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Préparation et évaluation de nouvelles nanomicelles oligosaccharidiques chargées en acide stéarique g-chitosan

Résumé

Le but de cette étude était de préparer et de caractériser l'oligosaccharide d'acide stéarique-g-chitosane chargé d'émodine (CSO-SA/EMO) et d'évaluer son activité antitumorale in vitro. Dans cette étude, l'oligosaccharide acide stéarique-g-chitosane a été utilisé comme support et ses propriétés physico-chimiques ont été déterminées par différentes méthodes. Le comportement d'absorption cellulaire a été examiné à l'aide d'oligosaccharide d'acide stéarique-g-chitosane marqué au FITC. CSO-SA/EMO a été préparé par ultrasons et dialyse. La taille des particules, le potentiel de surface, l'efficacité de piégeage et le comportement de libération du médicament ont été étudiés in vitro. Les effets de CSO-SA/EMO sur les cellules cancéreuses gastriques ont été étudiés à l'aide du test MTT et de la cytométrie en flux. Les résultats ont montré que la taille des particules de CSO-SA/EMO était plus grande et que le potentiel était plus petit que celui de l'oligosaccharide acide stéarique-g-chitosane. L'absorption micellaire de 12 h par les cellules MGC803 et BGC823 était suffisante et les micelles ont pu s'accumuler abondamment sur les sites de lésions chez la souris, obtenant ainsi un bon ciblage passif de l'EPR. Les tests MTT et d'arrêt du cycle cellulaire ont montré une activité antitumorale améliorée par CSO-SA/EMO de manière significative contre les cellules MGC803 et BGC823 par rapport à celle de l'émodine libre. Le volume tumoral, la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine et le test de marquage d'extrémité de coupure dUTP de la désoxynucléotide terminale ont prouvé que CSO-SA/EMO avait un effet antitumoral significatif sur les tissus tumoraux in vivo. En conclusion, la méthode d'ultrasonication-dialyse a fourni une méthode simple et efficace pour préparer CSO-SA/EMO. L'administration d'émodine à l'aide d'un système micellaire a amélioré efficacement ses effets antitumoraux.

Introduction

L'émodine (EMO) est un dérivé naturel d'anthraquinone qui est extrait principalement d'herbes traditionnelles chinoises telles que la rhubarbe, le cuspidatum et le multiflorum. La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est largement utilisée dans la recherche clinique en raison de sa faible toxicité, de peu d'effets secondaires et de son faible coût [1].

Des études ont montré que l'EMO a une large activité pharmacologique, y compris des activités immunosuppressives, anticoquelucheuses, antihypertensives, anti-inflammatoires, antibactériennes et anticancéreuses. Il a été découvert que l'EMO inhibe la croissance des cellules cancéreuses [2,3,4] et régule les gènes associés pour contrôler l'apoptose des cellules tumorales, la tumorigenèse, la prolifération cellulaire, l'invasion et les métastases [5,6,7,8,9]. Des études ont montré que l'EMO peut inhiber diverses cellules cancéreuses, telles que les cellules d'adénocarcinome colorectal humain, les cellules d'hépatocarcinome, les cellules de leucémie lymphoïde [10] et le cancer de la langue humaine SCC-4 [11]. L'EMO peut inhiber la prolifération des cellules tumorales dans les cancers de l'estomac, du sein et de la prostate [7, 12]. Cependant, l'EMO ne présente aucun effet cytotoxique sur les cellules normales telles que les fibroblastes gingivaux humains normaux [13], les cellules épithéliales bronchiques humaines [14] et les cellules mammaires humaines [15]. Ceux-ci montrent que l'EMO présente une cytotoxicité sélective envers les cellules tumorales par rapport aux cellules normales.

Le chitosan, un polysaccharide naturel, est la forme désacétylée de la chitine. Ce polymère naturel a d'excellentes caractéristiques de solubilité dans l'eau, de biofonctionnalité, de compatibilité sanguine et de dégradabilité microbienne, et est connu pour ses diverses applications biomédicales. Nous avons dégradé le chitosane de haut poids moléculaire (450 kDa) à l'aide de chitosanase dans des conditions acides pour obtenir un oligosaccharide de chitosane de faible poids moléculaire (CSO, 18 kDa). Le CSO peut pénétrer fortement dans les membranes cellulaires [16] et l'acide stéarique (SA) peut pénétrer dans le noyau par la voie des glycoprotéines. Le CSO a été modifié de manière hydrophobe avec du SA en utilisant du carbodiimide (EDC) comme réactif de couplage pour synthétiser l'oligosaccharide d'acide stéarique amphipathique-g-chitosan (CSO-SA).

Bien que l'EMO ait une activité biologique étendue, sa structure anthraquinonique est peu soluble dans l'eau. Étant donné que les médicaments thérapeutiques sont transportés dans la circulation sanguine, leur solubilité affecte directement leur absorption et leur distribution. Les greffons CSO-SA peuvent s'auto-assembler dans une solution aqueuse pour former des nanomicelles hydrophobes à l'intérieur et hydrophiles à l'extérieur. Nous avons dispersé les nanomicelles de l'état rassemblé à l'aide d'une sonde à ultrasons. Parce que l'EMO et le CSO étaient tous deux hydrophobes, l'EMO était encapsulé au centre des micelles.

Plusieurs médicaments modèles sont appliqués à CSO-SA, ce qui nécessite le poids moléculaire, la structure et l'hydrophobie des médicaments modèles. Les études existantes incluent la curcumine [17], la doxorubicine [18], le stéarate de lamivudine [19] et l'oxaliplatine [20] qui peuvent améliorer considérablement les effets antitumoraux. Nous avons exploré les conditions de chargement optimales de CSO-SA/EMO. CSO-SA/EMO crée de nouvelles formes posologiques avec une solubilité et une efficacité d'utilisation plus élevées. CSO-SA/EMO peut fournir des idées pour sélectionner des médicaments modèles ou des supports, et l'application clinique des micelles.

Matériaux et méthodes expérimentaux

Matériaux expérimentaux

Des souris nudes mâles BALB/C+/nu ont été obtenues auprès du Zhejiang University Experimental Animal Center. Les lignées cellulaires de cancer gastrique à faible différenciation MGC803 et BGC823 ont été achetées auprès de la banque de cellules ATCC. Le milieu de culture RPMI-1640 et le FBS ont été obtenus auprès de Hangzhou Holly Leaf Biotechnology Company. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, acide trinitrobenzène sulfonique et pyrène ont été fournis par Sigma Aldrich. L'Université du Zhejiang a fourni CSO-SA. Les autres réactifs achetés étaient de qualité AR.

Détermination du CMC et 1 Spectres RMN H de CSO-SA

Dans ce rapport, la concentration micellaire critique (CMC) de CSO-SA a été déterminée par spectrophotométrie de fluorescence en utilisant du pyrène comme sonde fluorescente. Diverses concentrations de solution de CSO-SA ont été ajoutées à une solution de pyrène acétone, après quoi l'acétone a été évaporée pendant une nuit. Les spectres d'émission et les valeurs de pic du pyrène dans des solutions de CSO-SA de différentes concentrations ont été analysés par spectrophotométrie de fluorescence. Le premier pic (I 1 =374 nm) et le troisième pic (I 3 =385 nm) du spectre ont été enregistrés. Nous avons tracé la concentration logarithmique (Log C) en abscisse et I 1 /Je 3 en ordonnée et calculé la CMC pour les micelles polymères.

CSO et CSO-SA ont été dissous en D2 O à une concentration de 10 mg/ml. 1 Les spectres RMN H ont été enregistrés, comparés et analysés pour les pics caractéristiques CSO et CSO-SA.

Degré de substitution d'amine détecté

Le degré de substitution d'amine (SD %) a été détecté à l'aide de la méthode à l'acide trinitrobenzène sulfurique (TNBS).

Différentes concentrations de solutions CSO et CSO-SA ont été préparées, après quoi 4% de NaHCO3 et 0,1 % de TNBS ont été ajoutés successivement. Après incubation à 37°C pendant 2h dans un bain-marie, 2µmol/L d'acide chlorhydrique ont été ajoutés. L'absorbance a été mesurée à 344 nm par spectrophotométrie ultraviolet-visible après 30 min d'ultrasons. Une courbe standard a été tracée et le % SD de l'échantillon CSO-SA a été calculé.

Taille et potentiel des particules CSO-SA

Une solution de 1,0  mg/ml de CSO-SA a été préparée et les micelles ont été complètement dispersées avec une sonde de rupture de cellules à ultrasons. La granulométrie et le potentiel de CSO-SA ont été déterminés avec un analyseur de granulométrie et de potentiel de surface.

Acceptation cellulaire de CSO-SA

Les solutions FITC et CSO-SA ont été mélangées, agitées pendant une nuit et transférées dans un sac de dialyse. Le FITC n'ayant pas réagi et l'éthanol absolu ont été éliminés par dialyse avec de l'eau désionisée pendant 24 h. Enfin, une solution de CSO-SA (FITC-CSO-SA) marquée FITC avec une concentration de 1,0  mg/mL a été obtenue.

Des cellules MGC803 et BGC823 ont été utilisées comme cellules cibles pour examiner l'absorption cellulaire de CSO-SA. Sur la base du taux de prolifération cellulaire, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et cultivées pendant la nuit jusqu'à ce qu'elles deviennent complètement adhérentes. Quatre-vingt L de solution FITC-CSO-SA ont ensuite été ajoutés à un moment donné. Les cellules ont été incubées avec 10 μL de Hoechst 33342 (1 mg/mL) pendant 15 min pour colorer le noyau cellulaire. L'absorption de CSO-SA par FITC-CSO-SA a été détectée par microscopie confocale à balayage laser.

Répartition In Vivo de CSO-SA

La distribution de CSO-SA in vivo a été déterminée par coloration fluorescente DiR. La solution CSO-SA/DiR a été préparée par dialyse.

Des souris nude mâles de six semaines ont été utilisées comme modèle expérimental. Des souris nude ont été inoculées par voie sous-cutanée avec 1 × 10 8 /mL de cellules MGC803. CSO-SA/DiR a été administré par la veine caudale à un volume de cellules tumorales d'environ 200  mm 3 . Les souris ont ensuite été anesthésiées à des moments définis. La distribution chronométrée de CSO-SA/DiR in vivo a été enregistrée à l'aide d'un imageur de corps vivants pour petits animaux (plage de longueur d'onde, 580-700 nm, temps d'exposition 1000 ms).

Détection de la concentration EMO par HPLC

La concentration en EMO a été déterminée par HPLC. L'EMO a été appliqué à une colonne garnie Eclipse XDB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) avec une colonne de protection (4,6 × 10 mm, 5 μm). La température de la colonne a été fixée à 30°C, le débit était de 1,0 mL/min, la longueur d'onde de détection était de 254  nm et le volume d'injection était de 20 L. La phase mobile était du méthanol/0,1 % d'acide phosphorique (85:15, v/v). La concentration d'EMO a été tracée en abscisse et l'aire de pic en ordonnée. Des courbes standard d'EMO ont été tracées pour déterminer la plage linéaire optimale. Tous les échantillons injectés par HPLC ont été filtrés à travers un filtre organique de 0,45 μm pour protéger la colonne.

Préparation du CSO-SA/EMO

Dans cette étude, EMO a été encapsulé avec une sonde à ultrasons. Un rapport de formulation initial de 10 % (EMO :CSO-SA, p/p) a été utilisé comme point de départ. La solution d'EMO a été ajoutée lentement goutte à goutte à la solution micellaire dans un bain de glace. La sonde à ultrasons a ensuite été appliquée pendant 20 cycles (400 W, travail 2 s, arrêt 3 s).

Les micelles chargées de médicament ont été transférées dans un sac de dialyse (MWCO, 3,5 kDa) et dialysées contre de l'eau désionisée pendant 24 h pour éliminer l'éthanol du solvant. Le CSO-SA/EMO pur a été obtenu par centrifugation du dialysat pour éliminer l'EMO libre.

Propriétés de CSO-SA/EMO (Particle Diameter Potentiel, TEM, EE%)

La taille des particules et le potentiel de surface de CSO-SA/EMO ont été mesurés avec un analyseur de taille de particules et de potentiel de surface.

Une solution de 0,1 µg/ml de CSO-SA/EMO a été ajoutée goutte à goutte sur un fil de cuivre recouvert d'un film de carbone, colorée avec 2 % d'acide phosphotungstique et séchée. La morphologie et la taille des particules de CSO-SA/EMO ont été observées par microscopie électronique à transmission.

L'efficacité de piégeage (EE%) et la charge de médicament (DL%) de CSO-SA/EMO ont été détectées par extraction par solvant organique et HPLC. À un échantillon de 200 μL de solution micellaire CSO-SA/EMO, 1,8 mL de méthanol a été ajouté pour disperser les micelles et extraire le médicament. La concentration d'EMO a été mesurée en tant que CEMO . 400 L supplémentaires de solution micellaire CSO-SA/EMO ont été placés dans un tube à centrifuger à ultrafiltration et centrifugés (12 000 rpm, 5 min) pour obtenir le surnageant. Les EE% et DL% ont été calculés selon les formules suivantes :

$$ \mathrm{EE}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V/{M}_{\mathrm{EMO}}\times 100 \% $$$$ \mathrm{DL}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times \mathrm{V}/\left[\left( 10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V+{M}_{\mathrm{CSO}-\mathrm{SA}}\right]\times 100\% $$

C EMO est la concentration d'EMO en micelles, C est la concentration EMO des micelles chargées de médicament après centrifugation par ultrafiltration, V est le volume de micelle chargée de médicament soumise à la dialyse, M EMO est la quantité d'EMO administrée pendant le chargement du médicament, M OSC-SA est la masse de CSO-SA.

Évaluation de la libération de médicaments in vitro

La libération de médicament à partir de CSO-SA/EMO a été étudiée en utilisant du PBS (pH 7,2) comme milieu de libération. Un millilitre de solution micellaire chargée de médicament a été placé dans un sac de dialyse de 3,5 kDa scellé aux deux extrémités puis placé dans un tube contenant un milieu de libération approprié. Le sac de dialyse a été placé dans un agitateur à thermostat horizontal à 37°C. Des échantillons ont été prélevés à des moments définis et remplacés par le même volume de milieu de libération frais. Le contenu d'EMO dans les échantillons a été déterminé par HPLC et la quantité cumulée d'EMO libérée a été calculée.

Cytotoxicité de CSO-SA/EMO

Les taux de survie des cellules cancéreuses gastriques traitées avec CSO-SA/EMO, CSO-SA et EMO ont été détectés par dosage MTT. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une concentration d'environ 10 5 /ml. CSO-SA/EMO, CSO-SA et EMO ont été ajoutés à différentes concentrations. Après incubation pendant différentes périodes, 20 μL de solution de travail MTT ont été ajoutés. Après 4 h d'incubation, 200 μL de DMSO ont été ajoutés et la densité optique (DO) de la solution à 570 nm a été mesurée par lecteur de microplaques.

Effet de CSO-SA/EMO sur le cycle cellulaire

Les cellules des deux lignées cellulaires ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits à une densité de 10 5 /mL. Après 12h de culture, CSO-SA, CSO-SA/EMO et EMO ont été ajoutés et incubés pendant 24h. Les cellules ont ensuite été digérées, collectées et lavées. 500 L de solution de coloration PI ont ensuite été ajoutés à chaque échantillon cellulaire, le culot cellulaire a été lentement remis en suspension et les cellules ont été incubées dans l'obscurité à 37 °C pendant 30 min. La fluorescence rouge a été détectée par cytomètre en flux à une longueur d'onde d'excitation de 488  nm. Le contenu en ADN a été analysé par le logiciel FlowJo.

Effets antitumoraux de CSO-SA/EMO évalués par des analyses in vivo et histologiques

Les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux directives du comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université du Zhejiang. Cellules MGC803 (1 × 10 6 ) ont été injectés par voie sous-cutanée dans le flanc antérieur droit de souris nude mâles âgées de 5 à 6 semaines. On a laissé les tumeurs croître jusqu'à un diamètre d'environ 5 µm. À ce stade, les souris ont été réparties au hasard en un groupe témoin, un groupe d'injection EMO et un groupe d'injection CSO-SA/EMO, avec 3 animaux dans chaque groupe. Toutes les souris ont reçu une injection intraveineuse des réactifs pertinents via la veine caudale une fois par jour pendant 2 semaines. Un pied à coulisse électronique a été utilisé pour mesurer les diamètres long (a) et court (b) de la tumeur (b). Le volume tumoral a été calculé selon la formule V =a × b 2 /2. Le poids corporel de chaque souris a été enregistré, après quoi les tumeurs ont été recueillies pour une analyse histologique. Le taux d'inhibition tumorale a été déterminé dans les tissus tumoraux après coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE). Le marquage terminal de la désoxynucléotide transférase dUTP (TUNEL) a été effectué pour détecter l'apoptose cellulaire dans le tissu de l'iléon terminal à l'aide d'un kit de détection de mort cellulaire in situ conformément aux instructions du fabricant.

Résultats et discussion

CMC et 1 Spectres RMN H de CSO-SA

Les polymères amphiphiles s'auto-assemblent en micelles en milieu hydrophile. Une CMC inférieure a entraîné une plus grande formation de micelles. Cela a été bénéfique pour le maintien de la structure des micelles après administration intraveineuse. Lorsque CSO-SA formait des micelles, la sonde fluorescente du pyrène pouvait facilement pénétrer dans le noyau hydrophobe des micelles, augmentant l'intensité de fluorescence du pyrène chargé, ce qui augmentait l'intensité du spectre d'émission. À ce stade, Je 3 augmenté beaucoup plus rapidement que I 1 , ainsi, le Je 1 /Je 3 rapport d'intensité de fluorescence a diminué brusquement. Un point de rupture significatif a pu être observé dans le I 1 /Je 3 valeurs du graphique et du Log C (Fig. 1). Les calculs du point d'inflexion ont montré que la CMC était de 179,02 µg/mL. Plus la CMC est petite, plus la capacité à former des micelles est forte et plus la résistance à la dilution est forte, ce qui améliore la protection de la structure des micelles après l'administration intraveineuse.

Variation du rapport d'intensité de fluorescence (I 1 /Je 3 ) versus concentration logarithmique de CSO-SA

L'EDC a été utilisé comme agent de couplage de réticulation pour réagir avec le groupe carboxyle de SA et former le dérivé intermédiaire actif -OO-acyl isourée. Celui-ci peut réagir avec le groupe amine primaire du CSO pour former une liaison amide. La structure de CSO-SA a été déterminée et confirmée sur la base du spectre de protons de résonance magnétique nucléaire. 1 RMN H (400 MHZ, D2 O) 1,06 (m, CH2), 1,02 (m, CH3) correspondent respectivement au proton de méthylène et au proton de méthyle de SA.

Degrés de substitution du groupe Amino

Le SD% de CSO-SA est le pourcentage de groupes amino substitués par l'acide stéarique sur le chitosane. Le TNBS a réagi avec des groupes amino libres sur le chitosane et a formé des dérivés de trinitrobenzène avec une absorption UV à 344  nm. La courbe standard du dérivé trinitrobenzène du chitosane a été déterminée par absorption UV à 344 nm. Le SD% de CSO-SA a été calculé comme étant de 9,3 ± 8 %. Cela a confirmé que CSO et SA avaient été liés avec succès sur la base de leur ratio de greffe.

CSO-SA, CSO-SA/EMO Taille des particules et potentiel

Le tableau 1 montre que la moyenne Z de CSO-SA était de 139,3 ± 2,2  nm. Le PDI était de 0,179 ± 0,03 indiquant une dispersion relativement uniforme. Par rapport à CSO-SA, la moyenne Z et le PDI de CSO-SA/EMO ont augmenté. Après le chargement d'EMO, la charge positive de surface de CSO-SA/EMO était supérieure à celle de CSO-SA.

Captation cellulaire

Le FITC n'a pas affecté les propriétés physico-chimiques du CSO-SA. Nous avons obtenu FITC-CSO-SA en greffant de la fluorescéine FITC dans CSO-SA. Après coloration des cellules avec Hoechst 33342, l'absorption des cellules FITC-CSO-SA a été observée en utilisant une microscopie confocale à balayage laser. Nous avons constaté que l'absorption de MGC803 augmentait progressivement avec le temps et que la fluorescence FITC augmentait progressivement. L'absorption micellaire de BGC823 était similaire à MGC803 d'une manière dépendante du temps. FITC-CSO-SA avait une bonne capacité de pénétration cellulaire et était distribué uniformément dans le cytoplasme des cellules cancéreuses gastriques (Fig. 2).

Absorption cellulaire in vitro dépendante du temps des micelles CSO-SA dans MGC803 (a ) et BGC823 (b ) cellules pour 1, 4, 8, 12 h, respectivement (bleu, Hoechst 33342 ; vert, FITC ; barre d'échelle =50  μm)

Distribution de CSO-SA In Vivo

La technologie d'imagerie proche infrarouge (NIR) est avantageuse pour pénétrer les biomatériaux et les tissus. Après l'injection de CSO-SA/DiR dans la veine caudale de souris nude, la distribution de CSO-SA/DiR a été observée et enregistrée à différents moments à l'aide d'un imageur corporel vivant de petit animal. Comme le montre la figure 3, la distribution de CSO-SA/DiR était similaire à celle des autres micelles à 4 h après l'injection dans la veine caudale et était principalement distribuée dans le foie, la rate et les tissus tumoraux. La distribution des nanomicelles dans la tumeur a augmenté progressivement en intensité avec l'augmentation du temps. Cela a indiqué que le greffon CSO-SA avait une bonne capacité de ciblage passif principalement en raison de l'effet EPR des nanomicelles (Fig. 3).

Image du corps entier de CSO-SA/DiR à différents moments après i.v. injection

Préparation du CSO-SA/EMO

L'influence des différents environnements de pH sur le chargement des médicaments

Nous avons préparé une solution de CSO-SA et ajusté le pH du CSO-SA pour étudier l'effet du pH sur la charge de médicament. Comme le montre la figure 4, CSO-SA avait une bonne capacité de charge médicamenteuse et présentait une tendance parabolique dans la plage de pH 6,4 à 6,8. Le niveau le plus élevé de charge médicamenteuse a été observé à pH 6,6, ce qui fait de cette valeur le pH optimal pour la charge médicamenteuse (Fig. 4).

Effets de différentes valeurs de pH des greffons CSO-SA sur la charge médicamenteuse. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD (n =3)

Efficacité d'encapsulation, TEM et chargement de médicament

CSO-SA s'auto-assemble en micelles nanocomposites shell-core. Les fragments hydrophobes forment spontanément des structures centrales hydrophobes pour repousser les milieux hydrophiles. Cette structure fournit un véhicule clé pour le chargement du médicament car l'EMO peut facilement être encapsulé dans le noyau hydrophobe en raison de sa structure hydrophobe. Nous avons étudié l'effet de CSO-SA sur la capacité de charge d'EMO en faisant varier le dosage d'EMO. Comme le montre la figure 5, avec l'augmentation de la dose d'EMO, la quantité de charge de médicament augmente. Le taux de chargement de CSO-SA a atteint 21,16% lorsque le ratio était de 30% (Fig. 5).

L'influence de différents ratios d'EMO et de CSO-SA (5-30%) sur les charges de médicaments. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD (n =3)

CSO-SA/EMO a été agrandi 30 000 fois avec un microscope électronique à transmission. La forme et la taille des nanomicelles ont été observées et enregistrées.

Libération EMO de CSO-SA/EMO

La solution micellaire chargée de médicament a été ajoutée à un sac de dialyse de 3,5 kDa avec du PBS (pH 7,2) utilisé comme milieu de libération. Chaque fois qu'un échantillon était prélevé, il était remplacé par le même volume de milieu de libération frais.

La concentration d'EMO à différents moments a été déterminée par HPLC, après quoi le pourcentage de libération cumulé a été calculé. Comme le montre la figure 6, CSO-SA/EMO a présenté un effet de libération prolongée significatif par rapport à l'EMO libre. Ces résultats montrent que le pourcentage de libération d'EMO libre était de 38,4 % à 0,5 h tandis que le pourcentage de libération d'EMO de CSO-SA/EMO était d'environ 6,6 %. A 4 h, le pourcentage de libération d'EMO libre était de 83,7% et le pourcentage de libération de CSO-SA/EMO était d'environ 32,5%. En 72 h, la libération d'EMO libre a atteint 97,2% tandis que la libération d'EMO de CSO-SA/EMO était de 78,4%. L'EMO a été libérée des micelles chargées de médicament CSO-SA/EMO de deux manières principales :par dissociation de l'EMO du noyau micellaire et par pénétration du noyau de la micelle dans le milieu de libération.

Profil de libération EMO de CSO-SA/EMO sur 72 h. Les barres d'erreur dans le graphique représentent les écarts types (n =3)

Toxicité de CSO-SA/EMO pour les cellules cancéreuses gastriques

Le test MTT est une méthode standard pour détecter la viabilité cellulaire. La cytotoxicité de l'EMO libre, du CSO-SA et du CSO-SA/EMO vis-à-vis des cellules cancéreuses gastriques MGC803 et BGC823 a été mesurée à l'aide du test MTT. Il a montré que l'EMO et le CSO-SA/EMO pouvaient inhiber les cellules MGC803 et BGC823 d'une manière dépendante de la dose et du temps. Cependant, à la même concentration, CSO-SA/EMO a eu un effet inhibiteur plus élevé sur les cellules MGC803 et BGC823 par rapport à la solution d'EMO libre. L'IC50 les valeurs (tableau 2) d'EMO et de CSO-SA/EMO pour les cellules cancéreuses gastriques ont été calculées. L'IC50 de CSO-SA/EMO était significativement inférieur à celui de EMO à chaque instant (24 h, 48 h, 72 h). L'IC50 Les valeurs de CSO-SA ont montré que CSO-SA était un vecteur biologique sûr avec peu de toxicité biologique, ce qui a confirmé que la cytotoxicité de CSO-SA/EMO était causée par EMO (Fig. 7).

Viabilité cellulaire des cellules cancéreuses gastriques MGC803 et BGC823 traitées avec CSO-SA, EMO et CSO-SA/EMO pendant 24h, 48h et 72h. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD (n =3)

Le tableau 2 et la figure 7 ont montré que la cytotoxicité du système d'administration de médicament CSO-SA/EMO était significativement plus élevée que celle de l'EMO libre. Cependant, lorsque la libération de CSO-SA/EMO et d'EMO libre dans un environnement in vivo a été simulée, la libération d'EMO libre a atteint 38,4 % à 0,5 h alors que la libération de CSO-SA/EMO n'était que de 6,6 %. Dans l'ensemble, la concentration d'EMO libre était plus élevée que celle de CSO-SA/EMO à chaque instant.

Ce phénomène s'explique facilement. Bien que CSO-SA/EMO libère l'EMO relativement lentement, l'effet antitumoral de CSO-SA/EMO ne ralentit pas ou ne diminue pas. De nombreuses études ont montré que les systèmes d'administration de nanomédicaments peuvent améliorer l'activité antitumorale des médicaments de chimiothérapie [21].

Premièrement, bien que l'EMO libre présente une poussée d'activité initiale, l'EMO ne peut pas être absorbé efficacement par les cellules tandis que CSO-SA a considérablement accéléré l'absorption cellulaire par endocytose ou phagocytose.

Deuxièmement, lorsque CSO-SA/EMO se rapproche des membranes cellulaires, l'interaction entre les nanoparticules et les membranes cellulaires peut affecter la structure et les propriétés des nanomicelles ainsi que la fonction des macromolécules biologiques telles que les canaux ioniques. Par conséquent, la fixation de CSO-SA/EMO aux membranes cellulaires n'entraîne pas une simple adsorption physique mais peut modifier l'équilibre dynamique de la cellule et ainsi favoriser davantage la cytotoxicité de CSO-SA/EMO.

Enfin, l'EMO libre a une structure anthraquinonique hydrophobe entraînant une mauvaise distribution dans le sang. Le système d'administration de médicaments CSO-SA/EMO augmente la solubilité de l'EMO et améliore la dissolution conduisant à une concentration moléculaire plus élevée dans les cellules environnantes.

Détection de l'arrêt du cycle cellulaire par le FCM

L'analyse du cycle cellulaire est un aspect important du traitement clinique des tumeurs malignes. L'application de médicaments spécifiques au cycle aux cellules tumorales pendant les périodes sensibles aux médicaments s'est avérée très efficace. Bien que les analogues du bromure d'éthidium ne puissent pas pénétrer dans les cellules normales, ils peuvent colorer les noyaux cellulaires en pénétrant les membranes cellulaires endommagées. L'ADN double brin intégré au PI produit une fluorescence rouge et l'intensité de la fluorescence est proportionnelle au niveau d'ADN double brin. La teneur en ADN a été déterminée par cytométrie en flux (FCM) après coloration de l'ADN avec PI. La distribution du cycle cellulaire et l'apoptose ont été analysées sur la base de la distribution du contenu en ADN.

Des études ont montré que l'EMO affecte la distribution du cycle cellulaire [11, 22]. L'analyse FCM a montré que CSO-SA/EMO et EMO pouvaient bloquer les cellules MGC803 et BGC823 dans la phase G2/M du cycle cellulaire.

Les cellules MGC803 ont été exposées à la même concentration (20 μM) de CSO-SA, d'EMO libre et de solution de CSO-SA/EMO pendant 24 h. Le pourcentage de cellules MGC803 en phase G2/M s'est avéré être de 8,95 %, 15,29 % et 23,12 % respectivement. Le pourcentage du groupe témoin était de 6,47 %. Les pourcentages de cellules BGC823 dans G2/M traitées avec 20 M de CSO-SA, d'EMO libre ou de CSO-SA/EMO dans les mêmes conditions étaient respectivement de 14,25%, 16,79 % et 35,71 %, ce qui était des valeurs plus élevées que dans le groupe témoin. (13,66%). Ces données ont montré que CSO-SA/EMO bloquait la phase G2/M des cellules MGC803 et BGC823 de manière plus efficace et significative que l'EMO libre à la même concentration. Le CSO-SA n'a montré aucune différence par rapport aux témoins (Fig. 8).

Distributions du cycle cellulaire des cellules MGC803 et BGC823 traitées avec EMO et CSO-SA/EMO pendant 24 h. t de l'étudiant test a été calculé et les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD (n =3), (*p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,001)

Effet antitumoral de CSO-SA/EMO In Vivo

Pour étudier plus avant l'effet antitumoral de CSO-SA/EMO, le taux d'inhibition tumorale et les niveaux d'apoptose cellulaire ont été évalués in vivo. Les résultats ont montré que CSO-SA/EMO et EMO avaient un effet inhibiteur notable sur la croissance tumorale (Fig. 9a). Le taux d'inhibition tumorale du groupe CSO-SA/EMO était trois fois supérieur à celui du groupe EMO (Fig. 9d). Le poids des souris dans chaque groupe n'a pas changé de manière significative (Fig. 9b). Cela a montré que CSO-SA/EMO et EMO étaient relativement sûrs. Les altérations morphologiques et l'apoptose dans les tissus tumoraux de chaque groupe ont montré que CSO-SA/EMO avait des effets antitumoraux significatifs (Fig. 9e, f).

Effet antitumoral de CSO-SA/EMO in vivo. un Forme tumorale dans chaque groupe. b Poids corporel de la souris dans chaque groupe. c Volume tumoral dans chaque groupe. d Taux d'inhibition tumorale. e Images représentatives du tissu tumoral coloré au TUNEL de chaque groupe (barre d'échelle =200  μm). f Images représentatives du tissu tumoral coloré à l'HE de chaque groupe (barre d'échelle =200  μm)

Conclusions

Dans cette étude, nous avons détecté la structure, la CMC, le SD%, la taille des particules et le potentiel de CSO-SA avec différentes méthodes. Les résultats prouvent que le CSO-SA amphiphile a bien fonctionné en tant que transporteur. Fluorescence intensity of gastric cancer cells showed CSO-SA had been taken up rapidly within 12 h. Nude mice were used as a model to study the distribution of CSO-SA within 72 h. Over time, CSO-SA distribution in lesion became more concentrated exhibiting a good passive targeting effect.

CSO-SA/EMO was prepared with ultrasound-dialysis method. CSO-SA had strong drug-loading capacity. When environment pH was set at 6.6, the level of drug loading reached 21.6% at a 30% formulation ratio. Compared with CSO-SA, CSO-SA/EMO had bigger particle size and zeta potential. The shape of CSO-SA/EMO could be recorded directly using TEM. The release of EMO from CSO-SA/EMO was 78.4% within 72 h, it indicated a smooth and continuous process in body. Considering the antitumor effect of CSO-SA/EMO compared with free EMO, we confirmed it with various experiments.

CSO-SA toxicity to gastric cancer cells was detected by MTT assay. The results showed that CSO-SA was a safe biological carrier. Compared with that of free EMO, CSO-SA/EMO significantly enhanced the antitumor activity against gastric cancer cells. MGC803 and BGC823 cell cycle could be arrested in the G2/M phase more effectively by CSO-SA/EMO. Tumor volume, HE staining, and TUNEL assay proved more significant antitumor effect of CSO-SA/EMO than free EMO.

Based on above results, CSO-SA is both biocompatible and safe carrier. CSO-SA/EMO in this study utilizes a new and effective dosage formulation for the treatment of cancer and exhibits good passive targeting effect in vivo.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié.

Abréviations

CSO-SA:

Chitosan oligosaccharide-stearic acid

EMO:

Emodin

FITC :

Isothiocyanate de fluorescéine

MTT :

Thiazolyl blue tetrazolium bromide

TEM :

Microscope électronique à transmission

1 H NMR:

Proton nuclear magnetic resonance

EPR:

Enhanced permeability and retention

TCM:

Traditional Chinese medicine

CMC :

Critical micelle concentration

Log C:

Logarithm of concentration


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