liposome anti-Epcam (Syl3c)-fonctionnalisé pour l'administration ciblée de doxorubicine :études antitumorales in vitro et in vivo chez des souris porteuses d'un carcinome du côlon C26

Introduction

Les systèmes d'administration de nano-médicaments (NDDS) d'une taille de 100 à 200 nm sont accumulés passivement dans le microenvironnement tumoral via un effet de perméabilité et de rétention améliorés (EPR). Cela se produit à travers la muqueuse endothéliale lâche et un drainage lymphatique faible. Cependant, des données récentes ont indiqué que seulement moins de 1% du médicament administré pouvait atteindre le site tumoral [1]. Le manque de capacité à pénétrer dans la matrice extracellulaire dense (MEC) de la tumeur, le retour du médicament libéré dans la circulation et l'hétérogénéité des tumeurs sont les raisons responsables de cet échec [2]. Différentes stratégies ont été utilisées pour améliorer l'accumulation tumorale de NDDS en utilisant des stimuli endogènes et exogènes [3]. Ces NDDS pourraient répondre aux stimuli exogènes tels que la lumière et auraient la capacité d'être utilisés en imagerie tumorale [4]. Il existe de nombreux nanomatériaux inorganiques différents qui ont la capacité d'être utilisés comme agents anticancéreux [5, 6]. Cependant, dans le cas des nanomatériaux inorganiques, une attention particulière doit être portée à leurs toxicités et à leur sécurité environnementale [7,8,9,10,11].

L'administration ciblée active est une approche importante qui aide les NDDS à administrer des agents thérapeutiques plus efficaces aux tumeurs et à minimiser l'exposition aux tissus non ciblés [12, 13]. Un agent de ciblage idéal pour une administration ciblée est une molécule qui a une affinité pour les protéines de surface cellulaire ou les récepteurs régulés à la hausse par des cellules ou des composants tissulaires particuliers [14].

La molécule d'adhésion des cellules épithéliales (EpCAM) est une glycoprotéine transmembranaire considérée comme un ligand candidat pour le ciblage actif. Des découvertes récentes ont indiqué que l'EpCAM a des cellules épithéliales saines normales à faible expression, tandis que dans les cellules cancéreuses, son expression devient plus élevée (jusqu'à 1000 fois) [15,16,17]. Au cours du développement du cancer, le modèle d'expression de l'EpCAM passe de la membrane basale et basolatérale dans l'épithélium normal à la surface apicale dans les cellules épithéliales tumorales [18]. Cette expression différentielle fait d'EpCAM un ligand très intéressant pour l'administration de médicaments qui pourrait améliorer l'index thérapeutique du médicament [19].

L'EpCAM est démontrée en tant que marqueur des cellules souches cancéreuses (CSC) ou des cellules initiatrices de tumeurs (TIC), dont l'expression dans le cancer est liée au mauvais pronostic [20]. Les CSC ou TIC sont des cellules qui ont un auto-renouvellement, la capacité de produire plus de cellules du même type, qui jouent un rôle clé dans le développement tumoral et les métastases [21]. La surexpression d'EpCAM a été rapportée dans le CSC de diverses tumeurs solides [22]. Récemment, les aptamères ont attiré beaucoup d'attention dans un large éventail de recherches et émergent comme des molécules potentiellement puissantes qui peuvent être utilisées dans les NDDS en tant que ligand de ciblage [23, 24]. Les aptamères sont des séquences d'oligonucléotides à base d'ADN ou d'ARN qui possèdent des structures secondaires et tertiaires ayant une affinité pour leurs cibles telles que les récepteurs de surface cellulaire [23, 24]. Les aptamères présentent également plusieurs avantages par rapport aux, par exemple, ils sont non immunogènes et ont un faible poids moléculaire (8-25 kDa) avec une stabilité chimique et thermique. De plus, leur synthèse et leurs modifications chimiques sont peu coûteuses et évolutives [25]. Le ciblage sélectif des NDDS par un aptamère spécifique anti-EpCAM pourrait être considéré comme une option de ciblage efficace pour administrer des agents chimiothérapeutiques dans le microenvironnement tumoral [19, 26]. À cet égard, différentes études ont montré que les nanosupports fonctionnalisés par aptamère anti-EpCAM pourraient améliorer efficacement l'administration de médicaments anticancéreux aux cellules tumorales [15, 27, 28].

Le but de cette étude est de développer un aptamère d'ADN anti-EpCAM (SYL3C)-nanoliposomes PEGylés chargés de doxorubicine (DOX) (ED-lip) comme modèle de NDDS. Une telle fonctionnalisation a été réalisée par chimie de couplage EDC/NHS entre le groupe amine de l'aptamère et le groupe carboxyle du DSPE-mPEG₂₀₀₀ , qui est post-inséré dans le liposome comme le montre la figure 1. La lèvre ED caractérisée pour la taille, le potentiel zêta et le pourcentage d'encapsulation de doxorubicine, le profil de libération et la cytotoxicité. Ensuite, nous avons évalué si ces lèvres ED pouvaient améliorer l'absorption cellulaire in vitro et administrer de la DOX à la tumeur avec un ciblage via des souris porteuses de tumeurs du carcinome du côlon C26.

Préparation de Caelyx® fonctionnalisé anti-EpCAM (ED-lip). un Liaison de l'aptamère anti-EpCAM au DSPE-mPEG₂₀₀₀ par liaison covalente des amines primaires (-NH2) de l'aptamère anti-EpCAM au groupe carboxyle (-COOH) du DSPE-mPEG₂₀₀₀ . b Méthode post-insertion pour la préparation de Caelyx® fonctionnalisé anti-EpCAM (ED-lip)

Résultat et discussion

Caelyx®, la doxorubicine liposomale pégylée est l'un des agents chimiothérapeutiques les plus largement utilisés et est la première nanoparticule approuvée par la FDA qui a été indiquée pour le traitement du cancer de l'ovaire, du sarcome de Kaposi lié au SIDA et du myélome multiple. Caelyx® a pénétré passivement le site tumoral par effet EPR [29]. Bien que Caelyx® ait considérablement amélioré la pharmacocinétique et la demi-vie de la DOX ; cependant, les principales limitations de Caelyx® sont une absorption cellulaire insuffisante et un faible taux de libération du médicament dans le site tumoral [29]. Ici, nous avons utilisé l'aptamère SYL3C comme ligand de ciblage pour fonctionnaliser la doxorubicine liposomale (lèvre ED) pour cibler la molécule EpCAM à la surface des cellules cancéreuses, ce qui permet l'administration de DOX à un site cible spécifique via le processus de ciblage actif.

Conjugaison DSPE-mPEG₂₀₀₀ à Aptamer

Dans la présente étude, nous avons utilisé la chimie de couplage EDC/NHS pour la conjugaison d'aptamères anti-EpCAM fonctionnalisés par amine au groupe carboxylique actif de DSPE-mPEG₂₀₀₀ -COOH. L'avantage de cette réaction de couplage utilisant la chimie de couplage EDC/NHS et la formation de la liaison amide est sa stabilité et la réduction des interactions non spécifiques entre les aptamères [30]. Les aptamères pourraient être modifiés avec un groupe amine primaire ou thiol et conjugués de manière covalente pour activer le groupe carboxyle ou pyrrole du maléimide, respectivement [31]. Des aptamères modifiés avec un groupe thiol ont été conjugués au groupe fonctionnel maléimide de DSPE-PEG₂₀₀₀ . Ensuite, DSPE-PEG₂₀₀₀ -aptamère post-inséré dans la structure des liposomes pour décorer la surface externe des liposomes [32]. Une limitation importante avec la chimie du maléimide thiol est que pendant le stockage, le groupe thiol des aptamères peut être affecté par l'oxydation et conduire à la formation d'une liaison disulfure (S-S) entre deux aptamères modifiés par le thiol. Ces aptamères dimères ne sont pas capables de participer à la réaction de conjugaison avec la fonction maléimide du DSPE-PEG₂₀₀₀ [30]. Par conséquent, l'utilisation de réactions EDC/NHS augmente les rendements de produit et améliore la méthode post-insertion.

L'aptamère présente certains avantages par rapport aux anticorps, notamment la facilité de synthèse et de mise à l'échelle, une faible toxicité systémique et un manque d'immunogénicité [33]. Ici, après conjugaison de l'aptamère au lipide, la méthode post-insertion a été recrutée pour fabriquer l'aptamère anti-EpCAM décoré Caelyx® (ED-lip). Généralement, la technique post-insertion est une méthode simple et efficace pour la fixation des aptamères à la surface des liposomes et a fourni un taux plus élevé d'incorporation d'aptamères dans les liposomes [34].

Nous avons utilisé un test de déplacement de mobilité par électrophorèse sur gel pour l'évaluation de la post-insertion de l'aptamère anti-EpCAM sur le liposome. Comme le montre la figure 2, les aptamères chargés négativement ont migré dans le gel et leur bande a été observée alors qu'il n'y a pas de bande homologue pour la formulation de la lèvre ED, car la lèvre ED est piégée dans la ligne de puits et ne peut pas se déplacer à travers le gel. Ces résultats ont indiqué que les micelles conjuguées à des aptamères ont été post-insérées avec succès dans la surface des liposomes.

Gel d'agarose-électrophorèse de la formulation ED-lip. Les échantillons sont chargés sur le gel d'agarose. La lumière UV a visualisé le gel. Les puits correspondant à l'échelle, à l'aptamère libre et aux aptamères conjugués PL sont indiqués. L'absence de bande correspondante dans le liposome-Aptamer a indiqué la confirmation post-insertion

Caractérisation physico-chimique de la lèvre ED

La caractérisation physico-chimique de Caelyx® et ED-lip a été démontrée dans le tableau 1. La taille et la charge des formulations préparées ont révélé que la modification de Caelyx® avec l'aptamère anti-EpCAM n'avait pas d'effet significatif sur la taille des particules (p> 0,05). La taille des liposomes avant l'insertion de l'aptamère (Caelyx®) était d'environ 96 nm avec un PDI de 0,11, après la post-insertion (ED-lip), la taille des liposomes a partiellement augmenté à 117 nm avec un PDI de 0,14 qui ont une taille souhaitable pour la livraison à tumeur. Les résultats d'études antérieures ont également indiqué que l'incorporation de ligands de ciblage entraîne une augmentation de la taille et du PDI des liposomes [35, 36]. De plus, le potentiel zêta de la lèvre ED (−19,25) est devenu plus négatif que Caelyx® (−12). Il a été montré que la conjugaison ARN-aptamère dans un liposome entraînait une diminution du potentiel zêta du liposome [37]. L'augmentation de la taille et du potentiel zêta négatif de la lèvre ED pourrait être la preuve d'une post-insertion réussie d'aptamères conjugués à la surface du liposome [38]. Ces résultats sont cohérents avec notre étude précédente qui indiquait la fixation de l'aptamère à la surface de Caelyx® entraînant une légère augmentation de la taille des particules et le potentiel zêta plus négatif dans l'aptamère fonctionnalisé Caelyx® [38, 39]. Cependant, l'efficacité de la post-insertion doit être testée en termes de temps et de température d'incubation pour atteindre un liposome post-inséré plus efficace avec une meilleure taille et un meilleur PDI. L'efficacité d'encapsulation du Caelyx® et de l'ED-lip était de 100 % (voir Tableau 1).

Le nombre d'aptamère post-inséré à la surface du liposome a été déterminé comme décrit [6]. La quantité totale de teneur en phospholipides de la formulation liposomale déterminée par dosage du phosphate était de 14 mM. Depuis, le nombre moyen de molécules lipidiques dans un liposome avec une taille moyenne de 100 nm est de 8 × 10 ⁴ le nombre de liposomes dans chaque millilitre est de près de 10 ¹⁴ [38]. Le poids moléculaire de l'aptamère était de g/mol. Le nombre de DSPE-mPEG₂₀₀₀ -aptamère a été déterminé sur la base de méthodes de dosage du phosphate dans lesquelles les moles de molécules de phosphate correspondent aux moles de molécules conjuguées. Sur la base de ces données, le nombre de molécules d'aptamère par ml de solution aliquote est de 10 ¹⁵ .

Profil de version DOX

L'insertion de micelles conjuguées à l'aptamère à la surface externe de Caelyx® peut affecter le profil de libération de la DOX. Par conséquent, nous avons évalué la libération de DOX forme ED-lip par rapport au Caelyx® dans 5 % de dextrose avec 50 % de FBS. Ce milieu pourrait mimer le comportement de libération des formulations dans le plasma [40]. La figure 3 a montré qu'il n'y a pas de différence significative dans la libération de DOX des formulations Caelyx® et ED-lip pendant 24 h d'étude et que seules des quantités négligeables de DOX ont été libérées. Ceci est cohérent avec nos études précédentes qui indiquaient que l'insertion d'aptamère à la surface du liposome n'affectait pas la stabilité de la membrane et le profil de libération de la DOX [38, 39]. Ceci est principalement dû à la stabilité de la formulation Caelyx® qui a été formulée à l'aide d'une méthode de chargement à distance pilotée par gradient de pH [41].

Étude de sortie. Profil de fuite de teneur en DOX du Caelyx® et ED-lip à 37 °C en présence de 50 % de FBS dans le dextrose pendant 24 h d'étude. Données représentées en moyenne ± écart type (SEM) (n =3)

Interaction cellulaire et absorption cellulaire par microscopie fluorescente

L'interaction cellulaire et l'absorption cellulaire des formulations liposomales ont été évaluées à 4 °C et 37 °C et ont été illustrées à la Fig. 4. L'évaluation de l'efficacité de ciblage de ED-lip a indiqué qu'il n'y avait pas de différences entre les intensités de fluorescence moyennes (MFI) de cellules CHO-K1 traitées avec Caelyx® et ED-lip à 4°C et 37°C (Fig. 4a, c). Cependant, les données ont démontré que la lèvre ED ciblée avait une absorption considérablement plus élevée par les cellules C26 par rapport à Caelyx® à 4 ° et 37 ° C (Fig. 4b, d) qui était statistiquement significative à 37 ° C (p <0,0001). Le ED-lip avait une absorption significative par rapport au Caelyx® (p <0,001). Ces résultats ont indiqué que la spécificité de cible améliorée par les lèvres ED en raison de l'aptamère anti-EpCAM a une plus grande affinité pour la lignée cellulaire C26 par rapport aux cellules CHO-K1. La DOX libre passe librement à travers la bicouche lipidique et pénètre dans la cellule, elle a donc l'absorption cellulaire la plus élevée parmi les formulations et, par conséquent, la cytotoxicité la plus élevée. Dans le cas de Caelyx®, la PEGylation limite le taux d'endocytose et entraîne une diminution de la cytotoxicité. Cependant, la présence d'aptamère anti-EpCAM à la surface du liposome (ED-lip) augmente le taux d'internalisation de la formulation dans les cellules et augmente sa cytotoxicité par rapport au Caelyx® [38]. Les données de la microscopie à fluorescence ont démontré que la différence entre l'absorption cellulaire de la lèvre ED et la DOX libre dans la lignée cellulaire C26 à 37 ° C n'était pas significative (Fig. 5). Cependant, la mise à l'échelle basée sur l'intensité de la DOX internalisée décrite dans le tableau 2 dans laquelle à la fois ED-lip et DOX ont montré des différences statistiquement significatives avec Caelyx® dans l'absorption cellulaire C26 (p <0,001). Bien que les cellules C26 expriment un faible niveau d'EpCAM à leur surface [42], les données de cette étude suggèrent que la présence d'aptamère anti-EpCAM pourrait augmenter le taux de processus d'internalisation des liposomes [43].

Interaction cellulaire et absorption cellulaire de formulations liposomales évaluées à 4 °C et 37 °C. un L'interaction cellulaire CHO-K1 des formulations à 4°C et 37°C. b L'interaction des formulations avec les cellules C26 à 4 °C et 37 °C. c Le graphique montrait le MFI moyen des formulations sur les cellules CHO-K1 et C26. Données représentées en moyenne ± écart type (SEM) (n =3). ****p <0,0001

Microscopie fluorescente. Les résultats de l'internalisation cellulaire de la DOX sur des lignées cellulaires C26 visualisés par microscopie à fluorescence. Cellules colorées au DAPI. La DOX libre et la lèvre ED ont toutes deux un niveau d'internalisation de la DOX plus élevé que le Caelyx®. Cellules inspectées sous un grossissement × 200

Étude de cytotoxicité

Les effets de cytotoxicité des formulations libres de DOX, Caelyx® et ED-lip sont indiqués sur la figure 6. Différentes concentrations de formulations utilisées pour traiter les cellules pendant 1, 3 et 6 h et laissées à incuber pendant les 72 h suivantes. Les données ont démontré que toutes les formulations ont des effets sur les cellules en fonction du temps et de la dose. La viabilité des cellules C26 traitées avec la formulation ED-lip a diminué par rapport aux cellules traitées au Caelyx®. Étant donné que les cellules CHO-K1, en tant que cellules négatives pour EpCAM, présentent une réponse inférieure aux lèvres ED par rapport aux cellules C26, il semble que l'aptamère anti-EpCAM augmente la délivrance spécifique de Caelyx® aux cellules ciblées. Ces résultats pourraient confirmer l'absorption cellulaire spécifique de la lèvre ED par les cellules C26. Ces résultats ont souligné l'importance de l'utilisation de l'administration ciblée de médicaments avec des agents de ciblage spécifiques pour l'administration sélective de médicaments aux cellules cibles tout en réduisant les effets secondaires du médicament en évitant les hors-cibles [44]. Comme indiqué précédemment, le ciblage actif de Caelyx® avec des ligands de ciblage spécifiques tels que l'aptamère et l'anticorps conduit à augmenter le ciblage actif de la tumeur et l'administration de médicaments spécifiques aux cellules cibles, ce qui à son tour a amélioré l'efficacité thérapeutique de la DOX [35, 39].

Effet de cytotoxicité in vitro (IC50) de ED-lip, Caelyx® et de la doxorubicine libre contre les cellules CHO et les cellules C26 après différents temps d'exposition. Données représentées en g/ml ± écart type (SEM) (n =3). *p <0,05, ***i>p <0,01, ****p <0,001, ****p <0,0001

Biodistribution et pharmacocinétique

Afin d'évaluer comment l'aptamère anti-EpCAM affecte la biodistribution de la DOX, nous avons injecté une dose de 10 mg/kg de ED-lip et de Caelyx® chez des souris porteuses de tumeurs sous-cutanées de cancer du côlon C26. La concentration plasmatique de DOX à 3, 12, 24, 48 et 72 h après l'injection avec Caelyx® et ED-lip est montrée sur la Fig. 7. Les résultats montrent que le comportement des concentrations plasmatiques de DOX dans les deux groupes était similaire et il n'y avait aucune différence significative entre les deux formulations. Comme le montre le tableau 3, la conjugaison de l'aptamère anti-EpCAM à la surface liposomale a légèrement diminué le demi-temps de circulation de 39,3 h à 34,2 h et la MRT de 47,6 à 42,9 h (voir tableau 3). Les paramètres pharmacocinétiques ont indiqué que la conjugaison de l'aptamère anti-EpCAM sur le liposome diminuait légèrement t_½ et MRT qui étaient cohérents avec les rapports précédents ont démontré que la conjugaison de l'aptamère sur la surface liposomale accélère la clairance des liposomes [38]. L'adsorption des protéines et l'élimination qui en résulte par le système phagocytaire mononucléaire (SMP) pourraient être à l'origine de l'accélération de la clairance sanguine des nanoparticules conjuguées à un ligand [45].

Niveau plasmatique de DOX. Les résultats de la concentration en fonction du temps de la quantité de DOX dans le sang à 3, 12, 24, 48 et 72 h après l'injection. Données représentées en moyenne ± écart type (SEM) (n =3)

Comme le montre la figure 8, les concentrations de DOX dans les principaux organes prélevés dans les groupes recevant Caelyx® et ED-lip ont été comparées. L'effet secondaire le plus important de la DOX libre est la cardiotoxicité qui Caelyx® diminue significativement le risque de cet effet indésirable [46]. La biodistribution des lèvres ED dans le foie, les poumons et la rate est significativement plus élevée que Caelyx® au temps 3 h. La présence de vaisseaux sanguins qui fuient et l'augmentation de la taille et du PDI de la lèvre ED après la post-insertion peuvent être les raisons d'une plus grande accumulation de la lèvre ED dans ces tissus dans les premiers temps. Il a été montré que l'augmentation de la taille des nanoparticules à 150 nm améliore l'accumulation de nanoparticules dans le foie, les poumons et la rate [47]. Parallèlement, les résultats de l'étude de biodistribution montrent clairement le mécanisme EPR dans l'accumulation de nanoparticules dans la tumeur. La figure 8 montre clairement que ED-lip et Caelyx® s'accumulent progressivement dans le site tumoral et atteignent un maximum vers 12 h, restent plateau jusqu'à 24 h puis diminuent à 48 et 72 h, progressivement. Il est intéressant à tous les instants de 3, 12, 24, 48 et 72 h; l'accumulation de ED-lip dans la tumeur est significativement plus importante que Caelyx®, ce qui pourrait être dû à l'efficacité du ciblage actif avec l'aptamère anti-EpCAM. Ces résultats ont indiqué que la fixation de l'aptamère sur la dose de surface des liposomes n'affectait pas la distribution de la DOX dans le rein. Par conséquent, il semble que les aptamères anti-EpCAM favorisent efficacement la pénétration des liposomes spécifiques à la tumeur, ce qui pourrait également être dû à la surexpression des molécules d'EpCAM dans les cellules endothéliales vasculaires tumorales [48]. Auparavant, il avait été indiqué que les aptamères anti-EpCAM pouvaient améliorer la pénétration tumorale dans les tumeurs xénogreffes [49]. Les CSC ou TIC sont également la cible d'une thérapie anti-EpCAM. L'administration d'aptamères anti-EpCAM comme ligand de ciblage afin de cibler EpCAM a montré des effets prometteurs dans le ciblage des CSC [22, 50]. Ici, il pourrait être suggéré qu'une partie de l'effet antitumoral efficace de la lèvre ED pourrait être due au ciblage réussi des CSC.

Biodistribution tissulaire. Les résultats de la biodistribution de la DOX dans le cœur, les tumeurs, le foie, les poumons, la rate et les reins. Les concentrations (μg/g) rapportées à 3, 12, 24, 48 et 72 h après l'injection pour chaque organe. Données représentées en moyenne ± écart type (SEM) (n =3). *p <0,05, ***i>p <0,01, ****p <0,001, ****p <0,0001

Activité anti-tumorale in Vivo

L'efficacité thérapeutique de la lèvre ED a été évaluée dans le modèle de tumeur de carcinome du côlon C26. La taille de la tumeur, le poids corporel et la survie ont été surveillés pendant près de 2 mois et les résultats sont résumés dans la figure 9 et le tableau 4. Les données indiquent que ED-lip n'a pas d'influence évidente sur le poids corporel des souris ainsi que Caelyx® (voir figure 9a ). Comme le montre la figure 9b, après injection intraveineuse de Caelyx® et de ED-lip, le taux de croissance tumorale est efficacement inhibé jusqu'au jour 30 après l'injection, et il n'y a pas de différence significative dans les groupes liposomaux. Après 30 jours après l'injection, le taux de croissance tumorale s'est accéléré, mais le taux de croissance dans les groupes recevant les médicaments était toujours plus lent que dans le groupe recevant du PBS. La différence entre le groupe Caelyx® et ED-lip n'était pas significative pendant 30 jours post-injection. Les résultats de survie sont représentés dans un graphique de Kaplan-Meier. La figure 9c montre que ED-lip améliore la courbe de survie par rapport au PBS ou au Caelyx®. Les principaux indicateurs de l'étude de survie ont été résumés dans le tableau 4. Les tumeurs chez trois souris du groupe ED-lip ont été complètement guéries, de sorte que le MST pour ce groupe n'est pas défini. Le traitement avec la lèvre ED a augmenté le TTE de 41,1 à 49,7 jours et a entraîné une activité anti-tumorale efficace avec 90,27 % de TGD avec une MST non définie en raison de l'ablation complète de la tumeur chez trois souris (voir le tableau 4).

Efficacité thérapeutique in vivo de formulations chez des souris femelles BALB/c porteuses d'un carcinome du côlon C26. Les souris ont reçu une injection IV d'une dose unique de formulations (10 mg/kg). un Représente le profil de pourcentage en poids respectif du BALB/c dans chaque groupe expérimental. b Représente le suivi de la taille de la tumeur chez les souris BALB/c. c Affiche le graphique de survie pour BALB/c. Données représentées en moyenne ± SD (n =5)

Les données sur la taille de la tumeur ont démontré que la lèvre ED pouvait considérablement inhiber la croissance tumorale. Les résultats de l'analyse de survie ont montré que le traitement par ED-lip augmentait la MST et la TTE. Le groupe recevant ED-lip avait un TGD% plus élevé et était plus efficace que Caelyx®. Nos résultats sont cohérents avec le niveau élevé de concentration de DOX dans le tissu tumoral du groupe traité par les lèvres ED. Par conséquent, la DOX liposomale conjuguée à un aptamère améliore leur pénétration et, par conséquent, augmente l'accumulation de médicament dans le site tumoral, ce qui à son tour entraîne une augmentation de l'efficacité de Caelyx® et un TGD% plus élevé dans les données de survie. Pris ensemble, ces résultats indiquent que les aptamères anti-EpCAM pourraient servir d'agent de ciblage important pour l'administration de médicaments.

Conclusion

Ici, nous avons Caelyx® fonctionnalisé en surface avec un aptamère anti-EpCAM (SYLC3) via post-insertion (ED-lip). La cytométrie en flux et la microscopie à fluorescence ont montré un niveau élevé d'absorption de DOX dans les cellules C26, ce qui indiquait que l'aptamère pouvait améliorer le taux de processus d'internalisation de la lèvre ED. Les données pharmacocinétiques ont indiqué que la post-insertion de DSPE-mPEG-EpCAM n'a pas modifié la pharmacocinétique de la DOX par rapport au Caelyx®. Cependant, la biodistribution tissulaire a montré que la plus grande accumulation tumorale de lèvre ED par rapport à Caelyx® même après 72 h post-injection. Nous avons démontré que ED-lip avait des effets thérapeutiques améliorés chez les souris porteuses de tumeurs C26. Les paramètres de survie améliorés chez les souris traitées avec ED-lip suggèrent que le liposome DOX ciblé par EpCAM est un vecteur prometteur de délivrance de médicaments pour le traitement des cancers et mérite une enquête plus approfondie.

Matériaux et méthodes

Matériaux

L'aptamère d'ADN 5'-amine-anti-EpCAM (séquence de 5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3′) (SYL3C) a été acheté auprès de BIONEER (société de biotechnologie, Daejeon, Corée du Sud). DSPE-mPEG₂₀₀₀ -COOH a été acheté chez Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Dowex®, 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), pénicilline streptomycine et Fluoroshield™ avec DAPI ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Le caelyx® disponible dans le commerce a été acheté auprès de Behestan Darou Company (Téhéran, Iran).

Conjugaison de DSPE-mPEG₂₀₀₀ à Aptamer

L'aptamère anti-EpCAM était lié au DSPE-mPEG₂₀₀₀ par liaison covalente des amines primaires (-NH2) de l'aptamère anti-EpCAM au groupe carboxyle (-COOH) du DSPE-mPEG₂₀₀₀ (Fig. 1). La conjugaison a été réalisée via la chimie de couplage EDC/NHS [51]. En bref, DSPE-mPEG₂₀₀₀ a été dispersé dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES) (pH 6,5) et EDC/NHS 400 mM d'EDC et 100 mM de NHS ont été ajoutés à la dispersion. La dispersion a permis d'agiter pendant 15 min afin d'activer les groupements carboxyle du lipide. Ensuite, l'aptamère anti-EpCAM a été ajouté à la dispersion et agité pendant les 2 heures suivantes à température ambiante dans l'obscurité. Le rapport molaire lipide:aptamère anti-EpCAM était de 1:1 et le rapport molaire EDC/NHS était 10 fois supérieur au lipide.

Modification de Caelyx® avec DSPE-mPEG-Anti-EpCAM Aptamer

ED-lip a été synthétisé par la méthode de post-insertion. Afin d'effectuer la post-insertion, des micelles d'aptamère DSPE-mPEG-anti-EpCAM ont été ajoutées à 1 ml de caelyx® pendant 30 min à 60°C. Les quantités d'aptamère DSPE-mPEG-EpCAM ont été déterminées selon le dosage du phosphate de Bartlett [52]. Basé sur le nombre approximatif de liposomes par millilitre de caelyx® qui est d'environ 10 ¹⁴ , le volume de DSPE-mPEG-anti-EpCAM a été ajusté pour atteindre 10 aptamères par liposome [36]. Électrophorèse sur gel d'agarose utilisée pour confirmer la post-insertion [39].

Caractérisation physico-chimique

La taille des particules, l'indice de polydispersité (PDI) et la charge de surface ont été déterminés par un instrument de diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Nano-ZS; Malvern, Royaume-Uni). Afin d'éliminer la DOX libre, les liposomes ont été mélangés avec de la résine Dowex® et tournés pendant 60 min et passés à travers des colonnes Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories Inc.) pour éliminer le Dowex® [53]. Les quantités de DOX dans les formulations liposomales ont été déterminées à l'aide du spectrophotomètre à fluorescence LS-45 (Perkin-Elmer, Royaume-Uni), (excitation :émission 485 : 590 nm).

Étude de publication

Afin d'évaluer la libération de DOX, 1 ml de formulation ajouté aux 9 ml de dextrose (avec 50 % de sérum bovin foetal (FBS)) et à certains intervalles de temps (0, 1, 2, 4, 6, 12 et 24 h), des échantillons ont été prélevés. Après avoir éliminé la DOX libre avec la résine Dowex®, les quantités de médicament restées dans les liposomes ont été déterminées par spectrophotomètre à fluorescence et le pourcentage de libération a été calculé [39].

Culture cellulaire

Des lignées cellulaires de carcinome du côlon C26 et d'ovaire de hamster chinois (CHO-K1) ont été achetées auprès de l'Institut Pasteur d'Iran. Les lignées cellulaires ont été cultivées dans du milieu RPMI1640 supplémenté avec 10 % de FBS obtenu auprès de Gibco (Thermos Fisher Scientific, USA) et 100 UI/ml de pénicilline, et 100 mg/ml de streptomycine. Les cellules ont été incubées à 37 ^° C avec 5% de CO₂ et 95 % d'atmosphère humidifiée à l'air.

Essai d'interaction cellulaire et d'absorption cellulaire

L'interaction cellulaire et l'absorption cellulaire des formulations ont été évaluées à 4 °C et 37 °C, respectivement. Deux lignées cellulaires, CHO-K1 et C26, ont été sélectionnées dans ce test. The cells seeded in each well of 12-well plates (2.5 × 10 ⁵ per well). After overnight incubation in 37 °C, treatments added to the cells and plates were placed at 4 °C and 37 °C and incubate for another 3 h. Then cells washed with PBS, and trypsinized. The fluorescence intensity for DOX was determined using flow cytometry (BD FACSCalibur cytometer). The data were analyzed with FlowJo version 7.0 software.

Fluorescent Microscopy Evaluation

The number of 1 × 10 ⁶ cells per well C26 Cells were seeded into 6-well plates in which sterile microscopic cover glass were already inserted. After overnight incubation in 37 °C and 5% humidity, cells were treated with free DOX, Caelyx® and ED-lip for 24 h for complete cell uptake [54]. Then cells washed with PBS and fixed with 4% formaldehyde. Cover glasses stained with Fluoroshield™ with DAPI and were mounted on the glass slides. Treatments were performed in triplicate. From each slide, six zones were selected under × 200 magnification field. Intrinsic fluorescent of DOX was used for evaluation of drug cell uptake. Scaling was performed based on the percentages of cells which shown DOX cell uptake in each microscopic filed:

1:0–20%, 2:20–40%, 3:40–60%, 4:60–80%, and 5:80–100%

Evaluation of Cytotoxicity

The IC50 values of free DOX, caelyx®, and ED-lip were determined by MTT assay. In order to do this, CHO-K1 and C26 cells were seeded at density of 5 × 10 ³ cells per well in 96-well plates at 37 °C. After overnight incubation liposomal formulations and free DOX solution were serially diluted in FBS-free medium and added to cell cultures and incubated 1, 3, and 6 h at 37 °C. Then, cells were washed and allowed to incubate 72 h. The optical densities (ODs) were measured using a spectrometric absorbance of 570 nm against a background of 630 nm on Stat-Fax 2100 microplate reader (Awareness Technology Inc. USA). Then the IC50 values were calculated.

Animal Study

Female BALB/c mice (4–6 weeks, 18–20 g) were kept in separate cages at 22 ± 2 °C and maintained on standard pellet diet and water ad libitum. Intraperitoneal (i.p) injection of ketamine and xylazine (100 mg/kg ketamine and 10 mg/kg xylazine) used to anesthetize the animals [55]. The number of 3 × 10 ⁵ C26 cells per mouse in 60 μl PBS injected at the right flank, subcutaneously. Two weeks after inoculation when tumor sizes grew about 5 mm ³ , mice were randomly divided into 3 groups (n =3 for biodistribution and n =5 for antitumor study mice per group). All of the experimental protocols were approved by the Mashhad University of Medical Sciences committee for animal ethics and were performed according to the international rules considering the animal rights.

Biodistribution and Pharmacokinetic Studies

Fourteen days after tumor inoculation, mice were treated with dose of 10 mg/kg of caelyx® and ED-lip intravenously (i.v.) via the tail vain. Control group received 200 μl PBS solution. At certain time-intervals (3, 12, 24, 48, and 72 h) post-injection mice were euthanized and blood samples and tissue samples (liver, spleen, kidney, lung, heart, and tumor) were collected. Then, the concentration of doxorubicin in each sample measured based on fluorescent intensity of each samples using LS-45 fluorescence spectrophotometer (Perkin-Elmer, UK). Doxorubicin concentration of each sample was measured and non-compartmental analysis of the pharmacokinetic parameters were calculated from blood concentration vs. time profiles. Then the parameters including under the concentration-time curve (AUC) and area under the first moment curve (AUMC), half-life (t _1/2 ), volume of distribution (V _d ), C _max , T _max,, mean residence time (MRT), and clearance (Cl) were calculated.

In Vivo Antitumor Activity

In order to evaluate antitumor activity, 10 days after tumor inoculation, mice with palpable tumor size were received single i.v. dose of 10 mg/kg Caelyx® and ED-lip. PBS injected in mice which considered as negative control. The parameters including time to reach the endpoint (TTE), percentage of tumor growth delay (TGD), median survival time (MST), and survival were determined. During the study, mice were observed for health and body weight changes. The tumor volume was also measured using a digital caliper and calculated as follows:

Considering ethical aspects, mice were removed in case tumor growth was> 1000 mm ³ , or> 20% weight loss or sign of weakness was observed.

Statistical Analysis

Data were analyzed using GraphPad Prism 6.0 (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, USA). Data were demonstrated as mean ± SEM of at least three independent experiments. The t test was used in order to evaluate the results of release study, flow cytometry, and biodistribution of the formulations. ANOVA was employed to evaluate the results of fluorescent microcopy and tumor volumes. The Kaplan–Meier method used to calculate the survival parameters include TTE, MST and TGD%. P <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données étayant les conclusions de cet article sont incluses dans l'article.

Abréviations

EpCAM:

Epithelial cell adhesion molecule

NDDSs:

Nano drug delivery systems

DOX:

Doxorubicine

EPR :

Perméabilité et rétention améliorées

ECM:

Extra cellular matrix

CSC:

Cancer stem cell

TIC:

Tumor initiating cell

MFI:

Mean fluorescent intensities

MPS :

Système phagocytaire mononucléaire

EDC :

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PDI :

Indice de polydispersité

DLS :

Dynamic light scattering instrument

FBS :

Sérum fœtal bovin

OD :

Densité optique

AUC:

Area under the concentration-time curve

AUMC:

Area under the first moment curve

t _½ :

Half-life

V _d :

Volume of distribution

MRT :

Temps de séjour moyen

Cl:

Clearance

TTE:

Time to reach the endpoint

TGD:

Percentage of tumor growth delay

MST:

Median survival time

i.p.:

Intraperitoneally

i.v.:

Intravenously