Nanoclusters d'or fluorescents fonctionnalisés par néoglycoprotéine pour détection de lectines végétales et imagerie de cellules dendritiques

Résumé

Les interactions glucide-protéine sous-tendent des processus biologiques essentiels tels que la fécondation, la transduction de signal et la communication hôte-pathogène. La nature complexe de la reconnaissance des glycans exige des outils analytiques avancés. Nous rapportons ici la première synthèse de nanoclusters d'or fluorescents fonctionnalisés par néoglycoprotéine (G0-OVA-AuNCs) combinant un N-glycane biantenné (G0) comme ligand de ciblage, l'ovalbumine comme protéine porteuse, et un cœur d'or auto-émissif. Nous démontrons que les G0-OVA-AuNCs servent de capteurs sélectifs pour les lectines végétales et de sondes d'imagerie puissantes pour les cellules dendritiques murines.

Introduction

Les nanoclusters d'or (AuNCs), comprenant 10-100 atomes d'or, présentent une fluorescence dépendante de la taille qui les rend attractifs pour le biosensing et l'imagerie. Contrairement aux colorants organiques conventionnels ou aux points quantiques, les AuNCs possèdent un grand décalage de Stokes, une émission rouge à proche IR, et une stabilité photochimique supérieure, permettant des applications dans la fenêtre de transparence des tissus. Les AuNCs templatés par protéines ont été rapportés pour la première fois avec l'albumine sérique bovine en 2009 et sont devenus depuis une plateforme polyvalente pour concevoir des fluorophores biocompatibles et solubles dans l'eau. Les protéines glycosylées, cependant, restent sous-explorées comme échafaudages de nanoclusters, malgré le rôle critique des glycans dans la modulation du repliement des protéines, de la stabilité et de la liaison aux récepteurs. Les néoglycoprotéines synthétiques — protéines chimiquement conjuguées avec des glucides définis — offrent une stratégie pour conférer aux protéines de nouvelles propriétés fonctionnelles tout en préservant leur intégrité structurelle.

Dans cette étude, nous avons exploité un glycane biantenné G0 synthétique, conjugué à l'ovalbumine (OVA) via un lien amino C5 et le disuccinimidyl subérate, pour générer des G0-OVA-AuNCs. Nous avons étudié leurs caractéristiques physico-chimiques, évalué l'accessibilité des glycans par des essais d'agglutination par lectines, et évalué leur capacité à marquer les cellules dendritiques (DC) in vitro. Les résultats établissent les G0-OVA-AuNCs comme des capteurs de lectines robustes et multivalents et des agents d'imagerie puissants pour les cellules immunitaires.

Résultats et discussion

Nous avons optimisé la synthèse des G0-OVA-AuNCs en adaptant un protocole pour les OVA-AuNCs non conjugués. Une solution d'OVA à 15 mg mL⁻¹ a été mélangée avec HAuCl₄·3H₂O (4,2 mM) et NaOH (150 mM) sous irradiation micro-ondes (100 °C, 6 min), produisant des clusters brun pâle qui émettent une fluorescence rouge brillante à 670 nm sous excitation à 350 nm. Les spectres UV-Vis n'ont pas de bande de résonance plasmonique, confirmant des tailles de particules inférieures à 5 nm ; le MET a révélé un diamètre de cœur moyen de 1,9 ± 0,7 nm, et la diffusion dynamique de la lumière a montré un diamètre hydrodynamique de 8,7 ± 2,5 nm, cohérent avec une seule protéine encapsulant le cœur. Les clusters présentaient un rendement quantique de ~4 % et restaient photostables sur pH 3-11 et dans le sérum fœtal bovin, indiquant leur adéquation pour les essais biologiques.

Pour les clusters fonctionnalisés G0, les glycans G0 ont été conjugués à l'OVA en utilisant DSS, produisant des néoglycoprotéines avec 2-3, 3-4, ou 5-6 glycans par protéine (vérifié par SDS-PAGE et MALDI-TOF). La formation subséquente d'AuNC sous conditions identiques a produit des G0-OVA-AuNCs dont les propriétés optiques correspondaient à celles des OVA-AuNCs : absorbance à 278 nm et pic d'émission à 670 nm. Le MET a confirmé un diamètre de cœur de 1,6 ± 0,5 nm. Les spectres CD indiquaient une structure secondaire en bobine aléatoire, probablement due à la synthèse alcaline, pourtant les moieties glycanes restaient accessibles pour la liaison aux lectines.

Les essais d'agglutination par lectines avec la lectine-II de Bandeiraea simplicifolia (BSL-II) et la lectine de Solanum tuberosum (STL) ont révélé un quenching de fluorescence dépendant de la concentration pour les G0-OVA-AuNCs (5/6), tandis qu'une lectine contrôle (Aleuria aurantia, AAL) n'a produit aucun effet. Le quenching suivait des courbes d'étalonnage linéaires, donnant des limites de détection de 2,83 µM (BSL-II) et 2,35 µM (STL). Les G0-OVA-AuNCs portant moins de glycans (2/3) n'ont pas agglutiné, soulignant la nécessité d'une présentation multivalente des glycans. L'électrophorèse sur gel d'agarose en milieux de culture cellulaire a confirmé que la liaison aux lectines restait efficace dans des environnements biologiques complexes.

La microscopie confocale de cellules dendritiques spléniques murines (CD11c⁺) incubées avec G0-OVA-AuNCs (3/4) a démontré une internalisation rapide en 40 min, avec fluorescence localisée intracellulairement et absente dans les contrôles non traités. Les reconstructions 3D ont confirmé la distribution intracellulaire des clusters.

En résumé, nous présentons les premiers AuNCs protégés par néoglycoprotéine, démontrons leur reconnaissance sélective de lectines via des glycans multivalents, et établissons leur capacité à imager les cellules dendritiques. Leur fluorescence robuste, solubilité aqueuse et stabilité de pH en font des alternatives prometteuses aux colorants conventionnels pour les études d'interactions glucide-protéine et l'imagerie immunologique.

Conclusions

Nous avons synthétisé et caractérisé avec succès les G0-OVA-AuNCs, confirmant l'accessibilité des glycans et l'agglutination spécifique aux lectines. L'affichage multivalent des glycans était essentiel pour le réticulation efficace, tandis que les clusters maintenaient une photostabilité et une solubilité aqueuse élevées. L'imagerie in vitro de cellules dendritiques murines a validé les clusters comme sondes auto-fluorescentes puissantes. Ces résultats soutiennent l'exploration future des AuNCs fonctionnalisés par néoglycoprotéine comme outils polyvalents pour les essais d'interactions glucide-protéine, l'imagerie de cellules immunitaires, et les applications thérapeutiques potentielles.

Méthodes/Expérimental

Matériaux

Toutes les solutions ont été préparées dans de l'eau ultrapure (18 MΩ cm). Chlorure d'or (III) trihydraté, NaOH, et triéthylamine provenaient de Sigma-Aldrich. L'ovalbumine a été achetée chez Hyglos. DSS et DMSO provenaient de Thermo Fisher. Le glycane G0 a été synthétisé comme décrit précédemment.

Synthèse des AuNCs. Procédure générale

15 mg mL⁻¹ de protéine dans l'eau ultrapure a été mélangé avec 4,2 mM HAuCl₄·3H₂O, agité 5 min, puis 150 mM NaOH a été ajouté. Le mélange a été chauffé à 100 °C pendant 6 min dans un réacteur micro-ondes. Les clusters ont été dialysés (COPM 10 kDa) contre l'eau ultrapure. La fluorescence a été enregistrée sur un lecteur de plaques Varioskan Flash (λₑₓ=350 nm). Gel d'agarose (0,75 %) et MET (200 kV) ont été utilisés pour la caractérisation de taille. Le CD a évalué la structure secondaire. Le XPS a déterminé les états d'oxydation de l'or.

Essai d'agglutination par lectines

G0-OVA-AuNCs (0,2 mg mL⁻¹) ont été mélangés avec des lectines (AAL, STL, BSL-II) à 0-10 µM dans le tampon TSM. Après incubation overnight, les échantillons ont été centrifugés et la fluorescence du surnageant mesurée. La précipitation a été observée sous UV pour STL.

Isolation des DC spléniques de souris

Les rates de souris C57BL/6J ont été traitées pour obtenir des suspensions monocellulaires. Les cellules CD11c⁺ ont été isolées par tri cellulaire activé magnétiquement (Miltenyi) et cultivées sur des lamelles revêtues de poly-D-lysine.

Absorption des G0-OVA-AuNCs par les DC

DCs (2 × 10⁶ cellules) ont été incubées avec 150 µg mL⁻¹ G0-OVA-AuNCs (3/4) pendant 40 min à 37 °C, lavées, fixées avec 3 % PFA, et imagées sur un microscope confocal Zeiss LSM 510 (laser 365 nm, objectif huile 63×).