT-qPCR : vs normal, Bcl-2 diminué, Bax augmenté dans ONFH (P < 0,05). vs agomir-NC et siRNA-NC, Bcl-2 augmenté, Bax diminué dans agomir-miR-410 et Wnt-11-siRNA (P < 0,05). vs agomir-miR-410+OE-NC, Bcl-2 diminué, Bax augmenté dans agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Figure 5e-g).

Surexpression miR-410 et sous-expression Wnt-11 augmentent les ostéoblastes et diminuent les ostéoclastes

TRAP : groupe normal : ostéoclastes TRAP+ fusiformes, quelques grands polygones, autour du cervelet osseux. Groupes ONFH, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11 : cellules TRAP+ augmentées, morphologie diverse (grands polygones, polynucléés), résorption osseuse adjacente, lacunes de résorption typiques. Groupes agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC : cellules TRAP+ réduites, forme allongée régulière, rares ostéoclastes polynucléés, structure trabéculaire adjacente relativement complète (Figure 6a).

ALP : groupe normal : ostéoblastes ALP+ petits, ronds, agrégés dans l'espace trabéculaire et sur surface trabécules. Groupes ONFH, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11 : ostéoblastes ALP+ dispersés dans l'espace trabéculaire. Groupes agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC : ostéoblastes ALP+ augmentés, distribués dans l'espace trabéculaire et sur surface trabécules (Figure 6c).

Comptage : vs normal, ostéoblastes/unité de surface diminués, ostéoclastes augmentés dans ONFH (P < 0,05). vs agomir-NC et siRNA-NC, ostéoblastes augmentés, ostéoclastes diminués dans agomir-miR-410 et Wnt-11-siRNA (P < 0,05). vs agomir-miR-410+OE-NC, ostéoblastes diminués, ostéoclastes augmentés dans agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Figure 6b, d).

miR-410 hautement exprimé et Wnt-11 faiblement exprimé augmentent OCN, ALP, BGLAP, Collα1 et diminuent NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, MMP9 chez les rats ONFH

ELISA : vs normal, indices ostéogéniques (ALP, OCN) diminués, indices ostéoclastiques (NTX-1, CTX-1) augmentés dans ONFH (P < 0,05). vs agomir-NC et siRNA-NC, ALP et OCN augmentés, NTX-1 et CTX-1 diminués dans agomir-miR-410 et Wnt-11-siRNA (P < 0,05). vs agomir-miR-410+OE-NC, ALP et OCN diminués, NTX-1 et CTX-1 augmentés dans agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Figure 7a).

Western blot et RT-qPCR : vs normal, ALP, BGLAP, Collα1 diminués ; ACP5, CTSK, MMP9 augmentés dans ONFH (P < 0,05). vs agomir-NC et siRNA-NC, ALP, BGLAP, Collα1 augmentés ; ACP5, CTSK, MMP9 diminués dans agomir-miR-410 et Wnt-11-siRNA (P < 0,05). vs agomir-miR-410+OE-NC, ALP, BGLAP, Collα1 diminués ; ACP5, CTSK, MMP9 augmentés dans agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Figure 7b-d).

Wnt-11 élevé et miR-410 bas dans les tissus ONFH des rats ; Wnt-11 est gène cible de miR-410

Analyse bioinformatique (TargetScan) : site de liaison spécifique entre Wnt-11 3'UTR et miR-410 → Wnt-11 cible de miR-410 (Figure 8a). Test luciférase : vs NC, activité luciférase diminuée avec mimics miR-410 (P < 0,05), pas de différence significative avec mutant 3'UTR (P > 0,05) → miR-410 se lie spécifiquement à Wnt-11 (Figure 8b).

Western blot et RT-qPCR : vs normal, miR-410 diminué, Wnt-11 augmenté dans ONFH (P < 0,05). vs agomir-NC, miR-410 augmenté, Wnt-11 diminué dans agomir-miR-410 (P < 0,05). vs siRNA-NC, Wnt-11 diminué dans Wnt-11-siRNA (P < 0,05). Wnt-11 augmenté dans agomir-miR-410+OE-Wnt-11 vs agomir-miR-410+OE-NC (P < 0,05) (Figure 8c-e).

Immunohistochimie : Wnt-11 cytoplasmique, positif brun/brun-jaune. vs normal, taux positivité augmenté dans ONFH (P < 0,05). vs agomir-NC et siRNA-NC, taux diminué dans agomir-miR-410 et Wnt-11-siRNA (P < 0,05). vs agomir-miR-410+OE-NC, taux augmenté dans agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Figure 8f, g).

Discussion

L'ONFH, maladie de destruction osseuse, résulte d'un défaut d'apport sanguin et de troubles de la coagulation/fibrinolyse, entraînant l'effondrement de la tête fémorale [19]. Des études ont analysé l'expression des miARN dans les cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse induites par hormones chez la souris ONFH [20]. Une étude récente a fourni le profil d'expression des miARN dans les cellules souches mésenchymateuses dérivées de moelle osseuse en ostéogenèse liée à l'ONFH induite par stéroïdes [21]. De plus, des stents Li-nHA/GM/rhEPO activent les voies Wnt et HIF-1/VEGF, favorisant l'ostéogenèse et l'angiogenèse, bénéfiques pour la réparation de l'ONFH induite par glucocorticoïdes [22]. Notre étude visait à explorer les effets de miR-410 dans la prévention de l'ONFH en ciblant Wnt-11.

Nous apportons des preuves substantielles que miR-410, ALP, BGLAP, Collα1 sont diminués et Wnt-11, ACP5, CTSK, MMP9 augmentés dans l'ONFH. Une étude a montré que miR-410 est diminué dans l'ostéosarcome avec effet anti-tumoral [23]. Une autre a trouvé miR-410 réduit dans les tissus de cancer du sein récepteurs aux œstrogènes positifs [24]. Wnt-11 sécrété est augmenté dans plusieurs cancers (colorectal, migration/invasion) [25]. Wnt-11 élevé dans le cancer de la prostate indépendant des hormones [26]. ALP est un index diagnostique et pronostique [27]. OCN (BGLAP) est une molécule conservée liée à la minéralisation de la matrice osseuse [28]. ACP5 nécessaire pour la différenciation ostéoclastique et la résorption, favorise la migration cellulaire via phosphorylation de la kinase d'adhésion [29]. CTSK est une protéase clé dégradant l'ostéopontine, le collagène de type I et autres protéines de la matrice osseuse [30]. Les MMP dégradent la matrice extracellulaire et la membrane basale, influençant l'invasion et la métastase cancéreuses [31]. Nous montrons aussi que Wnt-11 est gène cible de miR-410. Zhang et al. ont trouvé que miR-410 cible le site inféré dans le 3'UTR de Wnt3a pour moduler la voie Wnt [32].

De plus, la surexpression de miR-410 et l'inhibition de Wnt-11 augmentent DMO et BV/TV chez les rats ONFH. Une étude a suggéré une diminution de la DMO vertébrale et une augmentation du ratio DPD/Cr urinaire dans l'ONFH non traumatique [33]. Une autre a vérifié que la DMO de la tête fémorale et des vertèbres lombaires était réduite dans l'ONFH vs contrôle [34]. L'analyse d'imagerie a révélé que la muscone restaure DMO et ratio BV/TV de la tête fémorale nécrosée, l'examen histologique confirmant l'effet protecteur sur l'ONFH induite par l'alcool [35]. Nos données montrent que miR-410 haut et Wnt-11 bas inhibent l'apoptose des ostéocytes. Une étude a démontré que le silence de miR-410 induit la prolifération et réduit l'apoptose des cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines induite par LDL oxydé [36]. La diminution de miR-410 et l'augmentation de SOCS3 réduisent Bcl-2 anti-apoptotique et favorisent l'apoptose [37]. Dans les cellules LNCaP déficientes en androgènes, l'inhibition de Wnt-11 prévient la différenciation neuroendocrine et induit l'apoptose [26]. Notre étude montre aussi que l'inhibition de Wnt-11 et la surexpression de miR-410 augmentent ALP, BGLAP, Collα1 et réduisent ACP5, CTSK, MMP9. L'expression de Wnt-11 dans le cancer du col utérin active la voie Wnt/JNK, phosphoryle JNK-1, favorise prolifération et migration/invasion [15]. Le silence de Wnt-11 dans lignées cancéreuses colorectales réduit l'invasion [25]. La surexpression de miR-410 inhibe invasion, migration, prolifération et transition épithélio-mésenchymateuse de l'ostéosarcome via ciblage direct de TRIM44 [23]. Une étude antérieure a montré que miR-410 inhibe la croissance du cholangiocarcinome dans un modèle xénogreffe en induisant l'apoptose [38].

Conclusion

En résumé, notre investigation révèle que miR-410 est sous-exprimé et Wnt-11 surexprimé dans l'ONFH, et que la surexpression de miR-410 ou l'inhibition de Wnt-11 augmentent les ostéoblastes et réduisent les ostéoclastes, atténuant l'ONFH. Des recherches cliniques supplémentaires sont nécessaires pour évaluer l'efficacité de miR-410 et Wnt-11 dans le traitement de l'ONFH.

Disponibilité des données et matériaux

Non applicable

Historique des modifications

Abréviations

ALP :

Phosphatase alcaline

ANOVA :

Analyse de variance

BMD :

Densité minérale osseuse

EDTA :

Éthylènediaminetétraacétique

ELISA :

Test immunoenzymatique

GAPDH :

Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase

GE :

General Electric

HE :

Hématoxyline-éosine

LSD-t :

Test t de différence significative la plus faible

miR-410 :

MicroARN-410

miARNs :

MicroARNs

NC :

Contrôle négatif

OD :

Densité optique

ONFH :

Ostéonécrose de la tête fémorale

PBS :

Tampon phosphate salin

ROI :

Régions d'intérêt

RT-qPCR :

PCR quantitative à transcription inverse

SD :

Sprague-Dawley

SDS :

Dodécylsulfate de sodium

THR :

Arthroplastie totale de la hanche

TRAP :

Phosphatase acide tartrate-résistante

TUNEL :

Marquage des extrémités d'ADN par la TdT