Optimisation du prétraitement pour sp-ICP-MS : révélation de la distribution des nanoparticules d'argent dans les tissus biologiques

Résumé

La prolifération rapide des nanoparticules conçues (ENP) a accru l'exposition humaine, pourtant les outils analytiques actuels ne peuvent pas quantifier et caractériser simultanément les ENP dans les matrices biologiques. La spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif en mode particule unique (sp-ICP-MS) offre une quantification simultanée et une évaluation des propriétés physiques, mais son application aux tissus est limitée par des protocoles de prétraitement inadéquats qui peuvent altérer l'intégrité des particules ou réduire leur récupération. Dans cette étude, nous avons évalué systématiquement cinq agents solubilisant — hydroxyde de sodium (NaOH), hydroxyde de tétraméthylammonium (TMAH), acide nitrique (HNO₃), acide chlorhydrique (HCl) et protéinase K — en utilisant des nanoparticules d'argent (nAg) comme système modèle. Le traitement NaOH a atteint >90 % de dissolution tissulaire tout en préservant la taille des particules et en minimisant l'ionisation, surperformant les autres réactifs. L'extension du protocole NaOH aux homogénats de cœur, poumon, rate et rein a confirmé son applicabilité large. Finalement, nous avons appliqué le prétraitement optimisé pour évaluer le devenir de nAg versus Ag⁺ administrés par voie intraveineuse dans le sang et le foie de souris. Le sp-ICP-MS a révélé que nAg restait largement particulaire (~80 %) dans le foie mais s'ionisait (~95 %) dans la circulation sanguine, alors qu'Ag⁺ restait ionique dans les deux compartiments. Ces résultats démontrent que le prétraitement NaOH permet une analyse sp-ICP-MS précise des ENP in vivo et soulignent l'importance de la conversion particule-ion dans la détermination de la biodistribution et de la cinétique.

Introduction

Les avancées en nanotechnologie ont accéléré la production de nanoparticules conçues (ENP) inférieures à 100 nm, offrant des avantages uniques tels que la pénétration tissulaire accrue et les surfaces réactives. Les nanoparticules d'argent (nAg) sont largement déployées dans les biens de consommation et les produits pharmaceutiques, prisées pour leur libération soutenue d'Ag⁺ et leurs propriétés conductrices. Cependant, les mêmes attributs nanoscopiques qui confèrent la fonctionnalité peuvent aussi présenter des risques sanitaires, incluant la perturbation de la barrière hémato-encéphalique et des réponses inflammatoires. Compte tenu de l'omniprésence des ENP, une évaluation rigoureuse du danger et de l'exposition — définissant collectivement le risque ENP — reste essentielle.

Bien que de nombreuses recherches se soient concentrées sur la toxicité des ENP, moins d'études ont quantifié les scénarios d'exposition réels. Des travaux récents ont montré des distributions intracellulaires distinctes pour nAg versus Ag⁺ dans les cellules cultivées, soulignant la nécessité de différencier particules et ions dans les tissus. L'ICP-MS conventionnel quantifie le contenu total en métal mais ne peut pas résoudre les espèces particulaires versus ioniques, tandis que le MET fournit des informations de taille mais manque de capacité quantitative. Ainsi, une méthode couplant quantification précise et analyse des propriétés physiques est critique pour élucider la biotransformation des ENP.

Le sp-ICP-MS (Single-particle ICP-MS) peut détecter des particules individuelles, fournissant des estimations de taille à partir de l'intensité des pics et la concentration à partir de la fréquence des pics, tout en distinguant les ions via l'analyse du signal de fond. Des études antérieures ont appliqué le sp-ICP-MS à des échantillons environnementaux et commerciaux, mais son utilisation dans les tissus biologiques a été limitée, largement due à un prétraitement inadéquat qui peut dégrader ou altérer les ENP. Différents réactifs solubilisant varient dans leur capacité à lyser les tissus, récupérer les ENP et préserver l'intégrité des particules. Cette étude évalue et optimise donc les stratégies de prétraitement pour l'analyse sp-ICP-MS de nAg dans les tissus murins, visant à établir un flux de travail fiable pour la quantification simultanée et l'évaluation des propriétés physiques des ENP in vivo.

Matériaux et méthodes

ENP

Les nAg Biopure de 30, 70 et 100 nm (nAg30, nAg70, nAg100) provenaient de nanoComposix (San Diego, CA, USA). RM8013, un standard pour l'étalonnage de l'efficacité de transport, a été obtenu du National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, USA). Toutes les suspensions ENP ont été soniquées 10 min avant utilisation.

Réactifs

Des solutions de 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25 % TMAH, 30 % HCl et protéinase K ont été achetées chez Wako (Osaka, Japon). Une solution HNO₃ 70 % a été obtenue de Kanto Kagaku (Tokyo, Japon).

Animaux

Des souris BALB/c femelles (6 semaines) provenaient de Japan SLC (Shizuoka, Japon). Les souris étaient logées sous cycle lumière/obscurité 12 h avec accès ad libitum à la nourriture et l'eau. Toutes les procédures suivaient les directives éthiques de l'Université d'Osaka, Japon.

Mesure des distributions de taille par diffusion dynamique de la lumière

Les nAg étaient dilués dans l'eau MilliQ à 10 µg mL⁻¹ Ag. Un aliquot de 1 mL était placé dans une cellule capillaire zeta (Malvern Instruments) et analysé sur un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments) pour déterminer le diamètre moyen et le potentiel zêta.

Mesure de la masse totale d'Ag

Les concentrations totales d'Ag étaient mesurées sur un ICP-MS Agilent 7700x (Agilent Technologies). Conditions : puissance RF 1550 W, débit Ar 1,05 L min⁻¹, temps de résidence 100 ms. Le rhodium servait de standard interne. Mesures en triplicat.

Analyse sp-ICP-MS et calculs

L'analyse sp-ICP-MS utilisait le même instrument avec puissance RF 1550 W, débit Ar 1,05 L min⁻¹, temps de résidence 10 ms, et temps d'exécution total 30 s. Les calculs de taille de particule employaient l'outil single-particle développé par RIKILT.

Concentration critique de particules pour sp-ICP-MS

Des solutions mères nAg (1,0 mg mL⁻¹) étaient diluées sériellement pour produire des solutions 2000, 800, 700 et 600 pg mL⁻¹, diluées ensuite dix fois pour générer 40 concentrations distinctes pour l'évaluation sp-ICP-MS.

Optimisation des méthodes de prétraitement pour foie de souris

Des homogénats de foie étaient préparés en mélangeant le tissu avec du tampon phosphate salin (PBS, p/v = 1:10) et homogénéisés. Chaque homogénat était spiké avec 100 ng mL⁻¹ nAg puis traité avec l'un des réactifs suivants au ratio 1:1 v/v : 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25 % TMAH, 30 % HCl, ou protéinase K (10 U mL⁻¹ dans 0,01 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,5 % SDS). Les échantillons étaient incubés 3 h à 37 °C, les résidus collectés, pesés, et les surnageants dilués 500 fois pour sp-ICP-MS.

Évaluation de la polyvalence du prétraitement NaOH dans divers organes

Les tissus cœur, poumon, rate et rein étaient homogénéisés dans PBS (p/v = 1:10) et spikés avec 100 ng mL⁻¹ nAg. Une solution NaOH 1 mol L⁻¹ était ajoutée au ratio 1:1 v/v, et les échantillons incubés 3 h à 37 °C. Les résidus étaient pesés, et les surnageants dilués 500 fois pour sp-ICP-MS.

Évaluation de la quantité et propriétés physiques de nAg₁₀₀ et Ag⁺ chez la souris après administration intraveineuse unique

nAg₁₀₀ et AgNO₃ étaient dilués à 0,25 mg mL⁻¹ (Ag⁺) dans du glucose 5 %. Les souris recevaient des injections intraveineuses de nAg₁₀₀ (1,5 ou 0,75 mg kg⁻¹), AgNO₃ (1,5 ou 0,75 mg kg⁻¹ en Ag⁺), ou glucose 5 % (témoin). Vingt-quatre heures post-injection, des échantillons de sang et foie étaient collectés. Les homogénats de foie étaient préparés dans PBS (p/v = 1:10) puis traités avec TMAH ou NaOH (1:1 v/v) pour analyse ICP-MS et sp-ICP-MS.

Résultats et discussions

Optimisation de la détection des particules par sp-ICP-MS

Un sp-ICP-MS précis requiert qu'aucune plus d'une particule n'entre dans le plasma pendant chaque temps de résidence ; sinon, plusieurs particules sont erronément additionnées comme un seul événement, gonflant les estimations de taille. Nous avons dilué sériellement nAg₁₀₀ et tracé les comptages détectés versus théoriques. Alors que les faibles concentrations produisaient une relation linéaire, les concentrations plus élevées donnaient moins d'événements détectés qu'attendu, indiquant une interférence multi-particules. La soustraction des comptages détectés aux théoriques révélait que les écarts devenaient significatifs lorsque les événements détectés dépassaient 500, établissant un seuil pratique pour une analyse fiable.

La validation avec nAg de diamètres variés confirmait que les réglages sp-ICP-MS donnaient des estimations de taille précises : diamètres mesurés de 30,0 ± 1,2 nm, 65,1 ± 0,6 nm et 97,4 ± 0,6 nm pour nAg30, nAg70 et nAg100 respectivement. Les mesures par diffusion dynamique de la lumière (DLS) (36,4 ± 1,6 nm, 70,6 ± 1,7 nm, 101 ± 1,0 nm) correspondaient étroitement aux résultats sp-ICP-MS, validant le protocole analytique.

Optimisation des méthodes de prétraitement pour détecter nAg dans le tissu hépatique murin

Un prétraitement efficace doit lyser le tissu, récupérer les ENP sans altérer leur état physique ou chimique, et éviter l'ionisation ou l'agrégation. Nous avons comparé cinq agents solubilisant — NaOH, TMAH, HNO₃, HCl et protéinase K — en utilisant des homogénats de foie spikés avec 100 ng mL⁻¹ nAg.

L'analyse des résidus révélait que NaOH, TMAH et protéinase K dissoudaient >90 % de la matrice hépatique, tandis que HNO₃ et HCl ne dissoudaient que ~75 %. Étant donné que ~80 % du tissu est de l'eau, la dissolution plus faible par les réactifs acides indique une élimination incomplète de la matrice.

Les données de récupération sp-ICP-MS montraient que les traitements acides ionisaient complètement les nAg, tandis que la protéinase K les ionisait partiellement. En revanche, NaOH et TMAH préservaient les nAg comme particules intactes avec une détection ionique négligeable. L'analyse de distribution de taille indiquait que le traitement TMAH causait un décalage de 100 nm à 120 nm et élargissait la distribution, suggérant une agrégation. Le traitement NaOH maintenait la taille originale de 100 nm, confirmant sa pertinence.

La tendance du TMAH à augmenter la constante diélectrique par décomposition en triméthylamine et méthanol peut diminuer le potentiel zêta des nAg, favorisant l'agrégation. Une exposition courte (1 min) au TMAH préservait cependant la taille des particules (~100 nm), confirmant que le traitement prolongé est responsable de l'agrégation.

Évaluation de la polyvalence du prétraitement NaOH dans divers organes

Pour confirmer l'applicabilité large du NaOH, nous avons appliqué le protocole aux homogénats de cœur, poumon, rate et rein spikés avec nAg. L'analyse des résidus montrait >95 % de dissolution. Le sp-ICP-MS détectait l'Ag ajouté comme particules dans tous les tissus, avec des taux de récupération dans la fourchette 80–120 % acceptable selon les normes FDA. Les diamètres des particules restaient proches de 100 nm dans tous les organes, soulignant la cohérence de la méthode.

Ces données confirment collectivement que le prétraitement NaOH fournit une plateforme robuste et reproductible pour quantifier et caractériser les nAg dans divers tissus animaux via sp-ICP-MS.

Évaluation du sp-ICP-MS pour analyses quantitatives et de propriétés physiques de nAg et Ag⁺ dans les tissus biologiques

Pour démontrer la pertinence pratique, nous avons comparé le devenir de nAg₁₀₀ versus Ag⁺ administrés par voie intraveineuse dans le sang et le foie de souris. L'ICP-MS confirmait la présence d'Ag dans les deux compartiments pour les deux traitements. Cependant, le sp-ICP-MS révélait une spéciation distincte : dans le sang, l'Ag existait predominantly sous forme ionique (>95 %) quelle que soit la forme administrée, tandis que dans le foie, ~80 % de l'Ag provenant de nAg₁₀₀ restait sous forme particulaire, avec une présence particulaire minime après administration d'Ag⁺. L'analyse de taille des particules de nAg₁₀₀ hépatiques montrait un diamètre moyen de ~80 nm, plus petit que les 100 nm administrés, reflétant une ionisation partielle et une possible transformation dans le tissu hépatique.

Conclusions

Nous avons établi un protocole de prétraitement NaOH optimisé qui permet une analyse sp-ICP-MS précise des nanoparticules d'argent dans les tissus murins, fournissant une quantification simultanée et une caractérisation de la taille des particules. L'application de ce flux de travail à nAg₁₀₀ et Ag⁺ administrés par voie intraveineuse a révélé que nAg s'ionise partiellement in vivo, avec ~80 % restant particulaire dans le foie et ~95 % ionisé dans la circulation sanguine. Ces résultats soulignent l'importance de tenir compte de la conversion particule-ion lors de l'évaluation de la biodistribution et de la cinétique des ENP. La méthode est largement applicable à divers tissus et peut être employée dans les études d'évaluation des risques pour élucider la dynamique d'exposition et les réponses biologiques aux ENP.

Disponibilité des données et matériaux

Le partage de données n'est pas applicable à cet article car aucun ensemble de données n'a été généré ou analysé lors de l'étude actuelle.

Abréviations

Ag

Argent

Ag⁺

Ion argent

DLS

Diffusion dynamique de la lumière (Dynamic light scattering)

ENP

Nanoparticules conçues (Engineered nanoparticles)

HCl

Acide chlorhydrique

HNO₃

Acide nitrique

ICP-MS

Spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (Inductively coupled plasma-mass spectrometry)

nAg

Nanoparticules d'argent (Silver nanoparticles)

nAg₁₀₀

nAg 100 nm

nAg₃₀

nAg 30 nm

nAg₇₀

nAg 70 nm

NaOH

Hydroxyde de sodium

PBS

Tampon phosphate salin (Phosphate-buffered saline)

sp-ICP-MS

ICP-MS à particule unique (Single particle ICP-MS)

TEM

Microscope électronique à transmission (Transmission electron microscope)

TMAH

Hydroxyde de tétraméthylammonium (Tetramethylammonium hydroxide)