Nanoclusters d'or de néoglycoprotéines fluorescentes :synthèse et applications dans la détection de lectines végétales et l'imagerie cellulaire

Introduction

Les nanoclusters d'or (AuNCs) formés de dix à cent atomes d'or ont attiré l'attention de la communauté scientifique en raison de leurs propriétés chimiques et physiques attrayantes [1]. Plus petits que 3 nm, les nanoclusters d'or approchent la longueur d'onde de Fermi des électrons, donnant lieu à une émission de fluorescence dépendante de la taille et offrant des opportunités en tant que sondes de détection et d'imagerie pour les applications in vitro et in vivo [2,3,4]. Les tests de fluorescence actuels impliquent principalement des colorants organiques, tels que la rhodamine ou la fluorescéine, ou plus rarement des points quantiques [5,6,7]. Cependant, en raison de la faible stabilité photochimique, de la fluorescence sensible au pH ou de la faible solubilité dans l'eau de certains colorants organiques et de la toxicité des points quantiques, leur utilisation peut être compromise [8]. Dans ce contexte, les nanoclusters d'or peuvent être considérés comme des fluorophores ultra-petits alternatifs, sans les limitations mentionnées ci-dessus. De plus, les AuNC sont caractérisées par un grand décalage de Stokes et une longueur d'onde d'émission de fluorescence du rouge visible à la région proche infrarouge (IR) qui est très favorable en bio-imagerie car elle chevauche la fenêtre de transparence des tissus [8,9,10].

La synthèse assistée par protéines de nanoclusters d'or a été signalée pour la première fois en 2009 à l'aide d'albumine sérique bovine (BSA) [11] et depuis lors, les nanoclusters hydrosolubles protégés par des protéines sont devenus une tendance émergente en nanoscience [9, 12, 13]. Beaucoup moins d'attention a été accordée aux glycoprotéines [14] pour la préparation des AuNCs et nous ne connaissons aucun rapport décrivant la formation d'AuNCs à partir de néoglycoprotéines synthétiques comme échafaudages. En général, la glycosylation module les propriétés physico-chimiques des glycoprotéines, par exemple le repliement, la durée de vie circulatoire ou la stabilité. Elle affecte également d'importantes fonctions biologiques des protéines, telles que la reconnaissance récepteur-ligand. Ainsi, la génération de néoglycoprotéines synthétiques à partir de protéines, par la fixation chimique d'hydrates de carbone soigneusement conçus et caractérisés [15], peut les doter de nouvelles propriétés fonctionnelles pour des applications biologiques. Comme les glucides participent à un grand nombre de processus biologiques différents par le biais de l'interaction avec les protéines de liaison aux glucides [16, 17], nous envisageons les nanoclusters d'or de néoglycoprotéines comme de nouvelles sondes pour étudier et exploiter les événements de reconnaissance des glucides à la fois in vitro et in vivo [18]. À cet égard, la présence de plusieurs copies de glycane à la surface de la protéine fournit une présentation polyvalente des glucides avec l'amélioration subséquente de l'affinité de liaison.

Ici, nous explorons l'utilisation d'AuNCs fonctionnalisés par des néoglycoprotéines auto-fluorescentes comme sondes de détection pour les lectines végétales et comme réactifs de ciblage des récepteurs de lectines pour l'imagerie in vitro des cellules dendritiques (CD). Les lectines sont des protéines de liaison aux glucides qui aident à différents phénomènes de reconnaissance biologique. Chez les plantes supérieures, par exemple, les lectines empêchent les organismes phytophages de reconnaître et d'agglutiner des glycoprotéines étrangères, inhibant leur croissance et leur multiplication [19]. Dans les DC de mammifères, en revanche, les récepteurs de lectine de type C (CLR) s'expriment à la surface cellulaire et jouent un rôle majeur dans la reconnaissance des agents pathogènes [20]. Les antigènes décorés de glycane sont reconnus par des CLR spécifiques, pour être ensuite endocytosés, traités et finalement présentés aux cellules T induisant des réponses immunitaires spécifiques. Dans notre étude précédente, nous avons montré [21] que la fonctionnalisation d'un antigène modèle, l'ovalbumine (OVA), avec un GlcNAc synthétique biantennaire terminant le N-glycane G0 améliore le ciblage vers les CD et l'absorption et la présentation ultérieures de l'antigène. Nous avons postulé que le phénomène mentionné ci-dessus est initié par l'interaction du glycane G0 et des récepteurs endocytiques de lectine de type C exprimés à la surface des CD. Par conséquent, nous pensons que les nanoclusters d'or G0-OVA fluorescents et multivalents pourraient devenir une alternative au G0-OVA marqué par fluorescence appliqué dans notre étude précédente et pourraient être utilisés comme un nouvel outil pour la visualisation DC. De plus, le ciblage des CD médié par les glycanes qui permet l'initiation de fortes réponses immunitaires des lymphocytes T pourrait être utilisé pour améliorer l'efficacité des candidats vaccins [22,23,24]. Dans cette première étude, nous présenterons la synthèse de nanoclusters d'or à partir de néoglycoprotéines et l'évaluation de la fonctionnalité et de l'accessibilité des glycanes G0 à l'aide d'expériences d'agglutination de lectines. Enfin, nous démontrerons le potentiel des nanoclusters d'or fluorescent pour l'imagerie des cellules dendritiques.

Résultats et discussion

Nous avons optimisé la synthèse de nanoclusters d'or d'ovalbumine décorés avec le glycane G0 (G0-OVA-AuNCs) sur la base de rapports antérieurs utilisant la protéine OVA non conjuguée [25, 26]. Les AuNC protégées par des protéines ont été préparées par l'ajout d'acide tétrachloroaurique (III) d'or (HAuCl₄ ^. 3H₂ O) à une solution de protéines, suivie d'une solution aqueuse 1 M d'hydroxyde de sodium. Une augmentation du pH de la réaction augmente le potentiel de réduction des résidus tryptophane et tyrosine présents dans l'OVA (Fig. 1a) [14]. L'échafaudage protéique agit à la fois comme réactif réducteur et stabilisant, emprisonnant le petit amas d'or à l'intérieur de la structure de la protéine et l'isolant de l'environnement. Un protocole précédent pour la synthèse d'OVA-AuNCs fluorescents nécessitait une solution d'OVA très fortement concentrée (jusqu'à 65 mg mL ⁻¹ ) [25]. Pour limiter l'utilisation de précieux néoglycoconjugués d'OVA pour la préparation des AuNC, nous avons déterminé la quantité minimale d'OVA non conjuguée qui pourrait produire efficacement des OVA-AuNC. Nous avons constaté qu'une concentration d'OVA de 15 mg mL ⁻¹ était suffisant pour produire des clusters avec une forte émission de fluorescence (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). La formation d'OVA-AuNCs a été significativement accélérée par l'irradiation par micro-ondes réduisant le temps de réaction de 18 h à 6 min [25]. De plus, l'irradiation par micro-ondes a fourni un chauffage homogène à la solution favorisant la formation d'amas uniformes et monodispersés [1]. Les OVA-AuNC préparés de cette manière présentent une couleur brun pâle et émettent une forte fluorescence rouge sous un éclairage UV (Fig. 1b). Le spectre UV-Vis des OVA-AuNC n'a pas l'absorbance correspondant à une bande de résonance plasmonique de surface localisée suggérant l'absence de nanoparticules d'or supérieures à 5 nm [27], ce qui a été confirmé par la microscopie électronique à transmission (MET). Nous avons mesuré un diamètre moyen de la carotte d'or OVA-AuNCs dans une plage de 1,9 ± 0,7 nm (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). Enfin, la taille hydrodynamique moyenne des OVA-AuNC de 8,7 nm ± 2,5 nm a été attribuée par diffusion dynamique de la lumière (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). Sa gamme de taille similaire à celle de l'OVA (diamètre de 6,5 à 7 nm [28]) suggère la présence d'une seule molécule de protéine par noyau d'or. Une analyse plus approfondie des OVA-AuNCs par électrophorèse sur gel d'agarose a montré une mobilité similaire pour les OVA et les OVA-AuNCs vers une électrode positive qui confirme en outre la taille similaire pour les deux espèces et leur charge négative à pH neutre (Fig. 1c). Le spectre d'émission de fluorescence des OVA-AuNCs montre un pic d'émission maximal à λ 670 nm lors de l'excitation à 350 nm (Fig. 1d). Le spectre d'excitation des AuNC est large et le décalage de Stokes important (au-dessus de 200 nm), ce qui est idéal pour les applications de détection spectrale multicolore en présence d'une autre sonde fluorescente (multiplexage) caractérisée par une longueur d'onde d'excitation similaire, telle que le colorant Alexa Fluor® 405 émettant du bleu [26]. Le rendement quantique (QY) des OVA-AuNCs a été calculé comme étant 4 % lorsque la fluorescéine dans 0,1 M NaOH (QY  = ≈  92 %) était utilisée comme étalon de référence [29]. L'état d'oxydation du noyau d'or a été attribué à un mélange d'espèces Au(I) et Au(0) sur la base de mesures de spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3) [11, 30]. L'étude du dichroïsme circulaire (CD) de la structure secondaire des protéines a révélé une organisation de bobines aléatoires suggérant une perte du pli natif pour l'OVA dans les AuNCs probablement due à des conditions alcalines difficiles pendant la synthèse (Fichier supplémentaire 1 :Figure S4) [31]. Enfin, nous avons également observé une stabilité extraordinaire des OVA-AuNCs dans une large gamme de pH (3-11) ainsi que dans une solution contenant du sérum de veau fœtal (FBS), le supplément de sérum le plus couramment utilisé pour la culture cellulaire in vitro. (Fichier supplémentaire 1 :Figure S5). Cette caractéristique des nanoclusters d'or OVA met en évidence leur utilité pour les essais biologiques in vitro et in vivo et ouvre de nouvelles applications passionnantes. Par exemple, l'émission de fluorescence insensible au pH des OVA-AuNCs pourrait permettre un suivi efficace des particules à l'intérieur de la cellule sans perte de signal même à l'intérieur des compartiments endosomaux, caractérisés par un pH légèrement acide [32, 33]. Au contraire, dans ces conditions, l'utilisation de certains conjugués de fluorescéine peut être compromise, car l'émission de fluorescence maximale de ces colorants est atteinte au pH basique. Les OVA-AuNCs ont également montré une excellente solubilité à la fois dans l'eau et dans le milieu de croissance cellulaire. Une solubilisation complète des OVA-AuNCs a été observée jusqu'à une concentration de 40 mg/mL à la fois dans l'eau et dans le milieu de croissance cellulaire. (Fichier supplémentaire 1 :Figure S6). Les spectres d'émission de fluorescence à différentes dilutions d'OVA-AuNCs ont été mesurés et sondés pour être stables sous incubation à 37 °C jusqu'à 24 h.

un Représentation schématique de la synthèse OVA-AuNCs. b Spectres UV-visible des OVA (ligne bleue) et OVA-AuNCs (ligne orange). Insérer :images d'OVA-AuNCs (a ) et OVA (b ) sous un éclairage en lumière visible (à gauche) et sous un éclairage en lumière UV (365 nm) (à droite). c Électrophorèse sur gel d'agarose de l'OVA (coloré au bleu de Coomassie G-250) et de l'OVA-AuNC (sous éclairage UV). d Spectres d'excitation de fluorescence (ligne verte) et d'émission (ligne rose) des OVA-AuNCs

Pour la synthèse des AuNCs protégées par les néoglycoprotéines G0-OVA, nous avons initialement préparé des néoglycoprotéines OVA fonctionnalisées G0. Le N-glycane biantennaire G0 équipé d'un lieur aminé C5 a été synthétisé comme décrit précédemment [34] et la conjugaison avec l'OVA a été réalisée en utilisant le disuccinimidyl subérate ester (DSS) comme réactif de réticulation (Fig. 2a) [21, 35]. En bref, la conjugaison est réalisée dans une réaction en deux étapes :le N-glycane G0 est fonctionnalisé avec un excès de 13 fois de linker DSS puis couplé à des groupes aminés libres sur OVA. En contrôlant le rapport glycane/protéine, nous avons pu ajuster efficacement le degré de substitution OVA (voir SI). La formation réussie de néoglycoprotéines a été vérifiée par l'apparition d'une bande diffuse de migration électrophorétiquement plus lente sur le gel SDS-PAGE (Fig. 2b), tandis que le nombre moyen de glycanes introduits a été en outre déterminé par spectrométrie de masse MALDI-TOF [21] (Fig. .2c). Suite à cette stratégie, nous avons produit des néoglycoconjugués OVA affichant 2 à 3, 3 à 4 et 5 à 6 copies de N-glycane G0 par protéine.

un Synthèse des néoglycoconjugués G0-OVA (n =valence). b Electrophorèse sur gel SDS-PAGE des néoglycoprotéines OVA et G0-OVA contenant différentes valences de N-glycane G0. c Spectres de masse MALDI-TOF des néoglycoprotéines OVA et G0-OVA contenant différentes valences de N-glycane G0

Ensuite, nous avons utilisé les néoglycoprotéines synthétiques dans la préparation des AuNCs (Fig. 3a) dans des conditions précédemment optimisées et avons étudié l'effet de la fonctionnalisation du glycane et de sa valence sur les propriétés physiques et optiques des clusters. Comme le montre la figure 3, l'absorption UV-Vis et l'émission de fluorescence des G0-OVA-AuNC étaient identiques à celles des OVA-AuNC avec une absorbance caractéristique à 278 nm et une émission de fluorescence rouge avec un maximum autour de 670 nm (Fig. 3b, c).

un Représentation schématique de la synthèse des OVA-AuNC dérivés des glycanes G0. b Spectres d'émission de fluorescence des G0-OVA-AuNCs (lignes bleue, orange et verte) par rapport aux OVA-AuNCs (ligne rose). c Spectres UV-visible de G0-OVA-AuNC (lignes bleue, orange et verte) et OVA-AuNC (ligne rose)

De plus, par des mesures MET, nous avons établi un diamètre moyen de 1,6 ± 0,5 nm (Fig. 4) pour le noyau G0-OVA-AuNCs, ce qui est comparable à la taille des OVA-AuNCs (1,9 ± 0,7 nm). Ainsi, sur la base de nos résultats, nous pensons que les glycanes conjugués à l'OVA par les résidus de lysine ou l'extrémité N-terminale n'affectent pas le potentiel réducteur global des glycoprotéines et la formation ultérieure d'agrégats aux valences testées [36]. De plus, les sucres ne semblent pas entraver la formation de polymères de thiolate d'Au (I) stabilisant les grappes [37, 38] entre les groupes cystéine de la protéine et le noyau d'or, même lorsqu'ils sont présents en nombre plus élevé (5 à 6 copies).

Image MET de G0-OVA-AuNCs (3/4). Insérer :distribution granulométrique du diamètre du noyau d'or des G0-OVA-AuNC (3/4)

Enfin, de la même manière que les OVA-AuNCs, la structure secondaire de la protéine G0-OVA-AuNCs (3/4) a été attribuée par CD et a révélé une organisation de bobine aléatoire (Fichier supplémentaire 1 :Figure S4). Cependant, par la fixation de glycanes à l'échafaudage protéique des AuNC, nous introduisons des molécules de ciblage permettant une interaction avec des protéines de liaison aux glucides et en même temps, une protéine OVA ne reste qu'un support dont les changements de conformation n'altèreront pas la reconnaissance par la lectine de la l'ensemble du système. La capacité antigénique de l'OVA dénaturée dans la production d'anticorps chez la souris [39] et dans l'activation des cellules T a été décrite. L'activation des cellules T est indépendante de la structure secondaire de l'antigène car elle est médiée par la reconnaissance de certaines séquences d'acides aminés qui sont présentées à la fois dans les OVA natives et dénaturées [40]. En fait, le peptide antigénique OVA 323-339 représente la principale réponse spécifique des lymphocytes T à l'OVA et ce peptide a été utilisé dans des nanoparticules pour induire des réponses immunitaires [41].

Pour étudier la fonctionnalité des chaînes glycanes nouvellement introduites sur des nanoclusters d'or protégés par des néoglycoprotéines, nous avons examiné leur interaction avec différentes lectines végétales dans des expériences d'agglutination. Nous avons effectué des incubations de G0-OVA-AuNCs et OVA-AuNCs avec deux lectines végétales différentes, Bandeiraea simplicifolia lectine-II (BSL-II) spécifique des fractions GlcNAc terminales et Solanum tuberosum lectine (STL), reconnaissant le noyau chitobiose présent dans les N-glycanes [34, 42]. De plus et pour éliminer toute interaction non spécifique entre les G0-OVA-AuNC et les lectines, Aleuria aurantia la lectine (AAL) spécifique du L-fucose a été incluse comme contrôle. Nous avons ajouté des concentrations croissantes de lectines BSL-II, STL et AAL à une solution de G0-OVA-AuNCs (5/6). Après incubation à l'obscurité, les solutions ont été centrifugées et la fluorescence du surnageant a été mesurée. Comme démontré sur la Fig. 5, nous avons pu observer une diminution de l'intensité de fluorescence d'une manière dépendante de la concentration après incubation avec BSL-II et STL (Fig. 5a–d), tandis que l'intensité de fluorescence est restée inchangée en présence d'AAL (Fig. 5e). Après l'incubation de G0-OVA-AuNCs (5/6) avec STL, un précipité visible sous irradiation de lampe UV a été observé, alors qu'aucune précipitation n'est apparue lors de l'incubation avec AAL (Fig. 5f). La relation des valeurs de fluorescence initiales (F0) avec les valeurs finales (F) après incubation de la lectine a été représentée en fonction des concentrations croissantes de lectines (Fig. 5b, d). L'interaction STL avec G0-OVA-AuNCs (5/6) a montré une linéarité de 0 à 7,5 μM et la limite de détection a été calculée sur la base de l'équation SD*3/S (où SD est l'écart type de la courbe d'étalonnage et S est la valeur de la pente) [12, 13] à 2,35 μM (y = 1.95x + 0.4266, R ² = 0.97). De la même manière, l'interaction BSL-II avec G0-OVA-AuNCs (5/6) a montré une linéarité de 0 à 10 μM et la limite de détection (LOD) a été calculée à 2,83 μM (y = 0,5687x + 0,5838, R ² = 0.965). Fait intéressant, les grappes contenant un nombre inférieur de sucres conjugués comme G0-OVA-AuNCs (2/3) (Fichier supplémentaire 1 :Figure S7, AB) n'ont montré aucun changement significatif dans l'intensité de fluorescence lors de l'ajout de BSL-II et STL, indiquant manque d'agglutination. Ce comportement met en évidence un effet important de la présentation multivalente des glycanes sur l'activité de réticulation des lectines, même lorsque seules de petites différences de densité de glycanes sont appliquées. Il est important de noter qu'aucun changement dans l'intensité d'émission de fluorescence des OVA-AuNC non conjugués incubés avec des lectines n'a été observé (Fichier supplémentaire 1 :Figure S7, C-D). Même si l'OVA de poulet natif contient un seul site de glycosylation lié à N (Asn-292) principalement substitué par des N-glycanes de type hybride et complexe à haute teneur en mannose ou moins abondants [43], cette modification du sucre n'est reconnue ni par STL ni par BSL-II. , probablement en raison de la présentation monovalente. Cela a confirmé la présence d'une interaction spécifique glucide-lectine entre G0 chimiquement introduit sur G0-OVA-AuNCs et STL/BSL-II et a exclu la liaison non spécifique des OVA-AuNCs aux lectines. Nous envisageons une application possible de ce système pour la détection de biomarqueurs de protéines liant les glucides. Néanmoins, la préparation de néoglycoprotéines présentant un nombre élevé de copies glycanes augmenterait l'avidité de la construction vers la lectine souhaitée améliorant la limite de détection [44].

Essais d'agglutination de lectine de G0-OVA-AuNCs (5/6). un Spectres de fluorescence représentatifs des surnageants des solutions OVA-G0 (5/6)-AuNCs après incubation avec BSL-II. b Représentation de F0/F contre des concentrations croissantes de BSL-II. c Spectres de fluorescence représentatifs des surnageants des solutions OVA-G0 (5/6)-AuNCs après incubation avec STL. d Représentation de F0/F contre des concentrations croissantes de STL. e Spectres de fluorescence représentatifs des surnageants d'OVA-G0 (5/6)-AuNCs après incubation avec AAL. f Image correspondant à l'incubation de G0-OVA-AuNCs (5/6) avec AAL et STL, sous illumination UV (365 nm). Après incubation avec STL, un précipité visible s'est formé. A droite :illustration schématique de la liaison entre les G0-OVA-AuNCs et la lectine végétale

Nous avons également étudié l'interaction de G0-OVA-AuNCs (5/6) avec STL en présence de milieux de croissance cellulaire pour discriminer l'effet possible des composants du milieu dans les interactions entre les glucides et les protéines. Les G0-OVA-AuNCs (5/6) ont été dissous dans du milieu de Dulbecco modifié d'Iscove (IMDM) complet complété avec du sérum de veau fœtal et incubés avec des quantités croissantes de STL ; les solutions résultantes ont été analysées par électrophorèse sur gel d'agarose. (Fichier supplémentaire 1 :Figure S8). La mobilité électrophorétique des G0-OVA-AuNCs (5/6) est maintenue à la fois dans l'eau et en milieu complexe. Néanmoins, en présence de quantités croissantes de STL, il y avait un déplacement dose-dépendant de G0-OVA-AuNCs (5/6) vers le pôle négatif mettant en évidence l'interaction protéine-hydrate de carbone même en présence de milieux cellulaires complexes. Cela indique que les interactions entre les glucides et les protéines G0-OVA-AuNCs (5/6) ne sont pas entravées par la présence de composants de média.

Le potentiel des clusters pour l'imagerie par fluorescence et les succès antérieurs avec le ciblage des DC par les néoglycoprotéines G0-OVA [21] nous ont encouragés à étudier les G0-OVA-AuNC dans l'absorption par les DC murines in vitro. Nous avons utilisé la microscopie confocale à fluorescence pour visualiser l'internalisation des auto-fluorescentes G0-OVA-AuNCs (3/4). Les DC spléniques ont été isolées de souris C57BL/6J et CD11c ⁺ population a été purifiée par tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) (Fichier supplémentaire 1 :Figure S9) et ensemencée sur des lamelles de verre recouvertes de poly-d-lysine pendant la nuit. Comme preuve de concept, les CD purifiées ont été incubées avec des G0-OVA-AuNC (3/4), lavées pour éliminer les matériaux non liés et fixées. Après 40 min d'incubation, des images de microscopie confocale à fluorescence ont été acquises (Fig. 6) et nous avons observé une forte fluorescence pour les cellules dendritiques incubées avec G0-OVA-AuNCs (3/4) démontrant leur internalisation efficace (Fig. 6a) et l'absence de fluorescence dans le contrôle négatif (CD11 ⁺ non stimulé cellules; Fichier supplémentaire 1 :Figure S9). L'internalisation des nanoclusters a été confirmée par l'empilement d'images DC uniques prises le long de leur Z -axe (z-stack) et par reconstruction d'une image 3D d'un seul DC pour visualiser l'émission de fluorescence provenant de l'intérieur de la cellule (Fig. 6b et Fichier complémentaire 1 :Figure S10).

Absorption de G0-OVA-AuNCs (3/4) par les DC murines mesurées par microscopie confocale. un Images représentatives de CD11c ⁺ cellules après incubation avec G0-OVA-AuNCs (3/4). b Image de pile en Z d'une seule cellule dendritique représentant l'absorption de G0-OVA-AuNC à l'intérieur de la cellule

En résumé, nous avons préparé et caractérisé des nanoclusters d'or protégés par des néoglycoprotéines qui ont été utilisés dans des expériences d'agglutination et dans des tests d'absorption des DC. Sur l'exemple de la détection de lectines végétales spécifiques, nous avons démontré l'utilité des G0-OVA-AuNCs pour l'analyse des interactions glucides-protéines. Nous avons également montré l'imagerie in vitro des cellules dendritiques par microscopie à fluorescence. Cependant, d'autres expériences doivent être entreprises pour d'abord mieux comprendre le rôle du glycane dans l'absorption des nanoclusters par les CD (par exemple, en suivant la localisation des nanoclusters dans les compartiments cellulaires) et deuxièmement, pour étudier leur bio- et cytocompatibilité. Sur la base de nos résultats précédents décrivant les propriétés de ciblage du glycane G0 et l'augmentation de l'absorption de G0-OVA par les CD par rapport à l'OVA non conjugué, nous pensons que les G0-OVA-AuNC pourraient devenir une alternative intéressante aux néoglycoprotéines marquées par fluorescence.

Conclusions

En conclusion, dans cette étude initiale, nous présentons la première synthèse de nanoclusters d'or protégés par des néoglycoprotéines et l'évaluation de leurs propriétés physiques et optiques par rapport aux clusters de protéines non conjuguées. Nous avons confirmé l'accessibilité du sucre G0 sur les AuNC dans les tests d'agglutination par des interactions spécifiques avec les lectines végétales, ce qui a en outre mis en évidence l'importance d'une densité de glycane minimale pour une activité de réticulation efficace des lectines. En guise de preuve de concept, nous avons également démontré la pertinence des G0-OVA-AuNC dans l'imagerie de modèles de DC murins.

Nous pensons que les AuNC auto-fluorescentes fonctionnalisées par des néoglycoprotéines pourraient devenir des outils attrayants permettant l'analyse et les applications des interactions glucides-protéines. Sur la base de leurs propriétés physiques et chimiques uniques, telles que les grands décalages de Stokes, la solubilité dans l'eau ou la stabilité du pH, les G0-OVA-AuNC pourraient devenir une alternative aux marqueurs de colorants organiques et être utilisées pour la visualisation des DC, les études d'absorption médiée par les glucides et les plantes détection de lectine. Enfin, en utilisant un support immunogène comme l'OVA pour la fixation des glycanes, les nanoclusters d'or fonctionnalisés par des néoglycoprotéines pourraient non seulement permettre des études approfondies de l'absorption, du traitement et de la présentation de l'antigène, mais aussi à l'avenir, pourraient trouver une application en tant que thérapie fluorescente ou molécules adjuvantes.

Méthodes/Expérimental

Matériaux

Toutes les solutions ont été préparées dans de l'eau nanopure (18 MΩ cm) à partir d'un système de purification d'eau Diamond UV (Branstead International, IA, Madrid, Espagne). Toute la verrerie utilisée dans la préparation des AuNCs a été préalablement lavée avec une solution d'eau régale (HNO₃ :HCl, 1:3, v /v ) et abondamment rincé à l'eau nanopure. Le chlorure d'or (III) trihydraté, l'hydroxyde de sodium et la triéthylamine ont été achetés auprès de Sigma Aldrich. L'ovalbumine sans LPS a été achetée chez Hyglos (Bernried, Allemagne). Le disuccinimidyl subérate (DSS) et le DMSO ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific. Le N-glycane G0 a été synthétisé chimiquement comme décrit précédemment [21].

Synthèse AuNCs. Procédure générale

À une solution agitée d'OVA ou de néoglycoprotéine (15 mg mL ⁻¹ ) dans de l'eau nanopure, une solution aqueuse 0,1 M de HAuCl₄ ·3H₂ O (4,2 mM, concentration finale) a été ajouté goutte à goutte. Le mélange résultant a été agité à température ambiante pendant 5 min et une solution aqueuse de NaOH 1 M (concentration finale de 150 mM) a été ajoutée goutte à goutte pour augmenter le pH du mélange. Les solutions résultantes ont été incubées à 100 °C pendant 6 min dans le réacteur à micro-ondes Biotage® Initiator. La dialyse des AuNC a été réalisée sur des cassettes de dialyse Slide-Z-lyser TM (10 K MWCO) de Thermo Fisher Scientific sur de l'eau nanopure.

Les spectres d'émission de fluorescence des OVA synthétisés et des AuNC protégés par des néoglycoprotéines ont été mesurés à l'aide de plaques noires en polystyrène à 96 puits Nunc™, sur un lecteur Varioskan Flashmicroplate (Thermo Scientific) avec une longueur d'onde d'excitation à λ 350 nm fonctionnant avec un logiciel ScanIt.

L'électrophorèse sur gel d'agarose des OVA-AuNCs et de la protéine OVA a été réalisée dans un gel d'agarose à 0,75% à 80 V pendant 30 min. La visualisation des AuNC protégées par l'OVA a été réalisée sous irradiation de lumière UV (365 nm) et la protéine OVA a été colorée au bleu de Coomassie G-250.

L'imagerie MET a été réalisée sur un TEM à émission de champ JOEL JEM-2100F avec une tension d'accélération de 200 kV. Les solutions AuNCs ont été coulées par goutte sur des grilles TEM en cuivre recouvertes d'un support de carbone ultrafin (Ted Pella, Redding, USA). Le diamètre moyen du nanocluster d'or a été quantifié à l'aide d'ImageJ (Java).

Incubation de G0-OVA-AuNCs (5/6) avec des lectines végétales

Dix microlitres de G0-OVA-AuNCs (5/6) [0,2 mg mL ⁻¹ ] dans du tampon TSM (20 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ , 2 mM MgCl₂ , pH =7,4) ont été placés sur une plaque noire en polystyrène à 384 puits Nunc™. Ensuite, 10 μL d'Aleuria aurantia lectine (AAL), Solanum tuberosum de la lectine (STL) et de la lectine-II de Bandeiraea simplicifolia (BSL-II) dans du tampon TSM ont été ajoutées, ce qui a donné des concentrations finales en protéines de 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μM. Les solutions correspondantes ont été incubées pendant la nuit à l'obscurité sous agitation douce. Les solutions de protéines ont été centrifugées à 11 000 g pendant 1 h et les spectres d'émission de fluorescence des surnageants ont été enregistrés avec un lecteur de microplaques Varioskan Flash (Thermo Scientific) avec une longueur d'onde d'excitation à λ 350 nm. Pour observer la précipitation lors de la formation de complexes AuNCs-lectine, une expérience de contrôle a été réalisée. Ensuite, 10 μL de G0-OVA-AuNCs (5/6) [0,2 mg mL ⁻¹ ] a été incubée pendant 1 h avec 10 μL d'AAL et de STL [40 μM], suivie d'une centrifugation à 11 000 g (1 h). Les images ont été prises sous irradiation UV (365 nm).

Isolement des cellules dendritiques de la rate de souris

Les cellules dendritiques murines utilisées dans toutes les expériences ont été isolées de souris C57BL/6J élevées par Charles River (CIC biomaGUNE, San Sebastian, Espagne). Les protocoles d'expérimentation animale ont été approuvés par le comité d'éthique animale de CIC biomaGUNE et ont été menés conformément aux lignes directrices ARRIVE et aux Directives de l'Union européenne sur l'éthique et le bien-être animal. Les souris ont été maintenues dans des conditions de logement conventionnelles (22 ± 2 °C, 55 ± 10 % d'humidité et cycle jour/nuit de 12 h) et nourries avec un régime standard ad libitum. Les souris ont été anesthésiées avec 2,5 % d'isoflurane dans 100 % d'O₂ et euthanasié par dislocation cervicale.

Les rates ont été obtenues à partir de souris C57BL/6J (n = 3, femme, 27-28 semaines). Pour isoler les splénocytes, les rates ont été rincées avec du milieu de Dulbecco modifié d'Iscove (IMDM) additionné de 2 mM de l-glutamine, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 10 % de sérum de veau fœtal (FCS ; PAN Biotech). La suspension cellulaire a été maintenue au froid et filtrée à travers un tamis cellulaire de 40 μm pour éliminer les agrégats cellulaires. Après centrifugation (300 g, 5 min, 4 °C), les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 5 mL de tampon de lyse des érythrocytes fraîchement préparé (10 % 100 mM Tris pH 7,5 + 90 % 160 mM NH₄ Cl), mélangé doucement et incubé à température ambiante pendant 2 min. Les cellules ont été lavées deux fois dans du milieu IMDM complet et centrifugées avant remise en suspension dans du tampon MACS (PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA). Cellules dendritiques (CD11c ⁺ cellules) ont été isolées d'une suspension de cellules spléniques murines C57BL/6 par tri cellulaire activé magnétiquement à l'aide de CD11c ⁺ Microbilles (Miltenyi). Les cellules incubées avec des microbilles magnétiques ont été chargées sur une colonne MACS placée dans un champ magnétique. Les cellules non liées ont traversé la colonne, tout en restant CD11c ⁺ les cellules ont été lavées avec du tampon MACS et éluées de la colonne. Pour augmenter la pureté du courant continu, le CD11c ⁺ la purification des cellules a été répétée. La suspension cellulaire a été centrifugée, remise en suspension dans du milieu IMDM complet et comptée.

Acceptation des G0-OVA-AuNC (3/4) par les DC

CD11c ⁺ cellules de souris C57BL/6J (2 × 10 ⁶ cellules) ont été ensemencées sur des lamelles de verre recouvertes de poly-d-lysine pendant la nuit. G0-OVA-AuNCs (3/4) were added to cells (150 μg mL ⁻¹ ) and incubated for 40 min at 37 °C. After incubation, cells were carefully washed with cooled PBS and fixed with 3% paraformaldehyde at RT for 20 min. After washing with PBS and water, the cover-slips were mounted on slides using Vectashield® mounting medium. Fluorescent images were taken using the Zeiss LSM 510 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss) equipped with a UV laser (365 nm) and × 63 oil immersion objective.

Abréviations

AAL:

Aleuria aurantia lectin

AuNCs:

Gold nanoclusters

BSA :

Sérum albumine bovine

BSL-II:

Bandeiraea simplicifolia lectin-II

CD:

Circular dichroism

CLRs:

C-type lectin receptors

DCs:

Dendritic cells

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

DSS:

Disuccinimidyl suberate ester

FBS :

Sérum fœtal bovin

G0:

Biantennary N-glycan

G0-OVA-AuNCs:

Neoglycoprotein functionalized gold nanoclusters

HAuCl₄ ^. ₃ H₂ O:

Gold tetrachloroauric (III) acid

IMDM:

Iscove’s modified Dulbecco’s medium

IR :

Infrarouge

LOD :

Limite de détection

MACS:

Magnetic-activated cell separation

OVA:

Ovalbumin

QY :

Quantum yield

STL:

Solanum tuberosum lectin

TEM :

Microscopie électronique à transmission

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X